Presentación

En el presente informe hablaremos sobre la absorción

atómica, la cromatografía, la electroforesis capilar y el
espectrómetro de masas
Acerca de la absorción atómica tenemos los siguientes temas:
los principios en los que se basa, las técnicas analíticas que
utiliza y sus aplicaciones analíticas
Acerca de la cromatografía tenemos: tipos de cromatografía,
principios de las diversas técnicas cromatografías,
aplicaciones de las diversas técnicas.
Acerca de la electroforesis capilar tenemos: la historia de la
electroforesis, las técnicas electroforéticas, las ventajas de la
electroforesis.
Acerca del espectrómetro de masas tenemos: fundamento
teórico del espectrómetro de masas, la instrumentación en el
espectrómetro de masas y los componentes principales del
espectrómetro de masas.
 ABSORCIÓN ATÓMICA
I. INTRODUCCIÓN:
Los principios teóricos de la absorción atómica fueron establecidos
en 1840 por Kirchhoff y Bunsen en sus estudios del fenómeno de
auto absorción en el espectro de los metales alcalinos y alcalinos
térreos.
La base de la espectroscopia de absorción atómica (EAA) la entregó
Kirchhoff al formular su ley general: “cualquier materia que pueda
emitir luz a una cierta longitud de onda también absorberá luz a esa
longitud de onda”. El significado práctico de esto fue recién
desarrollado en 1955 por el australiano Walsh, apareciendo los
primeros instrumentos comerciales a principios de 1960.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

2.1. ¿QUÉ ES LA ABSORCIÓN ATÓMICA?
Al suministrar una determinada cantidad de energía a un
átomo cualquiera en estado fundamental (Eo), ésta es absorbida
por el átomo de tal forma que se incrementará el radio de giro
de sus electrones de la capa externa llevando al átomo a un
nuevo estado energético (E1) que llamamos excitado.

Cuando éste vuelve a su estado fundamental, cede una

cantidad de energía cuantitativamente idéntica a su energía de
excitación, emitiendo radiaciones a longitudes de onda
determinadas.
 Cuando los átomos en estado fundamental se encuentran con
las mismas radiaciones que ellos mismos son capaces de emitir,
se produce una absorción de las mismas, desplazándose el
equilibrio hacia la izquierda y pasando los átomos del estado
fundamental al excitado. El fenómeno de absorción de
radiaciones a determinadas longitudes de onda en el caso
particular en que el medio absorbente sean los átomos en
estado fundamental, se conoce como Espectroscopia de
Absorción Atómica (EAA) o Absorción Atómica (AA).

2.2. ¿EN QUÉ PRINCIPIOS SE BASA?

La técnica hace uso de la espectrometría de absorción para
evaluar la concentración de un analito en una muestra. Se basa
en gran medida en la ley de Beer-Lambert. En resumen, los
electrones de los átomos en el atomizador pueden ser
promovidos a orbitales más altos por un instante mediante la
absorción de una cantidad de energía (es decir, luz de una
determinada longitud de onda). Esta cantidad de energía (o
longitud de onda) se refiere específicamente a una transición de
electrones en un elemento particular, y en general, cada
longitud de onda corresponde a un solo elemento.
Como la cantidad de energía que se pone en la llama es
conocida, y la cantidad restante en el otro lado (el detector) se
puede medir, es posible, a partir de la ley de Beer-Lambert,
calcular cuántas de estas transiciones tienen lugar, y así
obtener una señal que es proporcional a la concentración del
elemento que se mide.
LEY DE BEER-LAMBERT
La absorbancia de radiación electromagnética producida por
una especie absorbente es directamente proporcional a la
trayectoria de la radiación a través de la solución y a la
concentración de la disolución muestra que produce la
absorción

A=abc

 a = absortividad, (ε= absortividad molar)

Es una propiedad de la materia relacionada únicamente
con la naturaleza de la misma.
a cuando la concentración está en mg/L.
ε cuando la concentración está en mol/L.
 b = Trayectoria de la radiación a través de la muestra (cm)
 c = concentración (mg/L ó mol/L)
Muchos compuestos absorben luz ultravioleta (UV) o visible
(Vis). El diagrama de abajo muestra un rayo de radiación
monocromática de poder radiante P0, dirigido a la solución
muestra. La absorción ocurre y el rayo de radiación de salida
tiene el poder radiante P.

 Un haz de radiación paralela de potencia P0.

 Una capa de solución de b cm de espesor.
 Una especie molecular de concentración c, que absorbe
radiación.
 Como consecuencia de la absorción de radiación, la
potencia del haz disminuye de P0 a P.
  Transmitancia (T):
Es la fracción de radiación incidente transmitida por la
solución, T=P/P0, expresada en tanto por uno.
 Absorbancia (A):
Es la fracción de radiación incidente absorbida por la solución,
expresada como: A = -log T = -log (P/P0) = log (P0/P) = log 1/T
Si: T se expresa en %,
T % = 100 P/P0
A = log100/T%= 2 -logT%.

2.3. ¿CUÁLES SON LAS TÉCNICAS ANALÍTICAS QUE USA?

El empleo de la espectrofotometría de absorción atómica (EAA)
es el método analítico de elección para el análisis de trazas de
metales pesados y metaloides en diversas matrices (fluidos
biológicos, alimentos, alimentos, filtros de captación ambiental,
etc.) Esta técnica, por tanto, permitirá valorar el grado de
contaminación medioambiental, la exposición a determinados
tóxicos industriales en un colectivo de trabajadores, el nivel de
metales en un alimento, etc.
Para el análisis concreto de cada uno de los contaminantes se
emplean diferentes técnicas analíticas:

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

CON GENERADOR DE HIDRUROS:
Introducción.
Hay algunos elementos que son difíciles de volatilizar con
una llama o un horno. Para estos elementos se utiliza la
técnica de generación de vapor, ya sea formando el hidruro
metálico del elemento (As, Bi, Sb, Sn, Se y Te) o
directamente vapores como en el caso del Hg. La
generación de vapor aumenta la sensibilidad de la técnica
de absorción atómica, especialmente en estos elementos
que tienen importancia como contaminantes ambientales
o en toxicología.
Hay dos métodos a través de los cuales se puede formar
un hidruro:
1. El método del borohidruro de sodio, NaBH4, que
implica la reacción del elemento analito, en una
solución ácida, con el NaBH4 para formar hidruros
gaseosos del elemento en estudio.
2. El método del cloruro estaño II, SnCl2, en el cual se
agrega K2Cr2O7 a la muestra. La solución obtenida
reacciona con el SnCl2 que está en medio ácido para
formar el hidruro gaseoso del elemento de interés.

