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Abstrato
A deterioração de alimentos é um processo complexo e quantidades excessivas de alimentos são perdidas devido à
deterioração microbiana, mesmo com técnicas modernas de preservação. Apesar da heterogeneidade das matérias-primas e as
condições de processamento, a microflora que se desenvolve durante o armazenamento e em estragar os alimentos podem ser
previstos com base no conhecimento da origem dos alimentos, a base substrato e alguns parâmetros de preservação central,
tais como temperatura, atmosfera, um we pH. Com base nesses conhecimentos, análises sensoriais, químicas e microbiológicas
mais detalhadas podem ser realizadas nos produtos individuais para determinar o organismo específico de
deterioração. Enquanto os parâmetros químicos e físicos são os principais fatores determinantes para a seleção de
microorganismos de deterioração, um nível de refinamento pode ser encontrado em alguns produtos em que o comportamento
interativo dos microrganismos pode contribuir para o seu crescimento e / ou atividade de deterioração. Esta revisão dá três
exemplos. Descrevemos a vantagem competitiva de Pseudomonas spp. devido à produção de sideróforos quelantes de ferro ,
a geração de substratos para reações de deterioração por um organismo de outro microrganismo (a chamada metabiose) e
a regulação positivade fenótipos potencialmente envolvidos na deterioração através da comunicação célula-a-célula . Em
particular, relatamos pela primeira vez a ocorrência generalizada de lactonas de N-acil homoserina (AHL) em alimentos
frescos armazenados e deteriorados e discutimos as implicações potenciais para deterioração e preservação de alimentos.
D 2002 Elsevier Science BV Todos os direitos reservados.
Palavras-chave: N-Acyl homoserine lactones; Antagonismo; A deterioração dos alimentos; Metabiose; Quorum
sensing; Sideróforos; Organismos específicos de deterioração
1. Introdução
A preservação de alimentos foi, desde o início da humanidade, necessária para nossa sobrevivência. As
técnicas de preservação usadas nos primeiros dias dependiam - sem qualquer compreensão
da microbiologia - da inativação dos microrganismos estragados através da secagem,
Todo e qualquer produto alimentício abriga sua própria microflora específica e característica em qualquer ponto no
tempo durante a produção e armazenamento. Esta microflora é uma função das condições de flora, processamento,
conservação e armazenamento da matéria-prima. Apesar da variabilidade em todos os três, alguns padrões muito claros
emergem, e
Com base no conhecimento de alguns parâmetros químicos e físicos, é possível, com grande precisão,
prever quais microrganismos irão crescer e dominar em um determinado produto. No ponto de rejeição
sensorial (deterioração), a chamada microflora de deterioração (ou associação de deterioração) é composta
de microrganismos que contribuíram para a deterioração e microorganismos que cresceram, mas não
causaram mudanças desagradáveis. O primeiro é o chamado sistema específico de deterioração (SSO) do
produto.
O potencial de deterioração de um microrganismo é a capacidade de uma cultura pura de produzir os
metabólitos que estão associados à deterioração de um determinado produto. Em geral, vários dos
organismos isolados de um produto alimentício serão capazes de produzir metabólitos de deterioração
quando permitido o crescimento ilimitado. É crucial que considerações quantitativas sejam
introduzidas (Gram, 1989), uma vez que a atividade de deterioração de um organismo é sua capacidade
quantitativa de produzir metabólitos de deterioração (Dalgaard et al., 1993; Dalgaard, 1995).Assim, é para
ser avaliado se os níveis do organismo específico atingido em alimentos naturalmente deteriorantes são
capazes de produzir a quantidade de metabolitos associados à deterioração. Em geral, requer uma
combinação cuidadosa de microbiologia, análises sensoriais e química para determinar quais
microorganismos são os SSOs de um determinado produto alimentício.
Em carne e peixe, uma mudança na atmosfera, por exemplo, por empacotamento a vácuo, inibirá as
pseudo- monadadas respiratórias e nas carnes causará uma mudança na microflora para bactérias de ácido
láctico (LAB), Enterobacteriaceae e às vezes Brochothrix thermosphacta (Dainty e Mackey, 1992) . Além
disso, os clostrídios podem causar uma deterioração anaeróbica de músculo profundo de carnes embaladas
a vácuo (Broda et al., 1996) . S. putrefaciens, que é capaz de respiração anaeróbica, também cresce e
contribui para a deterioração da carne com alto pH. Em peixes, a embalagem a vácuo seleciona a S.
putrefaciens e a bactéria marinha psico-resistiva P. phosphoreum resistente ao CO 2 . CO 2O
empacotamento de peixes de águas temperadas não seleciona para LAB, mas permite que P. phosphoreum
cresça e este organismo estraga o produto (Dalgaard et al., 1993) . Um tratamento térmico suave dos peixes
resulta na eliminação de bactérias vegetativas e clostridia e Bacillus (que tanto sobrevivem como esporos)
podem crescer e estragar o produto, especialmente se embalados a vácuo (Ben Embarek, 1994) .
Além disso, a "pressão seletiva", por exemplo, a adição de baixos níveis de sal e a secagem dos peixes,
eventualmente, mudam a microflora na mesma direção que a carne embalada a vácuo e os produtos de
carne. Assim, uma microflora de LAB, Enterobacteriaceae e - até certo ponto - Brochodrix
se desenvolve (Lyhs et al., 1998; Truelstrup-Hansen e Huss, 1998; Joffraud et al., 2001) . Devido à origem
aquática, o P. phosphoreum está frequentemente presente. Identificando o SSO de produtos de peixe
levemente preservados
e de produtos cárneos processados tem se mostrado difícil e, provavelmente, diferentes grupos de bactérias
são importantes sob diferentes condições. Assim, em alguns ensaios, os indicadores de deterioração são
paralelos aos metabólitos de P. phosphoreum, em outros ensaios, o de uma flora LAB (Lactobacillus
curvatus) e em outros, os metabólitos combinados de LAB e Enterobacteriaceae (Jørgenen et al., 2000a,
b) .
