1

C1. BIOLOGÍA MOLECULAR EN LOS ESTADOS DE

HIPERCOAGULABILIDAD
La trombina (T) es la enzima coagulante por excelencia, ya que
una vez formada actúa sobre el fibrinógeno para transformarlo en
fibrina, sobre los factores V y VIII activándolos y activando también
la vía intrínseca (FXI) , plaquetas y el factor XIII que produce la
estabilización de la malla de fibrina.
A su vez la trombina generada se une a la trombomodulina
endotelial (TM) y al receptor endotelial de la proteina C (EPCR) y
va activando un sistema de inhibidores fisiológicos de la
coagulación, el de la PC-PS que forma la proteína C activada
(APC) que inactiva los factores Va y VIIIa.

Figura 1
2

Figura 2: Cascada clásica

Figura 3: Activación del sistema inhibitorio de la proteína C por T.

 3

Inhibidores fisiológicos del mecanismo de coagulación

Pueden dividirse en dos grandes grupos: los pertenecientes al
mecanismo intrínseco y los del mecanismo extrínseco.
Dentro del primer grupo existen dos subdivisiones: los inhibidores
de serinoproteasas y los inhibidores de cofactores activados. El
principal inhibidor de serinoproteasas es la antitrombina, el mayor
inhibidor fisiológico de trombina y de FXa, que inhibe además a los
factores F XIIa, F XIa y F IXa. La inhibición se lleva a cabo a través
de la unión de la ATIII a moléculas de glicosaminoglicanos como
por ejemplo la heparina lo que aumenta unas 2.000 veces su
potencial inhibitorio sobre la trombina, inactivándola.

Figura 4

El cofactor II de heparina, otro inhibidor perteneciente al grupo,

produce inhibición selectiva de la trombina pero su acción es más
4

lenta que la de la ATIII. La α2-macroglobulina ejerce también

efecto inhibitorio directo sobre trombina, siendo la responsable del
25 % de la actividad antitrombínica plasmática. Otros inhibidores
son C1inhibidor y la α1antitripsina. Algunos inhibidores de
cofactores activados son la proteína C (PC) y la proteína S (PS) y
la inhibición de cofactores transcurre de la siguiente manera: la
trombina generada en la coagulación se une a la trombomodulina,
glicoproteína de la superficie endotelial formando un complejo
trombina-trombomodulina que activa a la PC; la APC, en
presencia de proteína S, su cofactor, fosfolípidos y Ca++ inhibe a
los factores Va y VIIIa. (Figura 3)

Existe una mutación puntual que provoca el cambio de

aminoácidos en la posicion 506 de la molécula de factor V y le
confiere resistencia a la inactivación por APC. Los pacientes
portadores de la misma tienen un mayor riesgo de padecer
fenómenos trombóticos.
Dentro de los inhibidores del mecanismo extrínseco el más
importante hasta el momento es el inhibidor de la vía del factor
tisular (TFPI), producido por el endotelio y secretado hacia la pared
del vaso, cuyo mecanismo inhibitorio se desarrolla sobre el complejo
FVIIa- Factor Tisular (FT).
 5

Figura 5. Inhibidores de la coagulación (Referencia Figura 2)

C1.1 TROMBOFILIA
Las trombosis venosas son una causa importante de
morbimortalidad y una patología de alta prevalencia. En Estados
Unidos cerca de 1 en 1.000 pacientes por año desarrolla trombosis
clínicamente aparente y se producen 250.000 hospitalizaciones
anualmente atribuibles a la enfermedad tromboembólica y su
complicación fatal, la embolia pulmonar, cobra 50.000 fallecidos/
año.
Ya han pasado casi 150 años desde que el patólogo alemán Virchow
planteó la Tríada de la Trombosis: estasia venosa, cambios en la
pared vascular y cambios en la composición de la sangre.
6

Esto último es la trombofilia o hipercoagulabilidad, un trastorno en

la hemostasia en el cual existe tendencia a desarrollar trombosis
patológicas.