Una vez formado el hidruro gaseoso, éste es separado

de la solución y transportado por un gas portador
hasta una celda de cuarzo, donde es calentado
produciéndose la descomposición térmica
(atomización). Como la celda está en el paso óptico de
la radiación emitida por la lámpara de cátodo hueco,
se produce una absorción de la luz por parte de los
átomos del analito que será proporcional a su
concentración.
El éxito de la técnica se basa en dos características:
1. Separa efectivamente el elemento analito de su matriz
química, eliminando así el efecto de interferencias de
matriz en el proceso de atomización y disminuyendo
la absorción de fondo.
2. Proporciona un medio más eficiente de atomización
para estos elementos que la absorción atómica
convencional.
Diagrama esquemático del generador de hidruro GBC.
El generador de hidruros HG3000 es un sistema que
genera un flujo continuo de vapor (ver Figura). Consta de
una bomba peristáltica que continuamente bombea
muestra y reactivos a un tubo manifold (tubo múltiple)
donde se produce la mezcla. La solución mezcla fluye a
través de un tubo serpentín donde se forma el hidruro del
elemento junto con hidrógeno. Con la ayuda del gas
portador (Ar o N2) el hidruro (junto con el hidrógeno) entra
a un recipiente separador gas-líquido donde el hidruro
gaseoso es removido de la solución.
El gas inerte que se usa debe ser de una alta pureza y a
una presión regulada de 30-60 psi (225-455 Kpa). El flujo
de gas durante la medición debe ser, para el método del
borohidruro de sodio, desde el separador gas-líquido de 30
ml/min.
En general en el proceso de generación de hidruros, la
máxima sensibilidad se obtiene cuando el elemento analito
está en un estado de oxidación particular. Por eso la
muestra, los estándares y el blanco deben ser tratados
previamente de tal manera de llevar todo el analito al
estado de oxidación apropiado (por ejemplo, el As+5 a As+3).
El Cu y el Sn son fuertes interferentes de la generación de
hidruros. El KI que se usa en la determinación de As y Sb
acelera la de-vitrificación de la celda de cuarzo.
Cuando se analizan muestras que contienen especies
fuertemente interferentes debe lavarse el sistema haciendo
bombear HCl 50 % por 20 segundos entre muestras.
Reactivos:
Todos los reactivos usados deben ser de alta pureza, lo
mismo que el agua destilada, para minimizar la absorción
del blanco (dan absorbancias altas y por lo tanto la señal
de ruido es alta). Debido a la naturaleza química del
proceso de generación de hidruros, la exactitud y precisión
del análisis son críticamente dependientes de la pureza de
los reactivos, de la preparación de la muestra, del proceso
de digestión y de los procedimientos analíticos en general.
Los límites de detección que se logren estarán
determinados por estas variables.
- Solución de borohidruro de sodio al 0,6 % p/v.
Disolver en agua destilada 3 g de NaBH4 junto con 3
g de NaOH. Aforar a 500 ml y filtrar a través de papel
filtro Watman Nº 2, directamente a la botella
correspondiente. Esta solución es inestable y se
descompone lentamente durante su almacenaje, por
lo que se recomienda que no tenga más de 3 – 4 días
desde su preparación.
- Ácido clorhídrico concentrado, aproximadamente 36
%. Existen algunas calidades de HCl que contiene As
como impurezas. El HCl que se use debe tener un
contenido de As cercano al límite de detección, es
decir menor que 1 ppb.
Determinación de Arsénico
La eficiencia del proceso de generación de hidruros
depende fuertemente del estado de oxidación de los iones
de As presentes. Normalmente el arsénico está presente
como As+3 y As+5. La sensibilidad analítica del As+3 es el
doble de la del As+5, por lo que antes de la medición todo
el As debe ser reducido a As+3. La reducción se logra
acidificando la muestra y estándares con HCl concentrado
de tal manera de tener una concentración de 2 molar y
agregando, además, 0,1 % de KI. Se deja reposar 1 hora
para permitir la reducción completa del arsénico, a
temperatura ambiente. Después de introducir la muestra
al sistema hay que dejar que éste se estabilice por 60
segundos antes de hacer la lectura.
Procedimiento para arsénico.
- A partir de una solución de estándar de 1000
ppm de As preparar una de 10 ppm y luego de
ésta última una de 100 ppb.
- De la solución de 100 ppb preparar una curva de
calibración, en matraces aforados de 100 ml, que
contenga 0 – 5 - 10 y 15 ppb de As.
- Paralelamente tomar un volumen adecuado de
muestra y llevar a un matraz aforado de 100 ml.
- Agregar a cada matraz 0,1 g de KI y HCl conc. de
tal manera de obtener una solución de
concentración de 2 M y aforar a volumen con
agua destilada (ej. para un HCl 36 %, d. 1,18
g/ml hay que agregar 17 ml).
 - Dejar reposar a temperatura ambiente por 1
hora para permitir la reducción completa del
arsénico.
- Instalar el generador de hidruro, según
indicaciones del profesor.
- Aspirar simultáneamente, desde sus respectivos
envases, solución de borohidruro de sodio 0,6 %;
HCl concentrado y la muestra ya tratada.
Determinación de mercurio
El Hg es un metal volátil y puede cuantificarse de esta
forma mediante la técnica del vapor frío. El Hg iónico
puede también determinarse de esta forma. El Hg enlazado
orgánicamente debe ser previamente digerido con una
mezcla de KMnO4-H2SO4. El mercurio es el único elemento
que a temperatura ambiente es capaz de generar átomos
en estado fundamental que son las especies requeridas
para la absorción atómica.
La técnica del vapor frío sólo detecta mercurio en la forma
iónica y la sensibilidad y reproducibilidad son mejoradas
si las muestras (y estándares) son acidificadas con HCl
concentrado para dar finalmente una concentración de 3
M. Altas concentraciones de HNO3 disminuirán la
sensibilidad analítica.
El método consiste, primero, en reducir los iones Hg a Hg
metálico con el NaBH4 en medio de HCl. El Hg metálico al
estado de vapor es transportado después por el gas
portador hasta la celda cerrada de cuarzo, donde se
atomiza a temperatura ambiente, por eso no se usa llama.
El tiempo de respuesta es más lento para el Hg que para
los elementos que forman hidruros, por lo que debe dejarse
unos 60 seg. o más antes de tomar las lecturas.
Procedimiento para mercurio.
- A partir de una solución de estándar de 1000 ppm de
Hg preparar una de 10 ppm y luego de ésta última
una de 100 ppb.
- De la solución de 100 ppb preparar una curva de
calibración, en matraces aforados de 100 ml, que
contenga 0 – 1 – 2 y 3 ppb de Hg.
- Paralelamente tomar un volumen adecuado de
muestra y llevar a un matraz aforado de 100 ml.
- Agregar a cada matraz un volumen de HCl
concentrado de tal manera de obtener una solución
de concentración de 3 M.
- Instalar el generador de hidruro, según indicaciones
del profesor.
- Aspirar simultáneamente, desde sus respectivos
envases, solución de borohidruro de sodio 0,6 %; HCl
concentrado y la muestra ya tratada.
- Leer las absorbancias de la muestra y de los
estándares (sin usar llama).

- Informar concentración de Hg presente en la muestra.

Precauciones
- La preparación de muestras y reactivos implica el uso
de ácidos y bases fuertes, por lo que se deben
manipular con cuidado y bajo campana.
- Antes de bombear la muestra y estándares con el
generador se debe chequear cualquier posible fuga en
las conexiones que van y salen de la bomba y de los
capilares y reemplazar las tuberías dañadas.
- Ventilar el área de trabajo usando el extractor de tal
manera de remover los dañinos y corrosivos vapores
de HCl que se forman como subproducto de la
reacción de generación de hidruros.
- La llama usada en absorción atómica produce calor,
vapores y algunos compuestos tóxicos desde la
muestra analizada.
ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA
CON HORNO DE GRAFITO:
Espectrometría de absorción atómica de horno de grafito
(GFAAS) es también conocido como espectrometría de
absorción atómica electrotérmica (ETAAS). La técnica se
basa en el hecho de que los átomos absorben la luz en las
frecuencias o longitudes de onda característica del
elemento de interés (de ahí el nombre de la espectrometría
de absorción atómica).
Dentro de ciertos límites, la cantidad de luz absorbida se
puede correlacionar linealmente con la concentración de
analito. Los átomos de la mayoría de elementos pueden ser
producidos a partir de las muestras mediante la aplicación
de altas temperaturas. En GFAAS, las muestras se
depositan en un tubo de grafito pequeña, que puede ser
calentado para vaporizar y atomizar el analito.
Un horno de grafito ideal debe cumplir los siguientes
requisitos:
 Una temperatura constante en el tiempo y el espacio
durante el intervalo en que los átomos libres se
producen
 La formación de átomos cuantitativos
independientemente de la composición de la muestra
 Control por separado de la volatilización y procesos
de atomización
 Alta sensibilidad y buena límites de detección; un
mínimo de interferencias espectrales
COMPONENTES DEL SISTEMA:
Los instrumentos de espectrometría GFAA tienen las
siguientes características básicas:
1. Una fuente de la luz (lámpara) que emite la línea
radiación de la resonancia.
2. Un compartimiento de la atomización (tubo del
grafito) en el cual se evapora la muestra.
3. Un monocromador para seleccionar solamente una
de las longitudes de onda características (visibles o
ultravioletas) del elemento del interés.
4. Un detector, generalmente un tubo del
fotomultiplicador (detectores ligeros que son útiles en
usos de la bajo-intensidad), que mide la cantidad de
absorción.
5. Un sistema del procesador de la señal (impresora, o
indicador digital).