Aumentar a preservação por uma diminuição do pH (abaixo de 5), um aumento na concentração de NaCl
(acima de 6%) e pela adição de sorbato e / ou benzoato elimina a microflora Gram-negativa . LAB e
levedura são os organismos remanescentes em produtos de peixe semi-conservados . Diferentes
Lactobacillus spp., Incluindo Lactobacillus alimentarius (Lyhs et al., 2001) foram identificados como
organismos de deterioração desses produtos. Carnes que são curadas por sal e pH baixo são
geralmente estáveis em armazenamento e não são estragadas pelo crescimento microbiano (ICMSF,
1998) . O perfil de preservação de, por exemplo, à base de maionesesaladas é semelhante aos produtos
semi-conservados de peixe em termos de pH, temperatura, atmosfera e conservantes químicos e
uma microfluna de LAB pode se desenvolver (Delaquis et al., 1997; ICMSF, 1998) . Além disso, os sucos
de frutas, que são ricos em açúcar e têm um pH baixo (geralmente entre 2,0 e 4,5), muitas vezes estragam
devido ao crescimento de LAB e / ou leveduras (Edwards et al., 1998; Tajchakavit et al., 1998) . No suco
pasteurizado, a bactéria formadora de esporos tolerante a ácido Alicyclobacillus acideoterrestris é um
importante organismo de deterioração (Walls e Chuyate, 2000) . Diminuindo um welimina ainda mais o
crescimento bacteriano, e apenas os extremófilos (como os halófilos ou os osmófilos) e os fungos
filamentosos são capazes de se desenvolver em produtos de peixe, carne e frutas salgados e secos (Pitte
Hocking, 1997) . Assim, como o aumento de perfil preservação em força inibitória, as alterações da
microflora ao longo do percurso seguinte: não fermentativas tróficos psychro- Gram-
negativasbactérias ! bactérias Gram-negativas fermentativas !LAB ! Leveduras ! fungos filamentosos.
Produtos alimentícios de origem vegetal apresentam um caso especial devido à composição dos
nutrientes. O pH elevado permitirá que uma gama de bactérias Gram-negativas cresça, mas a deterioração
é especificamente causada por organismos capazes de degradar o polímero vegetal, a pectina (Liao, 1989;
Liao et al., 1997) . Estes organismos, tipicamente espécies de Erwinia e Pseudomonas, são o SSO de
vários produtos vegetais prontos para o consumo.
produtos organismo
Baixo Alto Aeróbico não aeróbico Baixo Alto Baixo alto Amino Simples Complexo
ácidos CHO CHO
x x x x x peixe Shewanella
Pseudomonas
x x x x x peixe Photobacterium,
Shewanella
x x x (x) x defumado LAB,
peixe Enterobacteriaceae,
Fotobactéria
x x x (x) x (x) marinado LAB, leveduras
peixe
x x x x x (x) carne Pseudomonas
x x x x x (x) carne LACA,
Enterobacteriaceae,
Brocothrix, clostridia
x x (x) (x) x (x) carne LACA,
produtos Enterobacteriaceae,
Brochotrix
x x x x x leite Pseudomonas
Bacilo
x x x x x cru Erwinia,
legumes Pseudomonas
fungos
x x x x x ovos Pseudomonas
Enterobacteriaceae
x x x x x (x) frutas leveduras
filamentoso
fungos
x x x x (x) maionese leveduras, LAB
saladas
x x x x (x) Cerveja LAB, leveduras
x x x x (x) vinho LAB, leveduras
fungos
x x x x x cereais filamentosos
fungos
x x x x x nozes filamentosos
mesa 2
Exemplos de substratos e metabolitos típicos de deterioração encontrados em alimentos estragados
microbiologicamente
Sensorial Spoilage Spoilage Comida Deterioração específica Referência
impressão produtos substrato produtos organismo
Lodo EPS sacarose Kimchi Leuconostoc Kim et al. (2001)
(dextrana)
peito de peru Leuconostoc Samelis et al. (2000)
açúcares vinho Pediococcus Walling et al. (2001)
damnosus
açúcares pão Bacilo Thompson et al. (1998)
Lodo hidrolisado pectina legumes Erwinia, Nguyen-The e Prunier (1989)
polímero Pseudomonas
Duvidoso trimetilamina trimetilamina peixe S. putrefaciens Shaw e Shewan (1968)
odor estranho (TMA) óxido (TMAO)
P. phosphoreum Dalgaard et al. (1993)
Aeromonas spp. Gram et al. (1990)
Amônia, NH 3 aminoácidos proteico muitos
pútrido alimentos microorganismos
Biogênico aminoácidos carne Enterobacteriaceae Edwards et al. (1985)
aminas e LAB
pescar um Enterobacteriaceae, Jørgensen et al. (2000b)
LAB
pescar um P. phosphoreum Jørgensen et al. (2000b)
Sulphidy H2S cisteína carne de peixe S. putrefaciens Chai et al. (1968) ,
odor estranho Herbert e Shewan (1976)
Enterobacteriaceae Dainty e Mackey (1992)
L. sake´, L. curvatus
Greening H2S cisteína carne L. plantarum Lee e Simard (1984)
Sulfidil (CH 3 ) 2 S 2 metionina carne de peixe Pseudomonas spp. Segal e Starkey (1969) ,
odores
desagradáveis Enterobacteriaceae Herbert e Shewan (1975)
Ácido ácido acético glicose, carne LAB Nassos et al. (1983)
odor estranho L, ácido D-láctico ribose,
outro CHO
''Doce proteinaceus fosfolipídio leite B. cereus IDF (1992)
coagindo '' partículas gordas
Frutado ésteres peixe P. fragi Miller et al. (1973)
odor estranho
leite P. fragi, Cormier et al. (1991) ,
P. putida e Whitfield et al. (2000)
Y. intermedia
Cheesey acetoína, diacetil, glicose carne B. thermosphacta Dainty e Mackey (1992)
odor estranho 3-metilbutanoil Enterobacteriaceae
homofermentativo
LAB
Remédio 2-metoxi-fenol, açúcares suco A. acidoterrestris
Paredes e Chuyate (2000)
odor estranho sedimento
Mofado tricloroanisol 2,4,6 vinho P. brevicompactum, Filtenborg et al., 1996
odor triclorofenol A. flavus
Uma amina biogênica pode não ser a causa da deterioração, mas pode servir como um índice de deterioração (Jørgensen et al.,
2000a) .