En 1.965 Egeberg describió por primera vez una condición heredada

de trombofilia, el déficit de Antitrombina III. Posteriormente, en la
década de los 80 se describen los déficits de PC y PS y recién en
1.993, la resistencia a la proteína C activada.
En los últimos 15 años se ha progresado más en el estudio de la
trombofilia que en todos los períodos anteriores. Tal ha sido el
impacto de estos descubrimientos, tanto en trombofilia adquirida
como hereditaria, que ha cambiado considerablemente el manejo de
los pacientes con trombosis, sobre todo venosas.

Coagulación y principales mecanismos anticoagulantes

fisiológicos
La trombosis es resultante de múltiples factores que llevan
finalmente al desequilibrio entre los mecanismos protrombóticos y
los anticoagulantes. En muchos casos no basta la presencia de un
solo factor, sino que la suma de los factores de riesgo traspasa el
umbral y determina la formación del coágulo. Generalmente se da
una combinación entre circunstancias de riesgo externas y una
predisposición heredada o adquirida del sujeto a la trombosis.
Como vimos en la introducción, la coagulación es la consecuencia
final de la activación secuencial de diferentes serinoproteasas que
culmina con la formación del trombo en el sitio de lesión vascular.
 7

Anticoagulantes circulantes actúan para limitar la formación del

trombo, de los cuales cinco son los más importantes: la ATIII que
neutraliza la trombina; la PC que inactiva los factores Va y VIIIa; la
PS que es un cofactor necesario para la actividad de la PC; la
trombomodulina, una proteína de la superficie endotelial que se une
a la trombina para activar a la PC y el activador tisular del
plasminógeno que activa el plasminógeno a plasmina y promueve la
lisis del coágulo.
Analizando estos pasos podemos deducir que existen varias vías por
las cuales puede originarse un desbalance a favor de la trombosis.

Clasificación de los estados de hipercoagulabilidad

Clásicamente se ha diferenciado los estados de trombofilia en
primarios o hereditarios y secundarios o adquiridos. Si bien ésta es
una clasificación bastante simplista, es útil para categorizar las
causas de trombosis y dirigir el estudio. Existen otras clasificaciones:
según la potencia trombogénica, es decir incidencia de trombosis en
pacientes portadores del estado de hipercoagulabilidad; según la
predominancia venosa o arterial o ambas y según el sitio en el cual
ocurre la trombosis.

C1.1.1Trombofilia primaria
 Déficit de Antitrombina III
 Déficit de Proteína C
 Déficit de Proteína S
 Resistencia a la Proteína C activada
 Factor V Leiden
 Mutación del gen de la protrombina ( Protrombina 20210)
 Hiperhomocisteinemia congénita
8

 Niveles elevados de factor VIII

 Disfibrinogenemia
 Déficit de factor XII
 Trastornos de la generación del plasminógeno
 Polimorfismo del gen del PAI

C1.1.2 Trombofilia secundaria

 Embarazo
 Inmovilización prolongada
 Trauma
 Post-operatorios
 Cirugía traumatológica
 Anticonceptivos orales, estrógenos.
 Sindrome antifosfolípido
 Hiperhomocisteinemia adquirida
 Otros: cáncer, sindrome nefrótico, sindromes mieloproliferativos

C1.1.1.1 Déficit de antitrombina (AT)

La AT es la mayor proteína reguladora de la cascada de
coagulación. Se une irreversiblemente y neutraliza a gran parte de
las enzimas procoagulantes como factores II, IX y X activados.
Se han registrado más de 80 mutaciones que originan disminución
de su actividad y han sido agrupadas en dos grupos: Tipo I, niveles
reducidos de la proteína; Tipo II niveles normales cuantitativamente
pero disfuncionantes.
Aproximadamente el 55% de los pacientes con el déficit desarrollan
trombosis y el 60 % de ellos en forma recurrente. Generalmente
 9

ocurre antes de los 50 años pero raramente aparece antes de la

pubertad.
Existen formas adquiridas del déficit como ocurre en sindrome
nefrótico, coagulación intravascular diseminada (CID), hepatopatías
y uso de anticonceptivos orales.