MODO DE EMPLEO:
Las muestras diluidas en agua se acidifican (generalmente
con HNO3) a pH 2,0 o menos. La decoloración de la
muestra indicará la presencia de metales. Después de
acondicionar y calibrar el instrumento, se coloca una
pequeña alícuota - menos 100 microlitros (µL)
generalmente 20 µL-, manual o con un equipo
automatizado, en la apertura del tubo de grafito. Se
evapora la muestra en el tubo calentado; el monto de
energía lumínica absorbida en el vapor es proporcional a
las concentraciones atómicas. El análisis de cada muestra
toma de 1 a 5 minutos, y los resultados es el promedio de
análisis por triplicado.
ATOMIZACIÓN
Para realizar una medida es necesario aumentar
progresivamente la temperatura para atomizar el
analito y medir la luz que absorbe. Para ello
aumentamos primero la temperatura hasta unos
100ºC para evaporar el disolvente y secar la muestra.
A continuación, la temperatura aumenta hasta unos
500ºC para que la matriz orgánica de la muestra se
calcine y evapore evitando así que interfiera con la
medida. Aumentando la temperatura se consigue la
atomización del analito (en este momento se realiza la
medida).
 Por último, aumentamos la temperatura
bruscamente para eliminar cualquier residuo de la
muestra y dejar el tubo de grafito listo para la
siguiente medida. En todo momento (excepto cuando
se esté realizando la medida) irá pasando una
corriente de Argón para ir eliminando los vapores que
se van formando.
MODIFICADORES DE MATRIZ
El uso de modificadores de matriz aumenta la
volatilidad de la matriz de la muestra y evita la
volatilización prematura del elemento a analizar
debido a las altas temperaturas a las que ocurre la
mineralización. Con el uso del modificador se
optimizan las condiciones de análisis y se mejoran los
límites de detección del instrumento.
Un ejemplo es la determinación del Cadmio. El
Cadmio tiene una temperatura de ebullición de
768ºC, pero con el modificador se volatiliza a 1630ºC.
Este cambio de temperatura permite eliminar toda la
matriz sin que se elimine el cadmio
APLICACIONES ANALÍTICAS:
Clínicos y biológicos: sangre, orina, líquido sinovial.
Las muestras ambientales: aguas naturales,
sedimentos, materiales vegetales.
Materiales industriales: aceros, productos
derivados del petróleo.
CONCLUSIÓN
Esta técnica es muy útil, ya que permite utilizar pequeñas
cantidades de la muestra para la determinación de trazas
de elementos en diferentes tipos de sustancias como en los
alimentos, orina, aguas y petróleos. Además, tiene bajo
costo y tiene pocas interferencias espectrales a la hora del
análisis.

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA EN

VAPOR DE FRÍO:
Para el análisis de Mercurio:
La espectrofotometría de absorción atómica por llama
directa (FAA), es una técnica analítica que permite
detección y la cuantificación de metales en solución. Esta
técnica está indicada para determinar elementos alcalinos,
alcalinotérreos y metales pesados presentes en cualquier
tipo de muestra susceptible de ser disuelta. La
espectrofotometría de absorción atómica está
fundamentada en la capacidad que tienen los elementos,
en su estado atómico basal, de absorber radiación
electromagnética a longitudes de onda específicas para
cada elemento. La cantidad de energía absorbida es
directamente proporcional a la concentración de los
átomos del metal analizado, de acuerdo con la Ley de
Lambert-Beer. Los límites de detección logrados son del
orden de ppm (partes por millón). En esta técnica, los
metales disueltos son llevados a su forma atómica
elemental mediante calentamiento por una llama generada
por una mezcla de gases combustibles. Las mezclas más
empleadas son: aire-acetileno y óxido nitrosoacetileno. Las
temperaturas de la llama van de 1900 °C a 2800 °C. Los
átomos en forma de nube gaseosa, son irradiados por un
haz de luz de una longitud de onda específica, de acuerdo
con el metal analizado; esto se logra mediante el empleo de
lámparas con cátodo del metal de interés o con lámparas
de descarga sin electrodo. Los átomos absorben una
fracción de la radiación proveniente de la lámpara y la
fracción restante es captada por un fotodetector y un
dispositivo transductor, que la convierten en una señal
eléctrica, que posteriormente es registrada por un
software. Como se mencionó anteriormente, el valor de
señal obtenido es proporcional a la concentración de los
átomos presentes en la nube de gases; de este modo es
posible construir una curva de calibración analizando
soluciones patrón de concentración conocida y midiendo
la magnitud de la absorción de cada una de ellas. Un caso
particular en la técnica de absorción atómica lo constituye
el mercurio, ya que, gracias a su volatilidad, no requiere el
uso de llama para atomizarse y puede determinarse en
forma de vapor frío. Mediante esta técnica se alcanzan
límites de detección del orden de 1 ppb. La determinación
se realiza adicionando un agente reductor (cloruro
estañoso o borohidruro de sodio), al digerido. La reacción
del mercurio en solución con el agente reductor produce
mercurio atómico muy volátil. El vapor de mercurio es
conducido hacia una celda colocada en el paso del haz de
luz, donde ocurre la interacción entre los átomos de
mercurio y la radiación, produciéndose la absorción.
 El mercurio tiene la inusual propiedad (para ser un metal)
de que no se oxida fácilmente por el aire y, además, tiene
una apreciable presión de vapor a temperatura ambiente.
Por ello, la determinación de mercurio combinado consiste
en originar iones Hg2+, lo cual, cuando se trata de
compuestos orgánicos, se consigue por tratamiento con un
oxidante (MnO4–) y posterior reducción a Hgo con una sal
de Sn2+ (después de haber eliminado el exceso de
oxidante).
Hg—R + oxidante (MnO4 –) —> Productos + Hg2+
Hg2+ + Sn2+ —> Hgo + Sn4+
El mercurio metálico originado es arrastrado por un gas
portador hacia el camino óptico del aparato de absorción
atómica, midiendo la absorbancia a 263.7 nm, sin
necesidad de llama ni atomización electrotérmica. Se
consiguen límites de detección de 0.002 ng/ml,
habiéndose diseñado sistemas automáticos para llevar a
cabo esta determinación.

III. PARTES DEL INSTRUMENTO:

Un espectrómetro de absorción atómica de llama consta de la
siguiente instrumentación básica necesaria para poder realizar
medidas de absorción:
a) Fuente de radiación:
Las fuentes de radiación empleadas en el espectrofotómetro de
absorción atómica deben originar una banda estrecha, de
intensidad adecuada y estabilidad suficiente, durante períodos
de tiempo prolongados. Las más comúnmente utilizadas son las
lámparas de cátodo hueco. Estas lámparas están constituidas
por un cátodo metálico capaz de emitir radiaciones de las
mismas longitudes de onda que son capaces de absorber los
átomos del elemento que se desea analizar. En algunas
ocasiones los cátodos están formados por más de un elemento,
de manera que se pueden utilizar para su determinación sin
 necesidad de cambiar la lámpara. También puede disponerse
de las llamadas lámparas de descarga gaseosa, en las cuales se
produce la emisión por el paso de corriente a través de un vapor
de átomos metálicos, y que se emplean tan solo para algunos
elementos como el Hg.
b) Sistema nebulizador-atomizador.
El nebulizador y el sistema atomizador suelen estar integrados
en uno, especialmente en los equipos de absorción atómica. En
este sistema, la disolución de la muestra (o parte de ella) es
inicialmente aspirada y dirigida como una fina niebla hacia la
llama (atomizador), lugar donde se forman los átomos en estado
fundamental. Para obtener la llama se requiere un combustible
(por ejemplo, acetileno) y un oxidante (por ejemplo, aire): La
óptica de un espectrofotómetro de absorción atómica es similar
a la de cualquier otro espectrofotómetro.
c) Monocromador.
El Monocromador (prismas, redes de difracción…). En general,
dispone de una rendija o ranura de entrada que limita la
radiación lumínica producida por la fuente y la confina en un
área determinada, un conjunto de espejos para pasar la luz a
través del sistema óptico, un elemento para separar las
longitudes de onda de la radiación lumínica, que puede ser un
prisma o una rejilla de difracción, y una rendija de salida para
seleccionar la longitud de onda con la cual se desea iluminar la
muestra. Parte de la radiación no absorbida es dirigida hacia el
detector.
d) Detector.
El detector (por ejemplo, un fotomultiplicador), es el sistema de
detección puede estar diseñado con fotoceldas, fototubos,
fotodiodos o fotomultiplicadores. Esto depende de los rangos de
longitud de onda, de la sensibilidad y de la velocidad de
respuesta requeridas. El sistema de detección recibe la energía
lumínica proveniente de la muestra y la convierte en una señal
eléctrica proporcional a la energía recibida. La señal eléctrica
puede ser procesada y amplificada, para que pueda
interpretarse a través del sistema de lectura que una vez
procesada es presentada al analista de diferentes maneras (por
ejemplo, unidades de absorbancia).
IV. APLICACIONES ANALÍTICAS
4.1. GENERACION DE HIDRUROS
a) Se tiene un recipiente cónico en el fondo, donde se coloca
la muestra a analizar. El fondo cónico tiene la finalidad de
producir una agitación más intensa y homogénea, y el
volumen de muestra es de 10 a 50 mL.

