Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de análisis

Docente responsable de la práctica:

Q.F.I. Fernández López Francisco

Alumno:
López Portillo Felipe de Jesús

Práctica:
“Separación de una mezcla de dos aminoácidos por cromatografía por
intercambio iónico”.

Grupo: 5QM2 Sección: 3

Fecha de entrega: 10 de abril, 2018.

Objetivos.
 Emplear la técnica de intercambio iónico para la separación de dos aminoácidos.
 Comprobar la separación mediante una reacción colorida y el perfil de elución.

Fundamento.

Las separaciones de intercambio iónico se llevan a cabo con materiales especiales de estructura porosa e
insoluble. Estos materiales contienen grupos reactivos que están asociados a iones lábiles capaces de
intercambiarse con los del medio que los rodea. El intercambio de iones es el único fenómeno que ocurre en el
material durante todo el proceso cromatográfico, que invariablemente tiene lugar en medio líquido
(generalmente acuoso). Como su nombre indica, la cromatografía de intercambio iónico se emplea en la
separación de sustancias iónicas, tanto orgánicas como inorgánicas, de poli electrólitos, como enzimas,
proteínas, hormonas, virus, ácidos nucleicos y otras sustancias biológicamente importantes. Generalmente se
emplean tres tipos de materiales: resinas, geles y celulosas de intercambio iónico. Sobre la base de la resina
se introducen grupos fuerte o débilmente ácidos (cambiadores catiónicos) o básicos (cambiadores aniónicos).
Los dos ejemplos se representan en la imagen 1.

El ejemplo representado en la imagen 1(a), es una resina catiónica fuerte, ya que el grupo sulfónico -S03H
confiere extraordinaria acidez a la resina. En este caso los iones hidrógeno (H+) son los únicos capaces de
intercambiarse. Análogamente, en el ejemplo representado en la imagen 1(b), la resina matriz contiene un
grupo hidróxido de amonio cuaternario -N(CH3)3 + OH -, siendo los iones hidroxilo los únicos capaces de
intercambiarse. La reacción entre resina catiónica R -H+ y los iones sodio sería:

mientras que la de la resina anicónica con el ion cloruro sería:

Teóricamente cualquier tipo de ion que contenga la resina podría cambiarse. Sin embargo, desde el punto de
vista práctico, las formas que se emplean habitualmente son la ácida (H+) y la sódica (Na+), en resinas
catiónicas, y en las aniónicas el ion cloruro (Cl-) o el hidroxilo (OH'). Para pasar de una forma a otra, la resina
se lava con un gran exceso de solución concentrada que contiene él ion apropiado, que dirige el equilibrio en
la dirección deseada. Así, para convertir una resina de la forma sódica a la forma ácida, se lavaría sencillamente
con un ácido fuerte en exceso.

Imagen 1
Resultados.

Tabla 1. Separación de histidina y prolina: Absorbancias representadas (400 y 570 nm) en la elusión de la
mezcla de aminoácidos.
Volumen de elución (mL) A400 A570
3 0
6 0.015
9 0.07
12 0
15 0.056
18 0.371
21 0.506
24 0.569
27 0.516
30 0.485
33 0.449
36 0.371
39 0.299
42 0.210
45 0.288
48* 0.216 0.121
51 0.287 0.194
54 0.170
57 0.149
60 0.158
63 0.217
66 0.257
69 0.331
72 0.407
75 0.477
78 0.584
81 0.726
84 0.885
87 0.776
90 0.911
93** 0
96 1.006
99 1.032
102 0.904
105 0.698
108 0.587
111 0.332
114 0.222
117 0.118
120 0.080
123 0.078
126 0.060
129 0.024
132 0.041
135 0.033
*: A partir del volumen de elución a 48 mL se realizó el intercambio de fase la fase móvil de pH 5.25 a pH 2.0
**: Dato eliminado.
 Figura 1. Perfil de elución de la mezcla de aminoácidos: La línea azul representa el perfil de elución de la
prolina a A400 así mismo la línea naranja representa la elusión de la histidina a A570.

1.2

0.8
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Volumen de elucion (mL)
A400 nm A570 nm

Cuestionario.

I. ¿Cuál de los aminoácidos eluyó primero? Explique.

La prolina ya que un aminoácido que no tiene carga neta a un pH equivalente a su punto isoeléctrico (es decir
a pH de entre 2.00 y 10.66 tiene carga neta de 0) no puede interactuar con la matriz o fase estacionaria cargada,

II. ¿Cuál es la importancia de regular la velocidad de elución que pasa a altas y a bajas
velocidades?
A una mayor velocidad los aminoácidos no logran interactuar debidamente con la matriz teniendo la posibilidad
de que no se separen correctamente, a la inversa, a una menor velocidad se obtiene menor cantidad de los
aminoácidos separados.
 III. Empleando las fórmulas de los aminoácidos y del grupo funcional del intercambiador, haga un
esquema de cómo se produjo la separación. Considere el cambio de pH en el medio.

Imagen 2. Polina: Estructura, carga neta y pKa del aminoacido.

Imagen 3. Histidina: Estructura, carga neta y pKa del aminoacido

Imagen 4. Principios basicos de la cromatografıa de intercambio iónico.