C1.1.1.2 Déficit de proteínas C y S

Los defectos congénitos de PC y PS son poco frecuentes. Son de
carácter autosómico dominante.
La forma homocigota de déficit de PC se asocia a púrpura fulminans
neonatal, trastorno generalmente fatal a las pocas horas de vida. La
forma más frecuente es la heterocigota, que tiene un riesgo de
desarrollar trombosis de un 75 % a lo largo de la vida, usualmente
entre los 20 y 50 años.
En el caso de la Proteína S, el patrón de herencia, riesgo de
trombosis y edad de instalación son similares a los de la proteína C.
El diagnóstico es difícil dado el consumo de estos factores en la fase
aguda de la trombosis o por el uso de anticoagulantes orales o por
la posibilidad de resultar secundario a CID, uso de anticonceptivos
orales y sindrome nefrótico. Se utilizan mediciones de actividad y
mediciones inmunológicas cuantitativas.

C1.1.1.3 Resistencia a la proteína C activada. Factor V Leiden

La trombomodulina es una glicoproteína de membrana de la célula
endotelial. El complejo trombina-trombomodulina se encarga de unir
a la proteína C inactiva y activarla. Además, la proteína C cuenta
con su receptor endotelial específico de activación.
 10

Flujo sanguíneo

Figura 6. En la imagen podemos ver cómo la trombina una vez producida

por el mecanismo de coagulación comienza a regular la autoinhibición
uniéndose a la trombomodulina.

La PC activada juega un rol importantísimo en los procesos

inhibitorios, ya que se encarga de inactivar a los cofactores VIII
activado y V activado. Para realizar dicho proceso la PC necesita
como cofactor a PS, que la ancla a la superficie fosfolipídica y al FV.
En 1.993 Dahlback y colaboradores estudiaron a un paciente con
importante historia familiar y personal de trombosis y encontraron
que al agregar proteína C activada al plasma del mismo no se
evidenció la prolongación esperada del APTT por inhibición de los
factores Va y VIIIa. Este fenómeno se denominó: resistencia a la
proteína C activada (APCr).
En los años posteriores se encontró que el defecto no recaía en la
proteína C, sino en el sitio de clivaje para inhibir al FVa, ya que,
actualmente se sabe que el 90 % de los casos de APCr se deben a
una sustitución específica de guanina por adenina en el nucleótido
1.691 en el gen del factor V, que provoca un reemplazo del
 11

aminoácido arginina 506 por glutamina, siendo éste el principal de 3

sitios de clivaje de la APC sobre el FV. Esta mutación se denomina
actualmente Factor V Leiden por la ciudad en la que se describió
por primera vez.

Aminoácidos

Figura 7

El factor V Leiden es inactivado a una velocidad 10 veces menor

que el factor V normal y persiste en circulación mayor tiempo,
resultando en un incremento en la formación de trombina y llevando
a un estado de hipercoagulabilidad.
La resistencia a la APC puede darse en un 10 % de los casos por
causa adquirida, de modo que en el laboratorio tendremos escaso
alargamiento del APTT por PC activada pero genotípicamente no
hallaremos la mutación, está sólo en un 10 % de los casos.
Es el defecto trombofílico aislado más frecuente. Su prevalencia en
la población general, especialmente de ascendencia europea, ha
llegado del 5 al 20 % en distintas series de pacientes con trombosis
presentadas en diferentes países. El riesgo relativo de trombosis en
heterocigotas es de diez veces y en homocigotas de hasta 90 veces.
A diferencia de las deficiencias de ATIII, PC y PS, que usualmente
manifiestan trombosis precozmente en la vida, el riesgo de
enfermedad tromboembólica por factor V Leiden aumenta con la
12

edad, lo que ha sido demostrado en numerosas series de pacientes

de más de 60 años con trombosis, llegando la prevalencia de
factor V Leiden hasta el 26 % en una serie de pacientes de 80 años
portadores de úlcera varicosa post- trombótica de más de 4 años de
duración.
La prevalencia de heterocigotas en la población argentina es de
2.9 % (1 a 8 % en población caucásica). La frecuencia en pacientes
con un primer episodio trombótico es 18 % y en pacientes con
historia familiar de trombofilia es de 30 a 60 %.