índice de deterioração deve ser desenvolvido. Exemplos disto incluem trimetilamina de peixe marinho
gelado. Este conhecimento também pode ser usado para eliminar um composto promotor de deterioração,
por exemplo sacarose como
ener em camarão salgado. Neste caso, o slime / ropiness é formado por Leuconostoc a partir de sacarose e
substituindo por, por exemplo, adoçantes artificiais ou álcoois de açúcar, pode impedir esta
deterioração (From, 1988) .
84L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97
4. Interações entre bactérias que estragam os alimentos
As condições seletivas impostas à comunidade microbiana de alimentos por parâmetros físicos e
químicos, conforme descrito na Tabela 1 , são sem dúvida as mais importantes em termos de crescimento
e seleção de microrganismos. No entanto, a deterioração de alimentos microbiana é um processo que
envolve o crescimento de microorganismos aos números (10 7 -10 9 cfu / g) na qual os microrganismos,
também devem ser assumidas para interagir e influenciar o crescimento de um outro (Boddy e
Wimpenny, 1992 ) . As interações entre microorganismos podem ser classificadas com base em seus efeitos
como sendo prejudiciais ou benéficas (Fredrickson, 1977).. Vários tipos de interações têm sido estudados
em ecossistemas de alimentos, incluindo tanto o comportamento antagônico e coordenado e interações onde
o crescimento ou um metabolismo particular de um organismo é favorecido pelo crescimento de outro
organismo. Esta seção fornece três exemplos de tal comportamento:
? antagonismo causado pela competição por ferro como mediada pela produção de sideróforos bacterianos e
subseqüente supressão da densidade celular máxima de bactérias menos competitivas,
? modificação no perfil de deterioração de um organismo pelo fornecimento de nutrientes de outro
microorganismo (metabiose),
? a capacidade das bactérias Gram-negativas para coordenar a expressão de certas características fenotípicas
(por exemplo, enzimas hidrolíticas) através da comunicação bacteriana via N-acilhomoserina lactonas
(AHLs).
4.1. Antagonismo
Mudanças nas condições ambientais, por exemplo, pela redução do pH, podem ser uma maneira poderosa de um
microorganismo antagonizar outras bactérias e criar uma vantagem seletiva. Além disso, a competição por nutrientes
pode selecionar os organismos mais capazes de eliminar o (s) composto (s) limitante (s). Vários microorganismos
importantes na deterioração de alimentos têm tais habilidades antagônicas. Assim, as bactérias do ácido láctico causam
um abaixamento do pH e podem produzir peptídeos antibacterianos (bacteriocinas) (Adams e Nicolaides, 1997) . As
reações de deterioração de certas bactérias Gram-negativas podem produzir NH 3 e trimetil-amina, que são tóxicas para
várias outras bactérias e, algumas vezes, para o organismo produtor.
em si. Pseudomonas spp., Em particular o grupo fluorescente, produzem uma variedade de compostos
antibacterianos e antifúngicos, tais como antibióticos e cianeto, e ao mesmo tempo competem de forma
muito eficiente pelo ferro (Ellis et al., 2000) .