Con la muestra se agrega HCl 1 M para favorecer las

condiciones reductoras y es posible agregar unas gotas de
 Permanganato de Potasio 1 M, el cual le da un tinte rosa a
la solución de muestra y al ocurrir la reducción completa
la solución se decolorar por completo, lo cual garantiza la
reducción a los hidruros correspondientes.
4.2. ATOMIZACION EN VAPOR FRIO
a) El mercurio es el elemento no radiactivo más tóxico sobre
la tierra, famoso por su estado físico ya que es el único
elemento metálico líquido a temperatura ambiente.
Una solución patrón de HgCl2 1000 mg/l fue empleada
para preparar diariamente las soluciones estándar de
trabajo por apropiada dilución con agua en un rango de
concentración de 1 a 6 µg/l.
La solución de NaBH4 al 0,4% se estabilizó con NaOH
0,05% preparándola diariamente. La solución de trabajo
de SnCl2 al 20% de preparó disolviendo 20 g en 20 ml de
HCl en caliente y llevando la solución a un volumen final
de 100 ml.
Durante los ensayos preliminares a las muestras, tanto
digestadas como no digestadas, se les determinó el
contenido de mercurio orgánico, inorgánico y exógeno
utilizando dos procedimientos de reducción: uno con
NaBH4 y el otro con SnCl2.
Como ya se mencionó, el diagrama del sistema utilizado
para la determinación de mercurio. El mismo consta de
una bomba peristáltica que mantiene un flujo constante
para la solución del reductor (SnCl2 o NaBH4), del
antiespumante y de agua bidestilada a manera de
establecer la línea base del sistema.
Una vez que la línea base es establecida el canal portador
es sacado del recipiente de agua e introducido en las
diferentes soluciones estándares (para la construcción de
las curvas de calibrado) o en las diferentes muestras. Esta
muestra se une con el reductor en el primer reactor L1
donde tiene lugar la reducción del mercurio contenido en
la muestra a mercurio elemental (Hg0) el cual es un vapor
atómico. Seguidamente este vapor entra en contacto con
un flujo de N2, utilizado como gas de arrastre, el cual
conduce al Hg0 a través de L2 hacia el separador de fases
donde el líquido es separado al desecho y el gas finalmente
es conducido a la celda para ser medido y finalmente cada
lectura es registrada en el computador.
 En primer lugar, fueron establecidas las condiciones de
trabajo. El espectrómetro de absorción atómica fue fijado
a una longitud de onda de 253,7 nm; el ancho de rendija
fue establecido a 0,7 nm; la corriente de la lámpara fue de
5 mA sin corrector de fondo a objeto de obtener el máximo
de tramitancia, la celda fue alineada vertical y
horizontalmente. Además, también fue establecido el flujo
de nitrógeno en 0,20 l/min y la bomba peristáltica
finalmente fue fijada en un flujo de muestra/ agua de 14
ml/min, el reductor en 6,7 ml/min y el antiespumante en
4,5 ml/min.
4.3. HORNO DE GRAFITO
a) Al atomizar una muestra de 2 µL de zumo de naranja
enlatado, se obtuvo la serie de cuatro picos de la derecha,
los cuales corresponden a la variación de la absorbancia
con el tiempo a la longitud de onda del plomo.
- En la desecación y la calcinación se producen tres
picos, que probablemente se deben a productos
moleculares de la evaporación y a partículas
producidas en la ignición.
- Los tres picos de la izquierda son de los patrones de
plomo empleados en la calibración.
- El pico de muestra más a la derecha indica una
concentración de plomo en el zumo de 0,1 µg/Ml.
- Elevada sensibilidad para pequeños volúmenes de
muestra.
- Los límites de detección absolutos se encuentran
normalmente en el intervalo de 10-10-10-13 g de
analito
- Bajo consumo de muestra (0,5 y 10 µL)
- La precisión relativa de los métodos sin llama se
encuentra generalmente en el intervalo del 5 al 10 %,
en llama o plasma 1%.
 - Es método lento requiriendo habitualmente varios
minutos por elemento El rango dinámico es pequeño,
generalmente < de dos órdenes de magnitud.
- La atomización electrotérmica se aplica sólo cuando
la atomización con llama o plasma proporcionan
límites de detección inadecuados.

CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es una técnica muy utilizada en diferentes áreas de la
ciencia, pues permite la separación de los distintos componentes de
una mezcla gracias a dos efectos contrarios que gobiernan la técnica,
estos son:

 La retención: es el efecto que se ejerce sobre los componentes de

una mezcla por medio de una fase estacionaria, la cual puede ser
de naturaleza sólida o un líquido que se encuentre anclado en un
soporte sólido.
 Desplazamiento: Es el efecto que se ejerce sobre los componentes
de una mezcla por la fase móvil, la cual puede ser de naturaleza
líquida o gaseosa.
Para realizar la cromatografía, la mezcla que se desea separar se coloca
sobre la fase estacionaria, y la fase móvil atravesará el sistema
arrastrando y desplazando a los distintos componentes a distintas
velocidades, esto dependerá de la magnitud de las interacciones
relativas con ambas fases.
Cuando se repiten sucesivamente las operaciones principales de
retención y desplazamiento a lo largo del soporte o sistema de la
cromatografía, tendremos como resultado la separación de la mezcla
original.
El fenómeno que hace referencia a la migración de los distintos
componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, empujada
por la fase móvil, se le conoce con el nombre de elución.
La cromatografía se puede usar también, además de para separar, para
conocer el número de componentes que tiene la mezcla para poder
posteriormente identificarlos a través de la comparación de diferentes
patrones (cromatografía analítica). Como ya habíamos comentado, se
usa principalmente para la separación de mezclas, ya sean estas a
pequeña o gran escala, además de cómo método para purificar,
conocido como cromatografía preparativa.
Existen diferentes tipos de cromatografías, las cuales se diferencian y
dependen de las fases estacionarias (ya sea sólida o líquida), así como
de la fase móvil (ya sea líquida o gaseosa), así podremos diferenciar
diferentes tipos de cromatografía, donde sus nombres indican la
naturaleza de las diferentes fases que la forman:
 Cromatografía sólido-líquido: donde la fase estacionaria es un
sólido y la móvil un líquido.
 Cromatografía líquido-líquido: donde la fase estacionaria es un
líquido que se encuentra anclado en un soporte sólido y la fase
móvil es un líquido también.
 Cromatografía líquido-gas: La fase estacionaria es un líquido de
tipo no volátil que se encuentra impregnado en un sólido y la fase
móvil es un gas.
 Cromatografía sólido-gas: donde la fase estacionaria es un sólido
y la fase móvil, como su nombre indica, es un gas.

Por otro lado, dependiendo del tipo de interacción que se consiga

establecer entre los componentes de la mezcla, la fase móvil y
estacionaria, podemos hablar de:
 Cromatografía de adsorción: donde la fase estacionaria es un
sólido de tipo polar, el cual es capaz de absorber a los diferentes
componentes de la mezcla a través de interacciones polares.
 Cromatografía de partición: donde la separación se basa en las
diferentes solubilidades de los componentes que conforman la
mezcla en las distintas fases estacionarias, y móviles, que en este
caso, son ambas líquidas. Cuando la fase estacionaria es menos
polar que la fase móvil, esta se llamará cromatografía en fase
inversa.
 Cromatografía de intercambio iónico: La fase estacionaria es un
sólido que tiene anclados distintos grupos funcionales fijos
ionizables, cuyas cargas se encuentran contrabalanceadas por
distintos iones móviles que pueden ser intercambiados por los
iones presentes en la fase móvil.
Según el tipo de soporte utilizado en la técnica, en la fase estacionaria,
podemos establecer otra clasificación:
 Cromatografía en columna: donde el absorbente se coloca en el
interior de una columna de cristal.

Cromatografía en capa fina: donde una capa de absorbente con un

espesor uniforme se coloca en una placa de vidrio, o también de otros
materiales como el aluminio o plástico.

CROMATOGRAFÍA DE GASES

Resumen
La cromatografía de gases es el procedimiento comúnmente utilizado en
el análisis químico, en concreto cromatografía de gases consiste en
una muestra que se vaporiza y se inyecta en la cabeza de la columna
cromatografía. La muestra se transporta a través de la columna por el
flujo de fase inerte, móvil gaseoso. La propia columna contiene una fase
líquida estacionaria que se adsorbe sobre la superficie de un sólido inerte.