C1.1.1.3.1 Estudio molecular Factor V Leiden

La técnica consiste en amplificar por PCR un fragmento genómico
de 267 pares de bases que incluye al nucleótido 1691. Los primers
utilizados propuestos por Bertina et al son los siguientes:
Primer 5´: 5’-TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA-3’
Primer 3’: 5’-TGTTATCACACTGGTGCTAA-3’
Para verificar la correcta amplificación, la muestra y el control
negativo se corren por electroforesis en gel de agarosa 2% teñido
con bromuro de etidio. Luego se realiza la digestión de 10 µl del
producto de amplificación con la enzima de restricción Mnl l y los
fragmentos se visualizan en gel de agarosa 2% o poliacrilamida 4%
teñidos con bromuro de etidio.
Observando el patrón de bandas obtenido se establece el genotipo.
Esta digestión origina fragmentos de 37, 67 y 163 pb cuando A está
presente en la posición 1691 (alelo normal) mientras que la
sustitución por G (alelo mutado) produce fragmentos de 67 y 200 pb,
ya que la mutación determina la pérdida de un sitio de restricción
para la enzima Mnl I.
 13

L NOR HOM HET

L: marcador de
peso molecular
200 pb
NOR: normal
163 pb HOM: homocigota
HET: heterocigota

67 pb

37 pb

Foto 1 .Gel de poliacrilamida donde se observan los resultados posibles

luego de la digestión enzimática del producto de amplificación con Mnl.

Comentarios: También se utilizan otras técnicas para el estudio del

Factor V Leiden. Ellas son:
 PCR alelo específica que utiliza diferentes primers para amplificar
en una reacción el alelo normal y en otra el alelo mutado
 Electroforesis en geles con gradiente desnaturalizante
 Polimorfismo Conformacional de Fragmentos Simple Cadena
 Análisis de Heterodúplex.

Cuándo investigar Factor V Leiden

Según los consensos actuales el Factor V Leiden debe ser
investigado en las siguientes circunstancias:
 Primer episodio de tromboembolismo venoso (VTE) antes de los
50 años.
 Tromboembolismo venoso recurrente a cualquier edad.
 Trombosis venosas inusuales: como cerebral, mesentérica,
portal, en venas hepáticas, en vena central de la retina.
14

 Tromboembolismo venoso durante el embarazo o el puerperio.

 Tromboembolismo venoso en asociación con anticonceptivos
orales o terapia de reemplazo hormonal.
 Un primer episodio de tromboembolismo venoso a cualquier
edad, con antecedentes familiares de tromboembolismo venoso

Debe ser considerada cada situación individual en:

 Adultos asintomáticos miembros de familia con historia de VTE
en edad joven o con factor V Leiden.
 Mujeres asintomáticas, familiares de pacientes con Factor V
Leiden, embarazadas o considerando terapia con anticonceptivos
orales.
 Mujeres con pérdidas de embarazo inexplicables en segundo o
tercer trimestre.
 Mujeres con preeclampsia severa, desprendimiento de placenta,
o retardo de crecimiento intrauterino inexplicables.
 Mujeres con VTE relacionado con terapia con tamoxifeno u otros
moduladores de receptores de estrógeno.
 Mujeres fumadoras con infarto agudo de miocardio antes de los
50 años.
 Pacientes mayores de 50 años con VTE inexplicable sin
vasculopatías ni malignidad.

No se recomienda investigar factor V Leiden en:

 screening en la población general
 como test de rutina durante el embarazo o previo al uso de
anticonceptivos orales o previo a terapia de reemplazo hormonal
 como test de rutina en adultos o niños asintomáticos
 como rutina inicial en adultos con trombosis arterial
 15

C1.1.1.4 Mutación del gen de la protrombina

La protrombina humana es una proteína de simple cadena, vitamina
K dependiente, que mediante el complejo protrombinasa es
convertida en trombina en el proceso de la coagulación.
El gen de la protrombina está ubicado en el cromosoma 11 p11-q12
y está organizado en 14 exones, separados por 13 intrones con una
región 5´ y una región 3´ no traducidas, las cuales podrían jugar un
rol regulador en la expresión del gen.
La mutación del gen se trata de un trastorno hereditario autosómico
dominante caracterizado por una sustitución de guanina por adenina
en la posición 20210 de la región 3´ no traducida. El resultado es un
aumento en la actividad protrombínica que puede manifestarse
fenotípicamente con un aumento de los niveles de protrombina (FII)
en plasma.
La primera descripción fue realizada en 1.996 por Prot. et al en una
serie de 28 pacientes con historia familiar de trombosis y sin otro
factor de riesgo. Tiene menor prevalencia que el factor V Leiden en
la población general. Según The Leiden Thrombophilia Study, un
6.2 % era portador de la mutación en los pacientes con un primer
episodio de TVP y 2.2 % en la población sana, con un riesgo
trombogénico de 2,8 veces.
Existe frecuente asociación de protrombina 20210 y factor V Leiden,
aumentando el riesgo de enfermedad tromboembólica, trombosis
asociada al embarazo y TVP recurrente.
Si bien un 30 % de pacientes tienen niveles elevados de
protrombina, la medición de ésta no es considerada una buena
forma de diagnóstico. Por lo tanto el test recomendado es el análisis
de ADN por PCR.
16