As bactérias que crescem em peixes produzem sideróforos (Gram e Melchiorsen, 1996) que só são
induzidos quando a concentração de ferro é limitante. Sideróforos foram extraídos de queijos indicando
que este alimento é limitado em ferro (Ong e Nielands, 1979) . Além disso, as bactérias que estragam os
ovos devem ser capazes de eliminar o ferro das proteínas de ligação do ferro (cf. Cox, 2001 ). Pseudomonas
spp. isolados de alimentos produzem sideróforos (Gram, 1993; Cheng et al., 1995; Laine et al., 1996) , em
particular cepas isoladas de peixes (Gram, 1993; Champomier-Verge`s e Richard, 1994). Também o ferro
de quelatos de S. putrefaciens pela produção de sideróforos (Gram, 1994) , mas apesar desta capacidade, é
fortemente inibido por pseudomonads produtores de sideróforos sob condições limitadas pelo ferro (Gram,
1993) . Quando cultivada em co-culturaem amostras de peixe, pseudômonas produtoras desideróforos
inibem, por exemplo, Shewanella quando as primeiras atingem aproximadamente 10 8 ufc / ge causam
L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97 85
supressão da densidade celular máxima do organismo inibido ( Gram e Melchiorsen, 1996 ; Fig. 1 ). A depressão da
densidade celular máxima de microrganismos por uma microflora de '' crescimento excessivo '' também é observada
para Listeria monocytogenes crescendo em alimentos levemente preservados com uma flora bacteriana dominante de
ácido láctico (Grau e Vanderlinde, 1992; Nilsson et al.,
1999) . Este último fenómeno pode ser causado pela produção de bacteriocinas pela LAB, mas como vários
LAB não produtores de bacteriocina são tão inibidores (Nilsson et al., 1999) , a inibição pode também ser explicada
pela LAB competindo com a Listeria em alguns nutrientes essenciais (Buchanan e Bagi, 1997) . Esta supressão (de
densidade populacional máxima) de um
Fig. 1. A supressão da densidade celular máxima de S. putrefaciens por sideróforos produzindo P. fluorescens quando
cultivada em músculo de bacalhau a 0 jC (modificado de Gram e Melchiorsen, 1996 ).
4.2. Metabiose
Inúmeras formas de interdependência existem entre diferentes organismos. O termo metabiose descreve a
dependência de um organismo em outro para produzir um ambiente favorável. Isto pode ser a remoção de um oxigênio
por uma microflora Gram-negativa permitindo que organismos anaeróbicos como o Clostridium botulinum
cresçam (Huss et al., 1979) ou podem ser situações onde um organismo fornece nutrientes aumentando o crescimento
de outro. Assim, vários estudos têm
mostraram que, apesar da atividade inibitória das pseudomônadas descritas acima, sua presença também
pode aumentar o crescimento de alguns microrganismos. A pré-inoculação de leite com
diferentes bactérias psicrotróficas Gram-negativasresultou em maior crescimento e mais ácido de bactérias
lácticas (Cousin e Marth, 1977) e o crescimento de Staphylococcus aureus também pode ser estimulado por
Pseudomonas spp. ( Seminiano e Frazier, 1966) . Essa inter- dependência de nutrientes também pode
desempenhar um papel na deterioração dos alimentos (Dainty et al., 1986; Jørgensen et al., 2000b) .
Aminas biogênicas, que são formadas por decomposição bacteriana de aminoácidos, têm sido sugeridas
como um indicador de qualidade de carne bovina embalada a vácuo (Edwards et al., 1985) . A microflora
de deterioração deste produto consiste tipicamente de uma mistura de LAB e Enterobacteriaceae. Hafnia
alvei e Serratia liquefaciens (hoje: Serratia proteamaculans) como culturas únicas produzem níveis de
cadavarina semelhantes ao produto naturalmente contaminado, no entanto, o nível de pureza das culturas
individuais não corresponde ao produto deteriorante. Alguns LAB degradam a arginina de ornitina (que é
o pré-cursor de putrescina) e co-inoculação do formador de putrescina Enterobac- teriaceae comLAB
com degradação de argininaresultou em uma produção 6 a 15 vezes maior de putrescina do que em culturas
isoladas ( Dainty et al., 1986 ; Tabela 3 ). As mudanças nas aminas biogênicas e no pH durante o
armazenamento do salmão defumado frio embalado a vácuo podem ser combinadas a um índice de
qualidade que se correlaciona com a avaliação sensorial do produto (Jørgensen et al., 2000a) . Altos níveis
de aminas biogênicas podem ser produzidos por culturas únicas de P. phosphoreum ou por L.
curvatus (Jørgensen et al., 2000b), mas também podem surgir de co-culturas de lactobacilos e
Enterobacilos.
Tabela 3
Interação metabólica entre bactérias do ácido láctico e Enterobacteriaceae isoladas de carne embalada a
vácuo estragada (modificada de Edwards et al., 1985; Dainty et al., 1986 )
Em leite pasteurizado, tanto Enterobacteriaceae (Yerestia intermedia) como Pseudomonas putida. pode
produzir odores desagradáveis (Whitfield et al., 2000). No entanto, a quantidade de ésteres que
causam odores frutados (do tipo pinha) foi aumentada quando os dois organismos foram co-cultivados.
Espécies psicotolerantes de Clostridium foram identificadas como o agente causador da deterioração
de carnes embaladas em vácuo (Broda et al., 1996) . Até onde sabemos, não houve relatos sobre a
influência de microrganismos que interagem nesse espólio. No entanto, bactérias aeróbicas (como S.
putrefa-ciens) afetam significativamente (aumentam) a produção de toxinas pelo C. botulinum Tipo
E (Huss et al., 1979) e pode-se especular que bactérias aeróbicas na carne por meio da remoção de oxigênio
pode criar um ambiente mais vantajoso para a clostridia de deterioração psicrotrófica.
O termo “organismo específico de deterioração” foi originalmente criado para descrever a espécie
(suposta) única sendo responsável pela deterioração. Embora Jørgensen et al. (2000b) introduziram o termo
“associação de deterioração metabólica” para descrever situações em que duas ou mais espécies
microbianas contribuem para a deterioração por troca de metabólitos ou nutrientes, este cenário poderia ser
coberto pelos “organismos específicos de deterioração”. cept onde deve ser especificado que um consórcio
de organismos interage para estragar o produto.