Debido a su na turaleza, los contraiones desplazan de la matriz a los grupos
funcionales cargados. De manera que en la cromatografıa de intercambio
anionico, la fase estacionaria (usualmente una matriz porosa) desplaza a
grupos funcionales cargados positivamente con contra-aniones que pueden
ser desplazados por un soluto anionico. En contraste, en la cromatografıa de
intercambio cationico, la fase estacionaria desplaza a grupos funcionales
cargados negativamente con la ayuda de contra-cationes que son
desplazados por un soluto catiónico. Dependiendo de la elucion del pH (5.25
y 2.00) se separaran las proteinas en la matriz en funcion de su pKa (Imagen
2 e Imagen 3).
Discusión.

En una separación utilizando la cromatografía de intercambio iónico (Ion Exchange Chromatography, IEC), las
interacciones hidrofóbicas reversibles entre los solutos son controladas con el objetivo de favorecer la unión o
elución de moléculas especıficas logrando su separación. Una proteína que no tiene carga neta a un pH
equivalente a su punto isoeléctrico (pI) no podrá interactuar con la matriz o fase estacionaria cargada. Sin
embargo, a un pH por encima de su punto isoeléctrico una proteína podrá ligarse a una matriz cargada
positivamente o intercambiador anionico mientras que a un pH por debajo de su pI una proteína podrá
unirse a una matriz cargada negativamente o intercambiador catiónico.2 Para determinar la resina que se
empleo es importante determinar los pI de la histidina y de la prolina (7.59 y de 6.30 respectivamente), además,
es importante mencionar que se usaron dos reguladores, primero a pH de 5.25 y posteriormente a pH de 2.0
para llevar acabo la elución (un pH debajo de su punto isoeléctrico). Esto significa que un aminoácido podrá
unirse a una matriz cargada negativamente. La resina empleada es el intercambiador 1 de Merck según el
manual de prácticas que contiene en la resina ácido sulfúrico (-S03H+).
Como se mencionó anteriormente la primera elución se logró a un pH de 5.25 a dicho pH primero se separa la
prolina ya que un aminoácido que no tiene carga neta a un pH equivalente a su punto isoeléctrico (es decir a
pH de entre 2.00 y 10.66 tiene carga neta de 0) no puede interactuar con la matriz o fase estacionaria cargada,2
a diferencia de la prolina (Imagen 2), la histidina tiene carga neta de +1 a un pH entre 1.82 y 6.00 por lo que
queda “retenida” en la matriz. El pH de la fase móvil puede ser alterado para favorecer la adsorción o elución
de las proteínas. En general el valor del pH es elegido de manera que permita la unión reversible de la proteína
(elución escalonada) de interés a la matriz o fase estacionaria. Esto es usualmente alrededor de 1 unidad arriba
o abajo del pI de la proteína (cambiando lentamente el pH).1, 2 Por el contrario al no cambiar de forma
escalonada el pH (como sucede en este ensayo) el exceso de protones (a pH de 2.00) podría desplazar por
gradiente el aminoácido restante (histidina, imagen 3) eluyendo de esta forma el mismo.
Es imposible llevar a cabo un análisis químico libre de errores e incertidumbres. Toda medición está bajo la
influencia de un gran número de incertidumbres, las cuales se combinan para producir una dispersión en los
resultados.3 Un paso crítico la realización de la práctica es coloar la ninhidrina al 0.2% y colocando 1 mL de las
fracciones a un tubo evitando contaminar, la medición al pipetear y transferir volúmenes, incrementa la
posibilidad de cometer algún error en la medición, la percepción en el nivel de la muestra con respecto a la
graduación de la pipeta y el mal manejo del material influye, ya que todos los materiales de medida están sujetos
a este tipo de errores.3 Por otro lado, los errores causados por el analista, son difíciles de detectar y rectificar,
estos pueden haberse originado como consecuencia de malas condiciones de trabajo o el seguimiento
incorrecto del protocolo, generando así las variables en los resultados.3 Por lo anterior en la Figura 1 se tuvo
que eliminar el resultado referente a los 93 mL de la elución debido a que se obtenía un valor que no coincidía
con los demás valores para obtener de esta manera el perfil de elución de la mezcla de aminoácidos, de esta
manera se logra comprobar la separación de los aminoácidos.

Conclusiones.

 Se empleó la técnica de intercambio iónico para la separación de dos aminoácidos.

 Se separaron los aminoácidos y se comprobó mediante una reacción colorida y el perfil de elución.
Bibliografía.

1. Galavovsky, L. (2011). Quimica organica: Fundamentos teorico-practicos para el laboratorio. Buenos

Aires: EUDEBA. Pág(s) 200-210
2. Mayolo, K. Martinez, L. Técnicas cromatograficas y su aplicación a estudios de cambios ´
conformacionales, estabilidad y replegamiento de proteinas. México: Tecnológico de Monterrey.
Revista Mexicana de Ingeniería Química. Vol. 11, No. 3 (2012) 415-429
3. Scoog, D. West, D. (2015). Fundamentos de química analítica. México: Cengage Learning. Pág(s)
709-710.