C1.1.1.4.1 Estudio molecular mutación del gen de la

protrombina
Los métodos utilizados son:
1. PCR con enzima de restricción:
Este análisis se realiza mediante la amplificación por PCR de un
fragmento de la región 3'UT de la protrombina. Para ello se utiliza un
primer mutagénico, es decir, que se diseñó un nucleótido cebador
con una sustitución de manera que la combinación de esta
sustitución con la anormalidad genética en la posición 20210 origine
un nuevo sitio de restricción para la enzima Hind III según el método
publicado por Poort et al.
Primer 5’: 5’-TCTAGAAACAGTTGCCTGGC-3’
(nucleótidos 19889 a 19908)
Primer mutagénico: 5’-ATAGCACTGGGAGCATTGAA*GC-3’
( nucleótidos 20233 a 20212)

El nucleótido con el asterisco no está presente en la secuencia

normal.

Para verificar la correcta amplificación, la muestra se corre por

electroforesis en gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio.
Luego se realiza la digestión de 10 µl del producto de amplificación
con la enzima de restricción Hind III cuyo sitio de reconocimiento es:

5´... A AGCTT...3´
3´... TTCGA A...5´.
 17

El alelo normal carece de sitio de restricción Hind III (A GAG) y, por

lo tanto, se observa en el gel un solo fragmento de 345 pb. En el
caso de presentar un alelo mutado, se introduce un nuevo sitio de
restricción (A AGCT) determinando la producción de dos fragmentos
de 322 y de 23 pb.
Los fragmentos se visualizan en gel de agarosa 2% o poliacrilamida
4% teñidos con bromuro de etidio. (Foto 2)

L: marcador de
peso molecular
L HET NOR NOR
NOR: normal
345 pb HET: heterocigota

322 pb

Foto 2.Gel de poliacrilamida donde se observan los fragmentos obtenidos

luego de la digestión enzimática. El fragmento de 23pb no se observa ya
que se pierde durante la corrida.

2. Método de PCR alelo- específico:

En este método uno de los primers utilizados hibrida sobre la base
mutada.
Se utilizan los siguientes primers, dos de los cuales generan un
producto que sirve de control interno.
Primer 1: 5’-TCCGCCTGAAGAAGTGGATA-3’
( nucleótidos 20064 a 20085)
Primer 2: 5’-GAGTGCTCGGACTACCAGCGTGC-3’
18

(nucleótidos 20333 a 20311)

Primer 3: 5’-TTCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCA-3’
(nucleótidos 20186 a 20210)
Primer 4: 5’-TTCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCG-3’
(nucleótidos 20186 a 20210)
Se realizan 2 PCR, en el tubo 1 se colocan los primers 1,2 y 3 y en
el tubo 2 se colocan los primers 1,2 y 4.
Los fragmentos se visualizan en un gel de agarosa al 2% realizando
una corrida electroforética con bromuro de etidio.

Interpretación de resultados:
PRESENCIA DE LA MUTACIÓN (HETEROCIGOTA)
Tubo 1: amplificación de 2 bandas (control interno y alelo mutado)
Tubo 2: amplificación de 2 bandas (control interno y alelo normal)

PRESENCIA DE LA MUTACIÓN (HOMOCIGOTA)

Tubo 1: amplificación de 2 bandas (control interno y alelo mutado)
Tubo 2: amplificación de 1 banda (control interno)

Consideraciones:
En general se solicita la investigación de protrombina 20210 en
aquellos pacientes en los cuales el estudio de trombofilia congénita y
adquirida de 1ra línea da normal y sigue existiendo fuerte sospecha
clínica de trombofilia congénita.