4.3. Comunicação baseada em lactona homoserinaacilada e detecção de tremue
A expressão de muitas características fenotípicas em microorganismos é governada por regulação gênica rigorosa e
influenciada pela fase de crescimento, nutrientes, tensões externas e uma infinidade de outros fatores. Vários padrões
comportamentais estão correlacionados com a densidade da população, e a capacidade de regular a expressão gênica
em função da densidade celular foi denominada “quorum sensing” (Fuqua et al., 1994) . O sensoriamento de quorum
exige que os microorganismos sejam capazes de se comunicar por meio de sinais químicos. Os péptidos servir como
as moléculas de sinal para monitorizar o tamanho da população em muitas bactérias Gram-
positivas bactérias (Kleerebezem et al., 1997) . Nas bactérias Gram-negativas , os sinais mais intensamente estudados
são o N-acillactonas homoserinas (AHLs) (Fuqua et al., 1996; Eberl et al., 1999; Whitehead et al., 2001) (Fig.
2) . Os sistemas de detecção de quórum baseados em AHL da família lux-homologousrequerem um mínimo de quatro
componentes para o funcionamento adequado:
(i) uma molécula sinalizadora do tipo AHL difusível, sintetizada por uma enzima (denominada
homólogo);
(ii) um receptor de ligação a AHL (referido como o homólogo de LuxR) cuja actividade de ligação ao ADN é
alterada em resposta à ligação da sua molécula de sinal cognato;
(iii) uma sequência de DNA (tipicamente referida como lux-box) localizada na região promotora de um gene
alvo, atuando como seqüência alvo para o homólogo regulador de LuxR, permitindo que ele atue como
regulador transcricional; e finalmente
(iv) um conjunto de genes alvo que resulta em um fenótipo particular, que é supra- regulado ou reprimido em
função da ligação LuxR-AHL .
O quorum sensing resulta do fato de que os AHLs são difusíveis sobre a membrana celular e que
a proteína reguladora LuxR requer uma concentração de limiar dos AHLs para ser ativada. Assim, embora
as AHLs sejam produzidas em baixos níveis em culturas diluídas, a ligação à proteína receptora e a ativação
transcricional dos genes-alvo só ocorrem em altas densidades celulares. A ligação do complexo LuxR-AHL
à lux-box resulta na transcrição de genes a jusante da lux-box e esta transcrição
Fig. 2. Estrutura de lactonas homosserinas aciladas típicas. A cadeia de carbono pode variar de 4 a 14 átomos de carbono e o
terceiro átomo de carbono pode ser substituído por um grupo oxo- ou hidroxilo.
resulta em uma resposta fenotípica regulada pela AHL. Em algumas bactérias, o gene lux-homólogo está
localizado a jusante da lux-box. A produção da sintase AHL é, portanto, também regulada pelo complexo
LuxR-AHL, ou seja, é autoinduzível. Assim, a activação da proteína resulta em um reguladoras matic
dra- sobre-regulação de produção de AHL e como uma consequência fenótipos AHL regulados. Até
um aumento de 1000 vezes na atividade por célula foi relatado, por exemplo, para a produção de AHL e a
bioluminescência regulada pela AHL em Vibrio fischeri (Nealson et al., 1970; Ravn et al., 2001) . Em
outras bactérias, a produção de AHLé constitutivo e parece que a regulação para cima de fenótipos é menos
dramática (Atkinson et al., 1999; Ravn et al., 2001; Christensen et al., submetidos para publicação) .
A produção de AHLs e a regulação de diferentes características fenotípicas foram relatadas em muitas
bactérias Gram-negativas (para uma revisão recente, ver Whitehead et al., 2001 ). O sistema de quorum
sensing pode ser vantajoso para as bactérias, já que elas não gastam energia expressando fenótipos (em
baixas densidades de células) que são requeridas somente em altas densidades. Exemplos clássicos incluem
a regulação do comportamento simbiótico (por exemplo, bioluminescência em V. fischeri) ou fatores de
virulência (por exemplo, elastase em Pseudomonas aeruginosa (Passador et al., 1993) , produção de
antibiótico em Erwinia carotovora (Bainton et al., 1992) e Ti transferência de plasmídeo em
Agrobacterium tumefaciens (Zhang et al.,
1993), mas também comportamento mais complexo, como motilidade superficial e colonização de S.
liquefaciens (Eberl et al., 1996, 1999) e formação de biofilme de P. aeruginosa (Davies et al., 1998) e
Burkholderia cepacia (Huber et al. ., 2001) . A regulação dependente da densidade celular da expressão
gênica provavelmente reflete a necessidade de que o patógeno invasor atinja uma densidade populacional
crítica suficiente para sobrecarregar as defesas do hospedeiro e, assim, estabelecer a infecção. Da área
de interações planta-micróbio, um exemplo elegante foi publicado recentemente (Mae et al.,
2001) . Plantas transgênicas produtoras de N-oxoacil-homoserinalactona (OHL) apresentou resistência
aumentada à infecção por E. carotovora. As moléculas sinalizadoras originárias da planta forçam a E.
carotovora a ligar a produção de fatores de virulência à baixa densidade populacional bacteriana. A
produção de fatores de virulência provoca uma defesa vegetal que, devido à densidade bacteriana baixa e
insuficiente, empurra o equilíbrio da interação planta-patógeno na direção do aborto por infecção.