Antecedentes
La cromatografía de gases fue inventado por AJP Martin, quien, con
RLM Synge, propusieron que la fase líquida móvil utilizada en la
cromatografía líquida podría ser reemplazado por un gas adecuado. La
base de esta recomendación fue que, debido a difusividad de los gases
es mucho más alta de solutos en los gases en comparación con los
líquidos, el equilibrio en un proceso cromatográfico sería mucho más
rápido y por lo tanto, las columnas mucho más eficiente con tiempos de
separación mucho más cortos. Así, el concepto de cromatografía de
gases fue concebido hace más de cincuenta años.
La primera separación publicado por cromatografía de gases fue la de
una serie de ácidos grasos, un procedimiento de valoración se utiliza,
junto con una micro bureta, como detector, tiempo después la bureta se
automatizó para proporcionar una respuesta integra más eficaz. El
cromatógrafo de gases fue también uno de los primeros instrumentos de
análisis que se asocian con un ordenador que controlaba el análisis,
procesar los datos e informó de los resultados.
Una forma más sofisticada de la cromatografía de gases fue construido
por James y Martin y descrito por James en 1955. El instrumento era un
dispositivo algo voluminoso con una columna recta llena con una camisa
 de vapor. Inicialmente, el detector se encuentra en la base de la columna
y consistía en el dispositivo de valoración automática, la separación se
presenta como un cromatograma en forma de una serie de pasos, la
altura de cada paso de ser proporcional a la masa de soluto diluida. El
aparato fue utilizado con éxito para separar algunos ácidos grasos, pero
la capacidad limitada del dispositivo para detectar sólo material iónico
motivado Martin para desarrollar un detector más versátil, el
balance densidad del gas.

Es una técnica cromatografía

en la que la muestra se
volatiliza y se inyecta en la
cabeza de una columna
cromatografía. La elución se
produce por el flujo de una fase
móvil de gas inerte. A
diferencia de los otros tipos de
cromatografía, la fase móvil no
interactúa con las moléculas
del analito; su única función es
la de transportar el analito a
través de la columna
Cromatografía
DEFINICION
de gases
la cromatografía gas-sólido (GSC)
GSC la fase estacionaria es sólida y
la retención de los analitos en ella se
produce mediante el proceso de
adsorción. Precisamente este
proceso de adsorción, que no es
lineal, es el que ha provocado que
este tipo de cromatografía tenga
aplicación limitada, ya que la
retención del analito sobre la
superficie es semipermanente y se
obtienen picos de elución con colas.

TIPOS DE
la cromatografía gas-líquido
CROMATOGRAFIA (GLC)

DE GASES siendo esta última la que se

utiliza más ampliamente, y
que se puede llamar
simplemente cromatografía de
gases (GC). La GLC utiliza
como fase estacionaria
moléculas de líquido
inmovilizadas sobre la
superficie de un sólido inerte.
 DIAGRAMA DE FLUJO FUNCIONAL DEL CROMATÓGRAFO DE
GASES

Principio de funcionamiento del cromatógrafo de gases:

Tenemos un gas que buscamos analizar y separar en sus componentes, este se
pasa por un aparato a una temperatura fija, en este aparato, el gas pasa por
una columna que contiene un sólido, o en su defecto, un sólido embebido en
líquidos; esto se llama Fase Fija y el gas, se llama fase móvil.

La columna es muy larga, como de unos 2 mts y medio cm de espesor, este

tubo está lleno de polvo de cerámica, el cual está en forma de espiral metido
en un horno a unos 150ºC

La separación se efectúa porque los diferentes componentes de la mezcla de

gases interactúan con la fase fija. Los que más sean afines a la fase fija, tardan
más en salir del tubo y los otros tardan menos. Con este principio, la
separación de los componentes.

Luego, a la salida pones un detector que analiza los gases y te informa que
componente sale primero y cuál después, a medida que sale se van quemando
y por la cantidad de calor sabemos la cantidad y por el tiempo en que salen la
sustancia que es y la concentración de cada componente.
PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA
En cromatografía de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la
cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el
flujo de una fase móvil que es un gas inerte, y a diferencia de la mayoría
de los tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las
moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a
través de la columna.
Respecto a la cromatografía líquida, la cromatografía de gases tiene la
ventaja de disponer de detectores mucho más universales (por ejemplo,
el de ionización de llama). Además, para numerosas aplicaciones, los
métodos son más simples, más rápidos y más sensibles que los
correspondientes a la cromatografía líquida de alta resolución. La
instrumentación requerida para cromatografía de gases también es
mucho más sencilla y económica que la empleada en HPLC. Sin
embargo, en cromatografía de gases, la influencia de la temperatura
sobre la distribución del equilibrio es considerable, a diferencia de la
cromatografía líquida. Por ello, la cromatografía de gases presenta
limitaciones en tres casos:
Compuestos poco volátiles, generalmente los de peso molecular
superior a 300 u.m.a.
Compuestos sensibles a una elevación de la temperatura incluso
moderada (determinados compuestos de interés biológico)
Compuestos que se encuentran en forma iónica (puesto que son e
n general poco volátiles)
Por esta razón, la cromatografía de gases se emplea cuando los
componentes de la mezcla problema son volátiles o semivolátiles y
térmicamente estables a temperaturas de hasta 350-400ºC. En cambio,
cuando los compuestos a analizar son poco volátiles y/o termolábiles, la
técnica separativa adecuada suele ser la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC).
A menudo la cromatografía de gases se emplea para confirmar de la
presencia o ausencia de un compuesto en una muestra determinada.
Metodología

La muestra se recoge haciendo pasar una cantidad conocida de

aire a través de un tubo relleno dé carbón activo, mediante una
bomba de muestreo personal, que dando los vapores orgánicos
adsorbidos sobre el carbón.
Posteriormente se desorben con sulfuro de carbono y se analiza
la disolución resultante en un cromatógrafo de gases equipado
con detector de ionización de llama.
Se obtienen las áreas de los picos de los analitos de interés y del
patrón interno, determinando la cantidad' presente en la muestra.
A partir de la masa de los analitos presentes en la muestra se
obtienen las concentraciones ambientales.

Aplicaciones
Medioambientales: Análisis de pesticidas y herbicidas, análisis
de hidrocarburos, semivolátiles y volátiles, análisis del aire...
Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas,
ácidos orgánicos, azúcares, FAMES, ésteres metílicos,
triglicéridos, alcoholes...
Química Industrial: alcoholes, ácidos orgánicos,
aminas,aldehídos y cetonas, ésteres y glicoles, hidrocarburos,
disolventes, anilinas, gases inorgánicos...
Biociencia: drogas, fármacos, alcoholes y contaminantes en
sangre, disolventes residuales...
Derivadas del petróleo: gas natural, gases permanentes, gas
derefinería, gasolinas, gasóleos, parafinas.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
FUNDAMENTO

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar

los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no
polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha
tratado con RMe2SiCl . La fase móvil actúa de portador de la muestra. La
muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de
la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los
compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan
la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.
A) Cromatografía líquida convencional

 Adsorción
 Reparto
 Cambio iónico
 Exclusión
 Afinidad
B) Cromatografía líquida plana

 Capa fina
 Papel

A) Cromatografía líquida convencional

 ADSORCION (CLS)
 Adsorbentes: gel de sílice (SiO2.xH2O) (activación) Alúmina
(Al2O3.xH2O)
 Disolventes: serie eluotrópica (ordenación según la capacidad
relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado. Ejemplo:
(gel de sílice) agua>metanol>acetona> ac.
etilo>cloroformo>benceno>tolueno> etc
  REPARTO (CLL)
 Normal: fase estacionaria polar; Inversa: fase estacionaria no
polar
 Soportes sólidos: gel de sílice, tierra de diatomeas, celulosa,
almidón, microbolas de vidrio
 Fase estacionaria: agua (para muchos compuestos orgánicos)
 Eluyentes: cloroformo, Cl4C, hidrocarburos, etc.

CROMATOGRIFIA DE CAMBIO IONICO

RESINAS DE CAMBIO IONICO

RESONAS ACIDAS Y BASICAS

EXCLUSION MOLECULAR

SEPARACION DE PROTEINAS

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
EQUIPO HPCL

CARACTERISTICAS DE LAS BOMBAS DE I PULSION PARA HPLC

Generación de presiones ( 400 atmosferas).
Flujo libre de pulsaciones.
Intervalo de caudales de a,1 a 10 ml/ min.
Reproducibilidad del caudal mejores del 5% relativo.
Componentes resistentes a la corrosión.
Posibilitar la programación del disolvente (gradientes de
concentración).
BOMBA RECIPROCA

 BOMBA DE HPLC DE PISTON SIMPLE

  BOMBA DE HPLC DE PISTON DOBLE

 BOMBA DE DESPLAZAMIENTO

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

CROMATOGRAFIA EN PAPEL
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los
laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una
técnica potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La fase
estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de

filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas

de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el disolvente
empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. La
separación se realiza en función de la afinidad de los solutos con las
dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde
se aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el
disolvente llegarán más lejos. Las sustancias separadas se identifican
mediante diversos procedimientos físicos o químicos Introducción a los
métodos de separación. La cromatografía en papel es una técnica
utilizada para análisis inorgánico cualitativo, permite llevar a cabo la
separación e identificación de iones, trabajando con cantidades
mínimas de sustancia.
APLICACIONES
 Campos de Aplicación de HPLC

 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos

 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
 Productos de la industria química: Aromáticos condensados,
tensoactivos, propulsores, colorantes
 Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
 Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
 Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de
orina, estrógenos.

 Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

 Separación y purificación de metabolitos
 Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes
de muestras de orina
 Purificación y separación de enantiómeros
 Purificación de compuestos naturales
 Purificación y caracterización de enzimas y proteínas

CROMATOGRAFÍA: GASEOSA-ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Resumen
Se describe la cromatografía de gases y su acoplamiento con la
espectrometría de masas, técnicas que constituyen una herramienta
potente para separar, identificar y cuantificar los componentes volátiles
y semivolátiles de mezclas complejas.
Se aplican estas técnicas a la identificación de los compuestos que
producen mal olor en un tejido. Para ello, se emplea también la extracción
de espacio en cabeza. De los resultados del análisis GC-MS se desprende
que la principal causa del mal olor es la presencia de sulfuros orgánicos
en el tejido.
ACOPLAMIENTO CROMATOGRAFÍA DE GASES-ESPECTROMETRÍA
DE MASAS:

La cromatografía de gases es una técnica separativa que tiene la cualidad

de conseguir la separación de mezclas muy complejas. Pero una vez
separados, detectados, e incluso cuantificados todos los componentes
individuales de una muestra problema, el único dato de que disponemos
para la identificación de cada uno de ellos es el tiempo de retención de
los correspondientes picos cromatográficos. Este dato no es suficiente
para una identificación inequívoca, sobre todo cuando analizamos
muestras con un número elevado de componentes, como es frecuente en
cromatografía de gases capilar.
Por otra parte, la espectrometría de masas puede identificar de manera
casi inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz
de identificar los componentes individuales de una mezcla sin separar
previamente sus componentes, debido a la extrema complejidad del
espectro obtenido por superposición de los espectros particulares de cada
componente.
Por lo tanto, la asociación de las dos técnicas, GC (“Gas
Chromatography”) y MS (“Mass Spectrometry”) da lugar a una técnica
combinada GC-MS que permite la separación e identificación de mezclas
complejas.
La utilización de la cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro
de masas requiere sistemas especiales de conexión.
En principio, se trata de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y
necesitan una muy pequeña cantidad de muestra para su análisis, por
lo que son muy compatibles.
El único obstáculo serio a la hora de realizar su acoplamiento es que el
efluente que emerge de la columna cromatográfica sale a presión
atmosférica y debe introducirse en el interior del espectrómetro de masas
que trabaja a alto vacío. Actualmente, el acoplamiento directo resulta
fácil cuando se utiliza la cromatografía de gases capilar, que es el caso
más habitual.
En resumen, una mezcla de compuestos inyectada en el cromatógrafo de
gases se separa en la columna cromatográfica obteniendo la elución
sucesiva de los componentes individuales aislados que pasan
inmediatamente al espectrómetro de masas. Cada uno de estos
componentes se registra en forma de pico cromatográfico y se identifica
mediante su respectivo espectro de masas. En este proceso, el
espectrómetro de masas, además de proporcionar los espectros, actúa
como detector cromatográfico al registrar la corriente iónica total
generada en la fuente iónica, cuya representación gráfica constituye el
cromatograma o “TIC” (total ion current). En efecto, la corriente iónica
generada por todos los iones da lugar a un pico gaussiano de área
proporcional a la concentración del compuesto detectado.
* Los instrumentos para GC-MS se usan para identificar miles de
componentes presentes en sistemas naturales y biológicos, por ejemplo,
estos procedimientos han permitido identificar contaminantes el agua,
llevar a cabo diagnóstico médicos basados en los componentes del aliento
y estudios sobre los metabolitos de fármacos.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA-ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La cromatografía de líquidos es la técnica de separación más
comúnmente utilizada para llevar a cabo la separación de las HAs y su
determinación en matrices alimentarias, ya que a diferencia de la
cromatografía de gases no se requiere una etapa de derivatización
previa a su inyección en el sistema cromatográfico

FUNDAMENTOS

Los componentes de Debido a la distinta

Las muestras se
la muestra se movilidad, los
disuelven en una fase
distribuyen de modo componentes se
móvil (FM) líquida que
distinto entre la FM y separan en bandas
se hace pasar a través
FE dependiendo de la discriminadas que
de una fase estacionaria
afinidad por ambas pueden analizarse
(FE) inmiscible, la cual
fases, desplazándose cualitativamente y/o
se mantiene fija en una
a velocidad distinta cuantitativamente
columna o lecho
cromatográfico

Eluyente: lo que entra en la

columna

Eluato: lo que sale de la

columna

Elución: proceso de paso de la

FM a través de la columna
PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a
través de una columna que contiene a la fase fija. La separación
cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas
entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos
de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography)
no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la
muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas,
productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad
de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase
móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para
la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.

Aplicaciones
Campos de Aplicación de HPLC

 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos

 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
 Productos de la industria química: Aromáticos condensados,
tensoactivos, propulsores, colorantes
 Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

 Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre,

narcóticos
 Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas,
extractos de orina, estrógenos.

Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

 Separación y purificación de metabolitos
  Separación y purificación de los metabolitos de las drogas
procedentes de muestras de orina

 Purificación y separación de enantiómeros

 Purificación de compuestos naturales
ELECTROFORESIS CAPILAR
I. HISTORIA

El desplazamiento de sustancias bajo la acción de un campo

eléctrico fue citado por Reuss en 1809 en las memorias de la
Sociedad Imperial Natural (Moscow) (1809).

Allí se
describe la

experiencia de la Figura, donde se observa el comportamiento

migratorio de pequeñas partículas de arena en un ámbito de agua
transparente contenido en un recipiente de vidrio con un lecho de
arena fina en su fondo y dos tubos conteniendo electrodos de una
batería.
 El pasaje de la corriente produce un enturbiamiento en las
proximidades del polo positivo producido por la migración de
partículas de arena muy pequeñas que se movilizan por su carga
eléctrica negativa.

Este experimento puede ser considerado como el primer aporte

bibliográfico que revela la polarización de la sílice, pues la arena es
dióxido de sílice y fundida permite obtener los capilares que se
emplean en la electroforesis capilar.

Varios años más tarde, en 1816, fue observado l transporte del

agua por acción de la corriente galvánica generada por la
polarización negativa del capilar que une los dos recipientes
electródicos.
La pared del capilar, sabemos hoy, adquiere carga negativa (al
pasaje de la corriente eléctrica) produciéndose la polarización del
agua, la que por consiguiente tiende a desplazarse hacia el polo
negativo. Esta corriente liquida que se desplaza en sentido opuesto
a la dirección de la corriente eléctrica, se designa con el nombre de
Fuerza Electroendosmótica (FEO).

II. ANTECEDENTES DE ELECTROFORESIS CAPILAR

El empleo de capilares para la separación de sustancias neutras o

iones cargados eléctricamente, apareció en 1967 en una
experiencia desarrollada
Por Hjerten empleando capilares milimétricos, los que eran
rotados a través de su sección longitudinal para evitar los efectos
de la convección.

Virtanen y Mikkers en 1979 desarrollaron las separaciones

empleando electroforesis en capilares de 200 µm de diámetro
interno en vidrio y teflón respectivamente.

La separación de cloruro, aspartato y glutamato por isotacoforesis,

hecha por Martin en 1942, los trabajos de Konstantinov, Oshukova
en 1963 y los de Evereast en su tesis de graduación en 1964,
fueron los precursores en el empleo de capilares y la medición de
la absorción UV a través del mismo, permitió obtener los espectros
característicos de la separación.

Más adelante, en 1980, Jorgenson y Lukacs empleando técnicas

avanzadas en la obtención de capilares de sílica fundida emplean
diámetros de 75 µm y Jorgenson clarifica teóricamente las
relaciones entre los parámetros operacionales y las cualidades de
la separación revelando el elevado potencial analítico de esta
técnica.

Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de sílica

fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a
500 v/cm refrigerados por aire, fue el lanzamiento de la EC.

Estos capilares de 75 a 100 cm de largo y con diámetros internos

de 50-70-100 µm y de 300 a 400 de diámetro externo son los que
permiten una capacidad elevada de resolución N>200.000
platos/m.

