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Resumen

El método de extracción es un proceso fundamental en las técnicas moleculares, en biología molecular; consiste en el aislamiento y
purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El objetivo de esta experiencia es la
extracción de ADN a partir de Escherichiacoli, para ello fue necesario realizar primero la destrucción de la pared celular a través de
la adición de búfer de lisis para su posterior extracción, por ultimo para hacer el análisis y observación de este se realizó la técnica de
electroforesis, posteriormente se pudo observar presencia de ADN en cada una de la muestras pero no se logró medir el peso
molecular porque este sobre pasó el límite del marcador. En conclusión, esta extracción es de mayor eficacia cuando se realiza
técnicas de PCR.

Palabras Clave: ADN Bacterial, Escherichia coli, Electroforesis, Cepa K12, Marcador, PCR.

Abstract

The extraction method is a fundamental step in molecular techniques, in molecular biology; consists of the isolation and purification
of DNA molecules and is based on the physicochemical characteristics of the molecule. The objective of this experience is the
extraction ofDNA from Escherichia coli, for it was necessary to first perform the destruction o f the cellwall through the addition of
lysis buffer for later extraction, finally to do the analysisand observation of thisthe electrophoresis technique was reali zed, later it was
possible to observe presence of DNA in each one of the samples but was no t able to measure the molecular weight because this
overpassed the limit of the marker. In conclusion, this extraction is most effective when performing PCR.

Keywords: Bacterial DNA, Escherichia coli, Electrophoresis, K12 strain, Marker, PCR

INTRODUCCIÓN
Las características fisiológicas y bioquímicasde todo ser vivo están contenidas en sus respectivos genomas. Los genomas de bacterias, hongos, plantas,
animalesy algunos virus están compuestos por moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA). En las células procariotas, el DNA es una única
molécula larga, generalmente circular y de doble filamento, compactado y plegado, que se encuentra ubicada en un sector de la célula que se conoce
con el nombre de Nucleoide, que no implica la presencia de membrana nuclear (1).
Existen diferentesmétodos para la obtención de ADN bacteriano
que varían en duración y complejidad del procedimiento en función de la calidad del ADNque queramos obtener. Este método es un paso fundamental
en las técnicas moleculares, en biología molecular. (2). Uno de los métodos es la extracción de ADN el cual consta de una etapa de lisis, que consiste
en romper lasestructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final
de la mayoría de elementos que pueden interferir en la PCR (3).
Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: Lisis de las células o virus; las sales
caotró-picas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su
desnaturalización, la adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas, la degradación de la fracción proteica
asociada al ADN; la cual se consigue mediante la adición de una proteasa, la fracción proteica que puede precipitarse mejor con la ayuda de sales
como el acetato de amonio o el acetato sódico, la purificación y Precipitación del ADN; debido que ADN es insoluble en alcohol, ya que se puede
precipitar etanol frío o isopropanol y recuperar mediante una centrifugación y por ultimo recuperación; el sedimento se puede resuspender en agua
o tampón Tris tras ser secado completamente. La confirmación de la presencia de ADNse lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa;
posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV (3).
El modelo utilizado en el campo de la biología molecular y
microbiología, especialmente para el método de extracción de ADN
es la célula procariota o bacteriana Escherichia coliUn bacilo Gram-
SOLUCIONES MADRES CONCENTRACIÓN EN EL BUFFER

CLORURO DE SODIO ) 5M-

TRIS HCL 0.2 M


EDTA 10 mM
SDS 10% p/v

PROTEINASA 50 µg/ ml

negativo,anaerobio facultativo y móvil debido a la


presencia de flagelos peritricos (que rodean a la célula)
y su temperatura óptima de
crecimiento es 37°C, aunque es capaz de crecer a 44°C. Se encuentra generalmente ubicado en el intestino largo de los vertebrados (4). Esta ha permitido
su generalización al resto de los seres vivos e impulsado el comienzo del estudio en otras especies. Hoy en día la bacteria E. coli es de especial interés
debido a que se sabe mucho más de este organismo procarionte que de cualquier otra forma de vida celular. La bacteria fue aislada por primera vez,
de lasheces de un niño, en 1885 por el médico pediatra y bacteriólogo alemán Theodor von Escherich, quién la denominó Bacterium coli (5).