C1.1.1.5 Hiperhomocisteinemia
La homocisteína es un aminoácido intermediario del metabolismo de
la metionina. Es reconvertido en metionina por la metilen
 19

tetrahidrofolato reductasa (MTHFR) o por la homocisteína metil

transferasa, siendo las vitaminas B12, B6 y folatos cofactores
necesarios para la metilación. Cuando se produce un defecto en
cualquiera de estas dos vías, ya sea por un déficit enzimático
congénito o por un déficit adquirido de cofactores, se produce un
aumento en los niveles de homocisteína. La homocisteína es tóxica
para las células endoteliales, provocando una reacción trombótica y
aterosclerótica, tanto en territorio arterial (es un factor de riesgo
independiente para infarto de miocardio y accidentes vasculares)
como venoso.
Los defectos genéticos en la síntesis de enzimas, sobre todo de
MTHFR, han sido reportados en las distintas series entre el 1.4 al
15 % de la población. Cerca del 13 al 18 % presentaron trombosis
venosas antes de los 45 años, con un riesgo de 2.5 veces. Se han
identificado varias alteraciones genéticas en la MTHFR, la más
común es una variante que presenta menor actividad específica y
alta sensibilidad al calor. Esta variante surge de la transición 677
C—T. El genotipo homocigota MTHFR-677TT es muy común en la
población general (10-15 %) y está asociado a un aumento en los
niveles plasmáticos de homocisteína.
La suplementación con vitamina B12, B6 y folatos puede contribuir a
la reducción de los niveles de homocisteína pero no en todos los
casos, algo que sí ocurre en la hiperhomocisteinemia adquirida.
El diagnóstico se realiza identificando el defecto genético por PCR o
midiendo los niveles de homocisteína 4 horas post-ingesta de una
comida rica en metionina. Medir niveles basales de homocisteína
puede resultar confuso, ya que éstos pueden resultar normales o
ligeramente elevados en pacientes heterocigotas.
20

C1.1.1.6 Polimorfismos del gen del PAI

El sistema fibrinolítico es el encargado de disolver los coágulos
sanguíneos. Está básicamente compuesto por un precursor inactivo,
el plasminógeno (Plg) que es convertido en la enzima activa
plasmina (Plm) por acción de diferentes activadores: el activador
tisular del plasminógeno, el activador tipo uroquinasa y la calicreína
(K). Entre los inhibidores del proceso mencionaremos: a) los
inhibidores de la plasmina, que son: α2-antiplasmina (α2AP),
α2-macroglobulina y α1-antitripsina y b) los antiactivadores o
inhibidores de activadores del plasminógeno, que son PAI-1, PAI-2,
PAI-3, C1 inhibidor y proteasa nexina.

Plasminógeno PAI-1

tPA, uPA
Fibrinógeno
Plasmina
Trombina α2AP
Fibrina PDF, Dim D
inhibición activación

Figura 8

La plasmina es una serinoproteasa con amplio espectro de acción.

Sin embargo, in vivo actúa casi exclusivamente sobre la fibrina.
Gracias a los inhibidores fisiológicos, en condiciones normales, la
fibrinolisis es un proceso autolimitado y localizado que lleva a la
disolución del coágulo, sin riesgo de proteólisis generalizada.
 21

El más importante inhibidor del tPA es el PAI-1, con el que forma un

complejo equimolecular. Este inhibidor pertenece a la familia de las
serpinas o inhibidores de serinoproteasas, que se consumen en la
reacción de inactivación.