4.3.1. AHLs em alimentos e bactérias de deterioração de alimentos Como descrito acima, o organismo
específico de deterioração
Este conceito exige que seja estabelecida uma ligação entre a produção qualitativa e quantitativa de
metabolitos (deteriorantes) num organismo, o impacto destes metabolitos na impressão sensorial e o
crescimento do (s) organismo (s) em produtos naturalmente deteriorantes. Em particular, a quantidade de
metabolito por célula (por exemplo, o rendimento) é um
Tempo de
armazenamento, Presença de Aeróbico
contagem em
dias AHLs pelo placas,
Monitor TraR log (cfu / g)
tensão pZLR4
1 + 8,00
6 ++ 9,30
1 + 7,70
9 ++ 9,00
1 + 8,95
4 ++ 9,78
parâmetro importante ao avaliar a atividade de deterioração (Dalgaard, 1995) . Se o quorum sensing for
usado por bactérias Gram-negativas envolvidas na deterioração e se as AHLs (up) regularem características
relevantes para o comportamento de deterioração, tais informações são cruciais para a avaliação da
atividade de deterioração de um organismo. Nós nos propusemos a determinar se a sinalização de
AHL ocorre em alimentos durante o armazenamento e a deterioração, como a sinalização de AHL difundida
está entre as bactérias de deterioração Gram-negativas e até que ponto a sinalização de AHL desempenha
um papel na deterioração de alimentos bacterianos.
As AHLs podem ser extraídas de amostras complexas como alimentos por homogeneização em acetato
de etila. Subsequentemente, a presença de AHLs pode ser avaliada usando uma ou várias cepas
de monitoramento de AHL bacterianas (McLean et al., 1997; Shaw et al., 1997; Ravn et al., 2001) . Usando
o Chromobacterium violaceum CviR (por exemplo, monitorar a cepa CV026) e os sistemas de
monitoramento TraR do A. tumefaciens (por exemplo, monitorar cepa com plasmídeo pZLR4),
descobrimos que muitos alimentos comerciais contêm grandes quantidades de AHLs ( Tabelas 4-6 ; Gram
et al. , 1999). Vários tipos de AHLs são produzidos em alimentos e isso pode ser visualizado pela separação
de AHLs extraídos em placas cromatográficas de camada delgada e posterior desenvolvimento
por Cepas AHL-monitor , por exemplo, A. tumefaciens pZLR4 (Fig. 3) . Além disso, a produção de AHL
em alimentos pode ser visualizada diretamente usando sistemas de repórter. Se uma estirpe produtora de
AHL e uma AHL-negativo estirpe que transporta um sistema de monitor de AHL (por exemplo, o luxR-
gene e luxI-promotor fundido com a GFP-repórter gene) são co-inoculada num pedaço de carne ou de
salmão, a aparência de verde fluorescência em células bacterianas únicas na carne / salmão significa
expressão in situ de lux e, portanto, produção de AHL (Fig. 4) .
Tabela 5
Presença de AHLs em produtos de peixe, dependendo da contagem de colônias e condições de armazenamento (Rosager e
Rasmussen, 2001; Gram et al., 1999)
Produto
alimentar Armazenamento ArmazenamentoArmazenamento Presença de AHLs log (cfu / g)
temperatura atmosfera Tempo LuxR TraR Aeróbico Entero-
(jC) (dias) monitor monitor placa bacteriaceae
pSB403 pZLR4 contagem
Tabela 6
Presença de AHLs em carne de frango e carne embalada a 5ºC (Rosager e Rasmussen, 2001; Bruhn et al., 2002)
4.3.2. Um papel potencial para os AHLs na deterioração de alimentos? A mera detecção de AHLs em
alimentos antes e
durante a deterioração e nas bactérias Gram-negativasque podem estar envolvidas na deterioração não
conclusão de que a produção de AHL desempenha um papel na deterioração. Para elucidar isso, vários
arranjos experimentais podem ser buscados. Através da construção de mutantes negativos no
sinal (Christensen et al., Apresentados para publicação) , os fenótipos regulados por AHLs podem ser
identificados. Além disso, comparando o comportamento e o impacto sensorial de cepas de tipo
selvagem produtoras de AHL com mutantes não produtores de AHL , as possíveis reações de deterioração
reguladas pela comunicação AHL podem ser elucidadas.
Testes de armazenamento com brotos de feijão demonstraram que a inoculação de brotos com E.
carotovora , produtora de AHL, resulta em uma deterioração mais rápida. Atualmente, estamos estudando
o papel potencial dos AHLs nessas reações (Rasch et al., Em preparação) . Prevê-se que a principal reacção
de deterioração seja a degradação da pectina por Erwinia spp. e como a atividade pectinolítica é regulada
por AHLs em E. carotovora (Pirhann et al., 1993; Andersson et al., 2000) , a hipótese parece justificada.
Como mencionado, Enterobacteriaceae isolado de vários peixes e produtos de carne produzem
AHLs (Ravn
et al., 2001) . Estes organismos podem contribuir para a deterioração. Leroi et al. (2001) usaram
uma análise de regressão múltipla por etapas dos dados de ensaios de armazenamento
com salmão defumado frio de diferentes origens e descobriram que o prazo de validade estava
principalmente ligado à contagem inicial de Enterobacteriaceae. Quanto maior a contagem inicial no ágar
de glicose violeta vermelho, menor a vida de prateleira. Com base na produção de aminas
biogênicas, Jørgensen et al. (2000b)identificaram P. phosphoreum ou L. curvatus ou uma mistura de
Enterobacteriaceae e bactérias do ácido lático como o SSO do salmão embalado a vácuo, fumado a
frio . Além disso, embalado a vácuocarnes, a detecção de AHL está correlacionada com o número de
Enterobacteriaceae sendo superior a 10 6 ufc / g (Tabela 6) . Actualmente, não se sabe se a capacidade
destas bactérias para produzir AHLs desempenha um papel importante na deterioração de carne e peixe.