La corriente Electroendosmótica (FEO) generada por los grupos

silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una
corriente plana del frente del líquido que contrasta con el frente
parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución.
III. DEFINICION DE ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis capilar (EC) es una técnica analítica que permite

la separación y cuantificación de una amplia gama de analitos
(iones, péptidos, proteínas, carbohidratos, esteroides, ácidos
nucleicos, vitaminas, fármacos, células, etcétera). Parte de la
versatilidad y eficacia de esta técnica se debe a que combina
elementos de otras técnicas analíticas; por ejemplo, utiliza
detectores de alta sensibilidad como en la cromatografía de líquidos
de alta resolución (HPLC) y el uso de capilares de sílice fundida
(SiO2), como en la cromatografía de gases (GC). Además, estos
capilares permiten la aplicación de altos campos eléctricos (100-
500 V/cm) con una alta eficiencia para la disipación del calor,
evitando los efectos adversos del calentamiento de Joule y permiten
la detección in situ, debido a la baja absorción de la radiación
UV/vis y a la baja fluorescencia. Estos capilares están recubiertos
de un polímero (poliamidas) que les confiere alta flexibilidad
facilitando su manipulación.

Los grupos silanol (Si-OH) de la superficie del capilar a pH ≥ 3 son

ionizados, por lo que la pared del capilar presentará carga negativa
(Si-O-). De acuerdo con la teoría de la doble capa eléctrica, en la
pared del capilar se formará una primera capa (capa fija) de
contraiones (cationes) que son atraídos por la carga negativa del
capilar, seguida por una segunda (capa móvil), que se compone
principalmente de cationes que están adyacentes a la capa fija y,
hacia el centro del capilar, el número de cationes y aniones son
equivalentes (Figura 1c). Al aplicar un campo eléctrico, el exceso de
cationes de la capa móvil establece un flujo neto de migración hacia
el polo negativo (cátodo), generando el flujo electroosmótico, que se
refiere a la migración de un líquido (solución amortiguadora)
respecto a una superficie cargada (pared del capilar) al aplicar un
campo eléctrico. La movilidad del flujo electroosmótico (μfeo) está
en función de la viscosidad (η) de la solución amortiguadora, la
constante dieléctrica del medio (ε) y del potencial zeta (ξ) que se
genera por la diferencia de cargas entre las capas (ecuación 1).
 μfeo = εζ/4πη (1)

La migración de los analitos dentro de un campo eléctrico

(movilidad electroforética μe) está determinada por la fuerza del
campo eléctrico y la carga del analito; sin embargo, esta velocidad
disminuye de acuerdo con la ley de Stokes, conforme se
incrementan las fuerzas de fricción (viscosidad del amortiguador) y
radio iónico de los analitos. La movilidad total (μt) de los analitos
dentro del capilar es la suma vectorial de μfeo y μe, por lo que en
los procesos de separación de electroforesis capilar de zona, donde
se involucra principalmente la relación carga/masa de los analitos,
los cationes de la muestra adquieren mayor μt seguido por los
analitos neutros, y los aniones serán los que presenten menor μt
(Figuras 1a y 1b).

IV. DESCRIPCION DEL EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis capilar requiere de un esquema relativamente

simple, contando con los siguientes elementos:
  Capilar, compartimiento donde se realiza la separación.
 Reservorios con solución amortiguadora, donde se
sumergen los electrodos y el capilar.
 Reservorios, donde se colocan las muestras.
 Electrodos, para generar el ánodo y el cátodo.
 Fuente de alto voltaje, generadora del campo eléctrico.
 Sistema de inyección de muestra, hidrodinámica y
electrocinética.
 Sistema de control de temperatura, por convección de aire
o líquido.
 Detector, conectado a un sistema de adquisición de datos.

V. TECNICAS ELECTROFORETICAS

a. Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE):

Es el

procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el

capilar es recorrido por el electrolito a través de un medio
buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato), básico (borato),
 o anfótero (carácter ácido y básico). El flujo electroosmótico
crece con el pH del medio electroforético.
b. Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC): En
esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase
móvil un compuesto catiónico o aniónico para formar
micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles
con la disolución retienen a los compuestos neutros de un
modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófila-hidrófoba.
Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas
que tienen tendencia a migrar sin separación, como es el
caso de algunos enantiómeros.
c. Electroforesis capilar en gel (CGE): Esta es la
transposición de la electroforesis en egel de poliacrilamida o
de agarosa. El capilar está relleno con un electrolito que
contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que
ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los
fenómenos de convección o de difusión. Los oligonucleótidos,
poco frágiles, se pueden separar de este modo.
d. Isoelectroenfoque capilar (CIEF): Esta técnica, también
conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un
gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que
contiene un anfótero. Cada compuesto migra y se enfoca al
pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su
carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una
presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se
desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas
eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten
separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02
unidades de pH.

VI. VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR (EC)

Debido al principio de separación y a los detectores de alta
sensibilidad (UV/vis, arreglo de diodos, fluorescencia inducida por
láser y espectrometría de masas), la EC ofrece varias ventajas, tales
como:
 Alta eficiencia, debido a que la aplicación del campo eléctrico
sobre el capilar genera el flujo electroosmótico (feo), que
permite la separación con un perfil casi plano, obteniendo
picos más angostos y simétricos comparados con los
obtenidos con el flujo laminar que se obtiene al usar presión,
como en HPLC (Figura 2).
 Excelente resolución, obteniendo platos teóricos mayores a
10.5.
  Límites de detección de hasta ppm, dependiendo del analito
y detector utilizado.
 Mínimo tratamiento de muestras.
 Mínimo consumo de muestras y reactivos.
 Tiempos de análisis rápidos que oscilan de 5 a 60 min.

ESPECTROSCOPIA DE MASAS

I. INTRODUCCIÓN:

Un espectrómetro de masas es un dispositivo que se emplea

para separar iones dentro de una muestra que poseen distinta
relación carga/masa. La mezcla puede estar constituida por
distintos isótopos de una misma sustancia o bien por distintos
elementos químicos.
 II. FUNDAMENTOS TEÓRICO- TÉCNICOS DE E.M.

Hoy en día, esta técnica continúa teniendo los mismos fundamentos que
en su origen, aunque el espectrómetro de hoy en día poco tenga que ver
con su predecesor.

La espectrometría de masas se fundamenta en la separación de

partículas moleculares o atómicas por su diferente masa. El proceso de
la espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas:

 Ionización de la muestra.
 Aceleración de los iones por un campo eléctrico.
 Dispersión de los iones según su masa/carga.
 Detección de los iones y producción de la correspondiente señal
eléctrica

III. INSTRUMENTACIÓN EN E.M.

Básicamente un espectrómetro de masas costa esencialmente de las

siguientes partes:

 Sistema de entrada de muestras.

 Cámara de ionización.
 Acelerador.
  Analizadores.
 Detector.

IV. COMPONENTES PRINCIPALES DE UN ESPECTRÓMETRO

DE MASAS
 Sistema de bombeo
 Sistema de entrada
 Fuente de iones
 Óptica de Iónica
 Analizador másico
 Detector
 Línea de transferencia

Cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)

La espectrometría de masas puede identificar de manera casi inequívoca
cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar
los componentes individuales de una
mezcla sin separar previamente sus
componentes, debido a la extrema
complejidad del espectro obtenido por
superposición de los espectros
particulares de cada componente.

Por lo tanto, la asociación de las dos

técnicas, GC (Gas Chromatography) y
MS (Mass Spectrometry) da lugar a una
técnica combinada GC-MS que permite
la separación e identificación de
mezclas complejas.

Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)

Los espectros de masas obtenidos por HPLC-MS suelen ser más sencillos
que los obtenidos en GC-MS debido a que el nivel de fragmentación de
las moléculas es menor. El inconveniente es que los espectros dependen
parcialmente de los parámetros de ionización, es decir, que no pueden
ser considerados como “huella dactilar” del con puesto y, por tanto, la
comparación con colecciones de espectros
estándares no es posible. Por esta razón, la
comparación del espectro de masas de
analitos con patrones debe realizarse en las
mismas condiciones de trabajo.

Espectrometría de masas de relaciones isotópicas (IRMS)

Mediante esta técnica se
puede llevar a cabo el análisis
de los isótopos estables de los
principales elementos ligeros
de la biosfera (C, H, N, O, S).
La espectrometría de masas
de relación isotópica permite
el análisis de las relaciones
isotópicas de estos elementos
ligeros (13C/12C, D/H,
15N/14N, 18O/16O,
34S/32S) con la precisión y la exactitud necesarias para medir las
pequeñas variaciones en la abundancia isotópica (fraccionamiento),
provocadas por múltiples procesos naturales, tanto físicos como
químicos. Estos elementos, que tienen una gran importancia desde el
punto de vista biológico y geológico, presentan dos o más isótopos
estables, de los cuales el más ligero es el más abundante.
La técnica también permite el análisis de abundancias isotópicas en
muestras enriquecidas, y por esta razón es una buena alternativa al uso
de marcadores radiactivos para el seguimiento de rutas metabólicas
naturales o sintéticas.

