Resistencia aislada de Blastocystis hominis al metronidazol

K. Haresh, K. Suresh,A. Khairul Anuar and S. Saminathan

Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Malaya, Kuala Lumpur, Malasia

Resumen

Aislamientos de Blastocystis hominis de trabajadores inmigrantes infectados de Indonesia, Bangladesh y las

personas infectadas de Singapur y Malasia se evaluaron para el patrón de crecimiento y el grado de resistencia
a diferentes concentraciones de metronidazol. La viabilidad de las células se evaluó usando azul de cresilo
eosina brillante la cual tiñó células viables células verdes y no viables rojas. Los aislamientos de Bangladesh y
Singapur no eran viables, incluso a la concentración más baja de metronidazol a 0.01mg/ml. Los parásitos del
aislamiento de Malasia eran resistentes a una concentración de 0.01mg/ml, Considerando que el 40% del
inóculo inicial de parásitos del aislamiento de Indonesia en el primer día todavía era viable en cultivos con 1.0
mg/ml de metronidazol. El estudio muestra que los aislamientos de B. hominis de origen geográfico diferente
tienen diferentes niveles de resistencia al metronidazol. Parece inevitable la búsqueda de fármacos más
eficaces para eliminar el parásito, especialmente dado que los parásitos supervivientes de los cultivos de
metronidazol muestran una mayor capacidad de multiplicarse en los subcultivos que los controles.

Introducción

Blastocystis hominis, un parásito protozoario que se encuentra comúnmente en el intestino humano,

especialmente en los trópicos, es conocido por causar diarrea (Sheehan et al. 1986; Miller & Minshew 1988).
Sin embargo, aún existe controversia con respecto a su patogenicidad. Esta controversia se puede resolver
mejor si se trata eficazmente a los pacientes y se determina si los síntomas que supuestamente son causados
por el parásito desaparecen. Lamentablemente, no existe un tratamiento probado, aunque actualmente el
metronidazol es el fármaco de elección. Poco se ha hecho hasta ahora para evaluar y comparar la morfología
y los perfiles de crecimiento de los parásitos tratados con metronidazol. Hemos demostrado la resistencia a
los medicamentos de aislados locales obtenidos de pacientes infectados con B. hominis, pero esta variación
en la resistencia fue solo pequeña (observación no publicada). En este estudio, utilizamos un ensayo de drogas
in vitro reproducible para evaluar el efecto del metronidazol en aislados humanos de B. hominis obtenidos de
personas infectadas de cuatro países.

Materiales y Métodos

Se obtuvieron cuatro aislamientos humanos de Blastocystis hominis a partir de muestras fecales de individuos
infectados de Malasia, Singapur, Indonesia y Bangladesh. Los parásitos se mantuvieron en tubos tapados a
presión de 10 ml que contenían medio Jones (Jones 1946) a 37°C y subcultivado una vez cada 5 días.
El aislamiento de Malasia se obtuvo de una muestra fecal de un paciente atendido en un hospital privado local
en Kuala Lumpur con diarrea. El aislado de Singapur se obtuvo de una persona infectada que residía en
Singapur y se confirmó que había adquirido la infección unos años antes. Las muestras fecales también se
recogieron en la clínica ambulatoria, Hospital Universitario, Kuala Lumpur, de trabajadores inmigrantes recién
llegados de Bangladesh e Indonesia. Estas personas infectadas con Blastocystis eran aparentemente sanas y
asintomáticas.
La solución madre de metronidazol se preparó añadiendo 10 ml de agua destilada estéril a 600 mg del fármaco
para dar una solución madre final de concentración de 60 mg / ml. Esto fue almacenado en la oscuridad a
48°C. El metronidazol se preparó a concentraciones de 0.01, 0.1, 1.0 y 10 mg / ml en tubos de cultivo con
tapón de rosca que contienen el medio de Jones. Se preparó por duplicado un conjunto de 10 tubos de cultivo,
ocho que contenían las diferentes concentraciones de fármaco y dos que contenían solo el medio de Jones.
Se introdujo un inóculo de parásitos de cultivos en fase logarítmica de tamaño 1 x 10 4/ml de cada uno de los
cuatro aislados humanos mantenidos en cultivos en cada grupo de tubos de cultivo que contenía 3 ml de
medio de Jones y las concentraciones respectivas de metronidazol. Los tubos se incubaron a 37 ° C y la eficacia
del metronidazol frente a B. hominis se evaluó contando el número de células viables en el día 1, 3 y 6
utilizando colorante azul de cresilo brillante (eosina) (Yang et al., 1996), que tiñó células viables células verdes
y no viables rojo. La enumeración se duplicó y solo se contaron las células intactas. El día 6 después del
recuento, las células se sedimentaron después de la centrifugación a 2000 r.p.m. durante 5 minutos y el
sedimento que contenía los parásitos se transfirió a medio nuevo libre de fármaco para evaluar la viabilidad.
Los parásitos de estos tubos se examinaron de nuevo bajo microscopía de luz en el día 3 para el crecimiento
y la morfología.

Resultados

Células vivas teñidas con azul de cresilo eosina brillante de B. hominis de color verde claro. La mayoría de las
células viables eran de formas vacuolares con membranas celulares intactas. Las células moribundas o
muertas, la mayoría de las cuales mostraban una morfología distorsionada, se tiñeron de rojo y solo se vieron
unas pocas células intactas.