Fig. 4. Detecção in situ da produção de AHL em células bacterianas únicas na carne, avaliada pela expressão de Proteína Fluorescente Verde. O
OHHL produtor de H. alvei foi co-inoculado com um H. alvei negativo para OHHL (mutante I) portador de um sistema monitor de
AHL (promotor luxR, luxI fundido a gfp). Fluorescência verde foi detectada usando um microscópio confocal de varredura a laser (Christensen,
Ravn, Hentzer, dados não publicados).
interações. No entanto, recentemente foi demonstrado que os AHLs podem agir diretamente em organismos
eucarióticos e podem suprimir reações importantes para a resposta imune de células epiteliais (Telford et
al., 1998) . Se os AHLs puderem agir diretamente sobre as células gastro-epiteliais , essa ação pode ser um
componente ou mecanismo que facilita o ataque de patógenos de origem alimentar no tratogastrointestinal.
Até à data, pouco trabalho foi feito sobre a estabilidade e degradação de AHLs e, portanto, não se sabe o quão
estáveis estes compostos são nos alimentos e como os procedimentos de preparação de alimentos os afetam. Como
mostrado na Tabela 6 , os AHL detectados em carnes embaladas a vácuo podem desaparecer durante o armazenamento,
e Ravn et al. (em preparação ) descobriu que a degradação de AHLs de Enterobacteriaceae derivada de alimentos pode
ser facilitada pelos organismos produtores. Dois estudos recentes demonstram
que algumas bactérias são capazes de degradar as AHLs. Dong et al. (2000) demonstraram que uma enzima
de Bacillus spp. AHLs degradadas e Se´veno et al. (2001) sugeriram que uma cepa de Pseudomonas
aureofaciens degrada suas próprias moléculas sinalizadoras.
4.4. Perspectivas na preservação de alimentos
Devido ao envolvimento de AHLs na regulação de fatores de virulência em várias bactérias oportunistas humanas
e fitopatogênicas, uma intensa busca tem sido realizada nos últimos 6 anos para compostos que especificamente
poderiam bloquear a comunicação AHL. No cenário clínico, prevê-se que tais compostos possam bloquear a expressão
de virulência sem afetar o crescimento, eliminando assim o risco de desenvolvimento de resistência (Givskov et al.,
1996; Finch et al., 1998) . Tal quórum
Os inibidores de detecção (QSI) são tipicamente análogos dos AHLs (Eberhard et al., 1986) , ou compostos
que degradam os AHLs (Dong et al., 2000). Um grupo promissor de QSI são as furanonas halogenadas
produzidas pelas algas vermelhas australianas, Delisea pulchra (Givskov et al., 1996) . Essas furanonas
interferem nas proteínas receptoras e liberam o sinal AHL (Manefield et al., 1999, 2002) . O tratamento
com estes compostos reduz a expressão de factores de virulência regulados por AHL e a formação de
biofilme em eg P. aeruginosa e S. liquefaciens (Hentzer et ai., 2002; Rasmussen et ai., 2000; Givskov et
ai., 1996) . QSIs como o D. pulchra
As furanonas também podem ser usadas como conservantes de alimentos em alimentos selecionados, nos quais as
características reguladas pela AHL contribuem para a deterioração do produto. A descoberta de compostos de QSI a
partir de fontes de algas (vegetais) levanta a possibilidade de identificação de compostos activos de QSI a partir de uma
multiplicidade de organismos marinhos, bem como de alimentos naturais ou subprodutos alimentares . Estudos
recentes mostraram que vários alimentos contêm compostos de furanona com similaridade aos compostos de D. pulchra
descritos acima (Slaughter, 1999) . Os compostos QSI podem influenciar a colonização de superfícies de carne, a
formação de toxinas e talvez a proliferação bacteriana. A ocorrência natural de IQS é uma consideração importante
para a avaliação de seu status toxicológico e pode facilitar seu uso em alimentos.
5. Observações conclusivas
Muitos alimentos estragam devido à degradação microbiana, com seus metabólitos sendo a causa dos aromas
anormais ou as mudanças na textura, resultando em rejeição sensorial. Apesar da ampla gama de matérias-primas, dos
diferentes parâmetros de processamento e da diversidade de condições de armazenamento, microfloras muito similares
se desenvolverão em produtos com características físicas e químicas similares. Apenas uma fração dos microrganismos
presentes na deterioração de produtos alimentícios causa as características de deterioração. Esses organismos são
conhecidos em alguns produtos, mas é necessário muito trabalho em uma variedade de produtos alimentícios para
identificar os organismos responsáveis pela deterioração. Sob algumas condições
Fig. 5. Colônias bacterianas produtoras de AHL visualizadas por replicação a partir de uma placa TSA de uma série de diluição
de carne embalada a vácuo em A. tumefaciens pZLR4 em um meio contendo X-Gal (esquerda) e em C. violaceum
em LB 5- médio (direita) (Bruhn et al., Em preparação) .
Agradecimentos
Os autores e os estudos sobre o envolvimento dos AHLs na deterioração da qualidade dos alimentos
foram apoiados por bolsas de pesquisa do Conselho Dinamarquês de Pesquisa para as Ciências Técnicas
[no. 9700726 e 26000134] e pela Academia de Pesquisa dinamarquesa [bolsa de doutorado para
LR]. Agradecemos a Morten Hentzer pela assistência na microscopia confocal de varredura a
laser. Estendemos nossos agradecimentos a Claus Reesbøll e ao bibliotecário Søren Tørper Christensen,
que nos ajudaram a obter referências adicionais durante a revisão - para a qual recebemos apenas duas
semanas.