CONCENTRACIÓN
Se aisló Escherichia coli K-12 en el otoño de 1922 a partir de las
heces de un paciente de difteria convaleciente en Palo Alto, California, por Blair (6). En 1925, el cultivo se depositó en la colección de cepas
del Departamento de Bacteriología de la Universidad de Stanford, donde recibió la designación de "K-12". K-
12 dio resultados positivos en las pruebas estándar que se utilizan para la identificación de E. coli y se utilizó por muchos años en los
laboratorios de enseñanza del departamento como un ejemplo típico de E. coli (7).
La cepa K-12 de e. coli ATCC 10798 tiene un tamaño genotípico de
4,685,496 pb, con un contenido de G + C de 50,70%. Este conjunto consta de 62 contigs y el plásmido F. La secuencia del genoma fue aislada de la
muestra de heces de un paciente convaleciente de difteria en 1922 (8).
Desde los comienzos de la investigación genética bacteriana, los microbiólogos eligieron este organismo porque era muy accesible, no virulento y
crecía rápidamente en medio definido (9). Fácil de cultivar en un medio definido, y tiene un tiempo de generación corto. El uso de esta bacteria
permitió el estudio fácil de poblaciones muy grandes y por lo tanto el análisis preciso de muy raros presentando una gran ventaja en este aspecto
sobre las plantas, los animales y los hongos en los estudios genéticos (7).
El propósito de esta práctica fue extraer ADN bacteriano mediante la utilización de una cepa de Escherichia coli.

METODOLOGÍA
Para la realización de esta práctica se desarrollaron diferentes
Procedimientos:

1. Preparación de buffer

Existen diferente técnicas para la extracción de ADN, una de ellas es la preparación de buffer de lisis; para esto fue necesario preparar
disoluciones, luego se calcularon lascantidades necesarias para la
preparación de soluciones madres:
SOLUCIONES MADRES concentración

Soluciones madre 5M tris


NaCl 5M

Tris base 1 M pH 8.0


EDTA 0.5 M pH 8.0
SDS 10 % p/v

A partir de las soluciones madres, se calculó la cantidad necesaria para 5 ml de extracción que contenía los siguientes componentes:

2. Extracción de ADN

Despuésse adiciono 600 µl de buffer de extracción, luego agito en vortex para homogenizar la solución; se incubo a 65 °C por una hora con
agitacionespor inversión durante 15 minutos; se le agrego 150
µl de acetato de amonio 7.5 M y se agito por inversión por 15 minutos. Seguidamente se centrifugo a 12000 r.p.m durante 15 minutos. Se transfirió
el sobre nadante a un nuevo y se le añadió 250
µl de isopropanol frio; se dejó precipitar en el congelador durante toda la noche. Nuevamente se centrifugo a 12.000 r.p.m. durante 15 min. El
sobrenadante fue eliminado y el pellet se lavó con 150 µI de etanol frio al 70%, dejo evaporar a temperatura ambiente. Se agregó de 250 µI de TE.

3. Electroforesis
Por ultimo para la visualización de este se empleó la técnica de electroforesis para ello fue necesario:
Preparar la agarosa en bufer TBE 0.5X
Licuar la agarosa
Calentar en baño de maría hasta 45 a 60°C
Añadir el buffer, 1 cm por encima del gel.
Con ayuda de micropipetasmedir 3 µl de syber safe
Diluir con el syber safe y a la vez cargar con iones positivos las muestras de ADN.
Verter el ADN, en los pocillos
Cubrir el tanque, conectar los electrodos. Encender la
fuente y seleccionar le voltaje. Detener hasta que ambos hasta que ambos lados se localicen en el lugar deseado.
Llevar directamente al transluminador y visualizar el ADN