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS

Análisis de ADN

La electroforesis es una forma de analizar el ADN, o ácido

desoxirribonucleico, que es el código que contiene todas las
características que heredas de tus padres. El ADN se organiza en
secuencias, por ejemplo, una secuencia representa el color de tus ojos y
otra secuencia representa el color de tu piel. Mediante electroforesis, las
secuencias específicas de ADN pueden ser analizadas, aisladas y
clonadas. El ADN analizado se puede utilizar en investigaciones
forenses y pruebas de paternidad.
Análisis de proteínas

La electroforesis ha desarrollado nuestro

conocimiento sobre la estructura y función de las
proteínas. Estas moléculas son necesarias para las
células de nuestro cuerpo y pueden ser analizadas,
por ejemplo, obteniendo muestras de sangre y orina.
Luego, a través de la electroforesis, la cantidad de
proteínas en la sangre o en la orina se mide y se
compara con los valores normales establecidos, los
inferiores o superiores a los niveles normales por lo
general indican una enfermedad.

Análisis de antibióticos

La aplicación de la electroforesis en los estudios de los antibióticos se

remonta a la década de 1950. Otros estudios se efectuaron para
mejorar las técnicas electroforéticas y antibióticos nuevos. Estos
medicamentos, como la penicilina, se encuentran entre los fármacos
ampliamente prescritos en contra de las infecciones bacterianas. Con la
electroforesis, los expertos no sólo son capaces de sintetizar nuevos
antibióticos, también son capaces de analizar qué tipos de bacterias son
resistentes a los antibióticos.
Análisis de vacuna

La vacuna es un análisis de las muchas aplicaciones importantes de la

electroforesis. Hay varias vacunas que han sido purificadas, procesadas
y analizadas a través de la electroforesis, como la vacuna contra la
influenza, la vacuna contra la hepatitis y la vacuna contra la polio. Los
pasos exactos realizados en el análisis de la vacuna, sin embargo, no se
pueden determinar debido a razones de confidencialidad de las
empresas farmacéuticas. Sin embargo, los informes de datos de los
fabricantes de vacunas, como Wyeth, Merck y Sanofi-Aventis presentan
la electroforesis como un método de análisis eficaz de la vacuna.

PARTES DEL INSTRUMENTO DE ELECTROFORESIS

DIAGRAMA DE UN SISTEMA CROMATÓGRAFO

 COLUMNA CROMATOGRAFICA
Al igual que sucede en todas las técnicas cromatografías, la columna es
el corazón del cromatógrafo de gases. Es necesario tener siempre
presente que la columna es el auténtico elemento de separación de los
componentes de la muestra; así, una mala elección de la columna, una
columna deteriorada o unas condiciones de trabajo inadecuadas, nunca
permitirán obtener buenos resultados aunque se disponga del mejor
equipo en el resto del cromatógrafo, siendo además las causas citadas las
responsable de la inmensa mayor parte de los problemas que se
encuentran a la hora de realizar un análisis por cromatografía de gases.
 Una columna para cromatografía de gases, esta formada por un
tubo, que puede ser de diversos materiales ( preferiblemente inerte),
dentro del cual se encuentra la fase estacionaria. Esta puede ser un
solido activo (cromatografía gas solido), o con mayor frecuencia un liquido
depositado sobre las partículas de un solido portador (columnas
empaquetadas o de relleno) o sobre las propias paredes del tubo
(columnas tubulares abiertas). [1]
En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las
empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas o capilares. Hasta la fecha,
la mayor parte de la cromatografía de gases se ha realizado con columnas de
relleno, Sin embargo, en la actualidad esta situación está cambiando
rápidamente, y parece probable que en un futuro próximo, excepto para ciertas
aplicaciones especiales, las columnas de relleno serán sustituidas por las más
eficaces y rápidas columnas capilares. Las columnas cromatografías varían en
longitud desde menos de 2 hasta 50 m, o más. Se construyen de acero
inoxidable, vidrio, sílice fundida, o Teflón. A fin de poder colocarse en el interior
de un termostato, normalmente se configuran como helicoides con diámetros
de 10 a 30 cm. En una sección posterior se encuentra una discusión detallada
acerca de las columnas, rellenos de columna y fases estacionarias.

Columna cromatografía situada en horno termostatizado. En ella se va a

producir la separación de los analitos. Las empaquetadas son columnas
rellenas con una soporte solido de grano muy fino que bien actúa como fase
estacionaria o esta recubierto de una fina capa de fase estacionaria liquida no
volátil. El soporte ideal son pequeñas partículas esféricas de tamaño uniforme
y gran superficie especifica. El materias debe de ser inerte y resistente a
elevadas temperaturas. El soporte mas usado es la tierra de diatomeas,
consistente en los esqueletos de sílice de algas microscópicas. Estas columnas
poseen diámetros de 3-6 mm y longitud de 1-5 metros.
 Las columnas tuberías abiertas o capilares son mas estrechas (0.2-0.5
mm) y suelen ser mucho mas largas (10-100 m). La pared interior de la columna
se recubre con una película de fases estacionaria, (solida o liquida) con un
espesor de unas pocas micras. De ese modo al no existir la oposición del relleno
al paso del gas pueden hacerse mas largas. Estas columnas poseen una menor
AEPT que las columnas empaquetadas, pues el termino A de la ecuación de van
Deemter, asociado a la multitud de trayectorias posibles desaparece. La
cantidad de muestra necesaria para estas columnas es menos que para las
empaquetadas. Todo ello se produce en que las columnas capilares poseen
mucha mejor resolución, mayor sensibilidad y necesitan menor tiempo de
análisis. Por ello prácticamente han reemplazado por completo a las
empaquetadas. [2]
Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
Columna cromatografía
Las columnas de HPLC son tubos de acero que miden entre 3 y 30 cm de
longitud. Su diámetro entre 2 y 5 mm. La fase estacionaria se mantiene entre
dos discos porosos situados en los extremos de la columna.
En HPLC se emplean dos tipos de relleno para las columnas:

 Relleno pelicular: se utilizan bolitas de vidrio o polímero no porosas

esféricas de diámetro entre 30-40 µm. Sobre su superficie se deposita
una capa delgada de partículas muy pequeñas (2-5 µm) gel de sílice,
alúmina o un cambiador iónico que actúan como fase estacionaria. Si la
fase estacionaria es líquida se coloca una fina película de líquido sobre
las esferas no porosas.

 Partículas porosas: se trata de macropartículas porosas con tamaños

entre 3-10 µm de sílice, alúmina o un cambiador iónico que actúan como
fase estacionaria. También pueden recubrirse con películas orgánicas
liquidas retenidas por adsorción. Son más fáciles de empaquetar, pero
menos eficientes que las segundas.
Sistema de suministro de fase móvil

Todos los equipos de HPLC incluyen un sistema de bombeo de fase móvil de alta
presión para forzar el paso de la fase móvil a través de la columna, cuyo relleno
muy compacto, es responsable de una importante sobrepresión. Los requisitos
del bombeo en HPLC son muy rigurosos ya que en algunos detectores las
fluctuaciones en el flujo de fase móvil dan lugar a fluctuaciones de la señal,
produciendo un ruido de fondo que impide la observación de señales débiles.
En HPLC es deseable que el control y la reproducibilidad del caudal de fase
móvil sean mejores que el 0.5 %. existen diferentes tipos de bombas de alta
presión con distintas características, ventajas e inconvenientes.
BIBLIOGRAFÍA Y LINCOGRAFÍA

BIBLIOGRAFÍA:

 Chapple, G., The determination of arsenic, selenium and

mercury levels in U.S. EPA quality control samples using
the GBC HG3000 continuous-flow hydride generator, GBC
AA Aplications, Nº 17, 1990, Australia.

 Manual de operación del generador de hidruros GBC

HG3000, GBC Scientific Equipment Pty Ltd., Australia.

 Química Analítica. D.A. Skoog, D.M. West y F.J. Holler. 6ª

Ed. Mc Graw Hill, 1995.

LINCOGRAFÍA

 https://es.wikipedia.org/wiki/Mufla_de_grafito

 http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-
qumicos/espectroscopa-de-absorcin-atmica

 http://www.uma.es/investigadores/servinv/LabEA/tec_a
naliticas/tec_analiticas.html

 http://www.ugr.es/~fgil/proyecto/hidruros/fundamento.
html

 http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimi
ca%20analitica%20ambiental/Tema6.pdf

 http://blog.utp.edu.co/docenciaedwin/files/2014/09/TIPO
S-CROMATOGRAF%C3%8DA.pdf

 http://slideplayer.es/slide/3495660/

 http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/invest
igacion/cromatografia/cromatografia_de_gases.pdf