Recuentos de células de los aislados de Indonesia, Malasia y Bangladesh (Figuras 1, 2 y 3) de B. hominis en los
tubos de control aumento en el día 1, alcanzó su punto máximo en el día 3 y bajo en el día 6. El aislado de
Singapur (Figura 4) mostró una disminución en el recuento de parásitos en el día 1 seguido de un aumento
hasta alcanzar su valor máximo el día 6. Los parásitos de los aislamientos de Singapur y Bangladesh no
crecieron en cultivos con concentraciones de metronidazol tan bajas como 0.01 mg/ml. El recuento de
parásitos del aislamiento de Indonesia en el tubo de 0.01 mg / ml aumentó 29.9 veces entre el día 1 y el día 3
en comparación con un aumento de 7.0 veces en el tubo de control. Esto fue seguido por una disminución de
33.2 veces en el tubo de 0.01 mg / ml en comparación con una disminución de 4.4 veces en el tubo de control
entre el día 3 y el día 6. Los parásitos del aislamiento de Malasia, sin embargo, aumentaron 12.1 veces en el
0.01 mg/ml de tubo en comparación con un aumento de 2.7 veces en el tubo de control. Se observó una
disminución posterior de 1.1 veces tanto en 0.01 mg/ml como en el tubo de control desde el día 3 hasta el día
6.
El aislado de Indonesia mostró la mayor resistencia al metronidazol: el 40% del inóculo inicial del parásito fue
viable incluso a una concentración de 1,0 mg / ml. Los parásitos sobrevivientes de aislados indonesios y
malasios de cultivos tratados superaron su número de inóculo inicial, que fue similar a sus tubos de cultivo de
control entre el día 1 y el día 3 del estudio. Las células no viables en los cultivos tratados no volvieron a la
viabilidad cuando se subcultivaron en medio fresco de Jones.
Discusión

B. hominis se ha asociado con una variedad de enfermedades (Gallagher & Venglarcik 1985; Sheehan et al.,
1986; Tsang y col., 1989; Enzenauer y col., 1990; Garavelli y col., 1991; Jeddy y Farrington, 1991) y causa
infecciones oportunistas en pacientes inmunosuprimidos e inmunodeficientes (Llibre et al., 1989; Garavelli et
al., 1990). Actualmente, el metronidazol es el fármaco de elección para tratar infecciones causadas por
protozoos y bacterias anaeróbicas. Sin embargo, los estudios experimentales con animales han demostrado
que el fármaco puede inducir carcinogenicidad (Rustia y Shubik 1972; Rohner y Demuth 1994), y varios
estudios informaron su ineficacia contra B. hominis (Zierdt y Tan 1976; Llibre et al., 1989; Sun et al. 1989). Por
lo tanto, es necesario evaluar la eficacia del fármaco y también evaluar la resistencia del aislado al
metronidazol.
En nuestro estudio, cuatro aislamientos de B. hominis mostraron diferentes perfiles de crecimiento y grado
de resistencia contra el metronidazol. El método de recuento de células viables utilizado inicialmente por Yang
et al. (1996) demostraron ser confiables y precisos para determinar la actividad del metronidazol frente a
diferentes aislados de B. hominis. Los parásitos de los aislamientos de Singapur y Bangladesh mostraron la
menor resistencia, perdiendo viabilidad a una concentración de 0.01 mg / ml. El parásito del aislamiento de
Malasia fue viable a una concentración de 0.01mg/ml, mientras que el aislamiento de Indonesia exhibió la
mayor resistencia con el 40% del inóculo inicial de parásitos viable en el día 1 en cultivos tratado con 1.0
mg/ml de metronidazol. La capacidad de los aislamientos de Indonesia y Malasia para crecer a una
concentración de 0.01 mg / ml muestra que el metronidazol no tuvo ningún efecto sobre estos aislados y que
eran resistentes a este fármaco. La supervivencia de B. hominis de Indonesia y Malasia de los cultivos tratados
con metronidazol mostró un mayor aumento en el número de parásitos cuando se subcultiva en comparación
con los recuentos en los tubos de control. Parece que el tratamiento confiere una mejora en el potencial
reproductivo del parásito. Los parásitos tratados vuelven a ser granulares y la posible liberación de los
gránulos reproductivos explica el aumento del número de parásitos en los cultivos.
Rajah et al. (1997) informaron que se observaron formas pequeñas de B. hominis en muestras fecales de
aislados indonesios con un perfil de crecimiento distinto al observado en nuestro estudio. Nuestros hallazgos
coinciden con los de Zaman y Zaki (1996), que detectaron diferencias en la resistencia al metronidazol
exhibidas por diferentes muestras de quistes obtenidas de pacientes locales.
Los aislamientos de Indonesia y Bangladesh se obtuvieron de individuos asintomáticos y pudieron haber
pertenecido al grupo no patógeno, o los individuos infectados habían desarrollado anticuerpos según lo
sugerido por Shlim et al. (1995) Los estudios futuros deberían incorporar muestras de sangre tomadas de
individuos infectados con Blastocystis para correlacionar los hallazgos de la resistencia del parásito y los títulos
de anticuerpos en individuos infectados.
Deben considerarse posibles mecanismos para la aparente falla del metronidazol, incluyendo el
incumplimiento del paciente, las diferentes propiedades farmacocinéticas de los fármacos y la inactivación
del fármaco por parte de la flora bacteriana normal. Otras drogas podrían ser más eficientes que el
metronidazol (Dunn y Boreham 1991).
En conclusión, este estudio ha demostrado que los aislados humanos de B. hominis de diferentes ubicaciones
geográficas poseen diversos grados de resistencia al metronidazol, lo que sugiere que se debe instituir un
fármaco eficaz o combinaciones de fármacos a la dosis adecuada para eliminar el parásito. La migración de
trabajadores puede causar afluencia de patógenos resistentes como B. hominis en la comunidad. Se deben
realizar más estudios sobre la influencia de la dieta, la respuesta inmune del huésped, los factores ambientales
y los estilos de vida del hospedador sobre la resistencia de este parásito al metronidazol.