Referências
Adams, MR, Nicolaides, L., 1997. Revisão da sensibilidade de diferentes patógenos veiculados por alimentos à
fermentação. Food Control 8, 227 - 239.
Andersson, RA, Eriksson, ARB, Heikinheimo, R., Mane, A., Pirhanen, M., Ko-he, V., Hytiainen, H., Tuikkala, A., Tapio Palva,
E., 2000. Quorum sensing no fitopatógeno Erwinia car- otovora subsp. carotovora: O papel de expr Eclesiastes . Mol. Planta
Microb. Interagir. 13, 384 - 393.
Anonymous, 1985. Subcommittee on Microbiological Criteria: Comitê de Proteção de Alimentos; Conselho Nacional de Pesquisa
sobre Alimentação e Nutrição, uma Avaliação do Papel dos Critérios Microbiológicos para Alimentos e Ingredientes
Alimentares. National Academy Press, Washington, DC.
Atkinson, S., Throup, JP, Stewart, GSAB, Williams, P., 1999. Um sistema hierárquico de detecção de quórum em Yersinia
pseudotubercose está envolvido na regulação da motilidade e aglutinação. Mol. Microbiol. 33, 1267 - 1277.
Bainton, NJ, Stead, P., Chhabra, SR, Bycroft, BW, Salmond, GPC, Stewart, GSAB, Williams, P., 1992. N- (3-oxohex-
anoyl) - A L- homoserina lactona regula a produção de antibióticos carbapenêmicos em Erwinia carotovora. Biochem. J. 288, 997 - 1004.
Ben Embarek, PK, 1994. Segurança microbiana e deterioração de produtos sous vide fish. Tese de doutoramento, Laboratório Tecnológico do
Ministério da Agricultura e Pescas da Dinamarca e da Real Universidade Veterinária e Agrícola.
Boddy, L., Wimpenny, JWT, 1992. Conceitos ecológicos em microbiologia de alimentos. J. Appl. Bacteriol. Symp Supl. 73, 23S - 38S.
Borch, E., Kant-Muermans, M.-L., Blixt, Y., 1996. Destruição bacteriana de carne e produtos cárneos curados. Int. J. Food
Microbiol. 33, 103 - 120.
Broda, DM, DeLacey, KM, Bell, RG, Penney, N., 1996. Associação de Clostridium spp. com deterioração profunda do tecido
do cordeiro refrigerado a vácuo . Int. J. Food Microbiol. 29, 371 - 378.
Bruhn, JB, Ravn, L., Christensen, AB, Givskov, M., Gram, L., 2002. Lactonas homoserinas aciladas isoladas de carnes cheias
com vácuo e identificação de bactérias produtoras de AHL (em preparação).
Buchanan, RL, Bagi, LK, 1997. Competição microbiana: efeito das condições de cultivo na supressão de Listeria monocyto-
genes Scott A por Carnobacterium piscicola. J. Food Prot. 60, 254 - 261.
Chai, T., Chen, C., Rosen, A., Levin, RE, 1968. Detecção e incidência de bactérias de deterioração específicas em peixe. II. Incidência relativa de
Pseudomonas putrefaciens e pseudo-monadadas fluorescentes em filetes de hadoque. Appl. Microbiol. 16, 1738 - 1741.
Champomier-Vergeys, M.-C., Richard, J., 1994. Atividadeantibacteriana entre cepas de Pseudomonas de origem
cárnea. Lett. Appl. Microgiol. 18, 18 - 20.
Cheng, C.-M., Doyle, MP, Luchansky, JB, 1995. Identificação de cepas de Pseudomonas fluorescens isoladas de carne de porco e frango crus que
produzem sideróforos antagônicos aos patógenos de origem alimentar. J. Food Prot. 58, 1340 - 1344.
Christensen, AB, Riedel, K., Ravn, L., Eberl, L., Molin, S., Gram, L., Givskov, M., 2002. Regulação da produção e secreção de proteínas por
lactonas homoserinas aciladas em proteases de Serratia. maculans B5a. (enviado para publicação).
Cormier, F., Raymond, Y., Champagne, CP, Morin, A., 1991. Análise de voláteis odor-ativos de Pseudomonas fragi crescidos
em leite.
Cousin, MA, Marth, EH, 1977. Produção de ácido lático por Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus em leite pré-
cultivado com bactérias psicrotróficas. J. Food Prot. 40, 475-47.
Cox, JM, 2001. Ovos e ovoprodutos. Em: Moir, CJ, Andrew-Kabilafkas, C., Arnold, G., Cox, BM, Hocking, AD, Jenson, I. (Eds.), Spoilage de
Alimentos Processados: Causas e Diagnóstico. AIFST, Southwood Press, Nova Gales do Sul, Austrália.
Crosa, JH, 1997. Transdução de sinal e controle transcipcional e pós-traducional de genes regulados por ferro em bactérias. Micro-
biol. Mol. Rev. 61, 319 - 336.
Dainty, RH, Mackey, BM, 1992. A relação entre as propriedades fenotípicas das bactérias da carne armazenada refrigerada e os
processos de deterioração. J. Appl. Bacteriol. Symp Supl. 73, 103S - 144S.
Dainty, RH, Edwards, RA, Hibbard, CM, Ramantanis, SV,