El PAI-1
El PAI-1 es una glicoproteína de cadena única, de aproximadamente
52 KD de peso molecular y cuya vida media es relativamente corta
(10 minutos). Su concentración en plasma es de 6 a 80 ng/ml,
hallándose en exceso respecto a la concentración molar de tPA.
Su origen es principalmente endotelial, aunque es producido además
por los adipocitos y los megacariocitos, hallándose presente también
en las plaquetas. Su síntesis es rápidamente estimulada por
mediadores inflamatorios, factores de crecimiento y hormonas. En
condiciones normales se encuentran altos niveles en hígado, bazo,
riñón y pulmón.
El gen del PAI-1 está localizado en el cromosoma 7 q21.3-q22.3 y la
región del promotor tiene varias secuencias con elementos de
regulación conocidos. Uno de los polimorfismos del gen es una
deleción de una guanina en el nucleótido 675 del promotor del PAI-1
(4G/5G).
Los individuos con el genotipo homocigota 4G/4G exhiben niveles
más altos de PAI-1 (hasta un 25 % más) que aquellos con genotipo
5G/5G. Este incremento en los valores y la actividad del PAI pueden
estar asociados con incremento del riesgo de trombosis venosa,
accidente cerebrovascular o infarto de miocardio. La prevalencia del
genotipo 4G/4G en la población normal es 26%.
En cuanto al polimorfismo 4G/5G, con una frecuencia de
aproximadamente el 40 %, pero niveles plasmáticos menores de PAI
22

que el genotipo 4G/4G, los datos de la literatura son discordantes

acerca de su valor predictivo de enfermedad tromboembólica.
El polimorfismo genético se puede evaluar por el método de
amplificación específico del alelo 4G o 5G o a través de
amplificación de la zona del promotor y posterior análisis de la
inserción-deleción con enzimas de restricción.

C1.1.1.6.1 Estudio molecular

1. Método de PCR alelo- específico:
Primers:
4G: (5’- GTC TGG ACA CGT GGG G- 3’)
5G: (5’- GTC TGG ACA CGT GGG GG- 3’)
2d: (5’-TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA G- 3’)
1u: (5’- AAG CTT TTA CCA TGG TAA CCC CTG GT-3’)
Se corren 2 tubos, en el tubo 1 se colocan los primers 4G, 2d y 1u
(control de amplificación), en el 2 los primers 5G, 2d y 1u.
Los fragmentos amplificados se visualizan por electroforesis en gel
de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio.

Interpretación de resultados
Es similar a la interpretación de la mutación del gen de la
protrombina.

Significancia clínica
En estudios poblacionales de familias con eventos isquémicos
coronarios se ha considerado un buen predictor de enfermedad
arterial coronaria. Hay actualmente varios estudios que dan
evidencia sustancial de que los portadores del polimorfismo 4G/4G
 23

presentan elevados niveles de PAI-1 y este sería considerado factor

de riesgo independiente para eventos coronarios.

Se recomienda la investigación del polimorfismo en:

 Pacientes que presentan historia familiar de enfermedad
cardíaca, vascular o stroke.
 Pacientes con enfermedad coronaria
 Pacientes que deben ser sometidos a cirugía vascular.
 Mujeres con complicaciones obstétricas sobre todo tempranas.
 Casos seleccionados de familias con historia de trombosis
venosa.

Otros inhibidores del tPA:

PAI-2: sintetizado por la placenta y relacionado con la funcionalidad
placentaria y la madurez fetal. Su función es prevenir el
desprendimiento prematuro de la placenta y asegurar la correcta
hemostasia durante el parto. No se lo encuentra normalmente en
plasma, excepto durante al embarazo.
PAI-3: se encuentra en plasma y orina, reaccionando lentamente
con el tPA. Actuaría inactivando la proteína C activada.

Consideraciones generales
A diferencia de lo que sucede con el estudio de otras coagulopatías,
no existe para los estados trombofílicos heredados ninguna prueba
standard y global de hemostasia que permita su identificación, lo que
obliga a una correcta selección de los pacientes.
Ya que estos factores congénitos son recientemente descriptos, no
24

existen estudios lo suficientemente confiables que evalúen la

aproximación óptima y costo efectivo de estos tests en screening.

Los estudios de biología molecular, a diferencia de otros estudios

comprendidos en el protocolo de estudio del paciente trombofílico,
pueden ser realizados en el período agudo y en pacientes
anticoagulados sin necesidad de suspensión de la anticoagulación.
Generalmente se solicita evaluación de Factor V Leiden en aquellos
pacientes con Resistencia a la proteína C activada positiva. Está
discutida la inclusión del estudio de polimorfismo del PAI y de la
MTHRF dentro del estudio de trombofilia congénita en primera línea.
Actualmente, por frecuencia y no por contar con una prueba de
screening, se ha aceptado solicitar la protrombina 20210A dentro de
los estudios solicitados en primera línea.