Métodos de grasa bruta - Consideraciones

Comité de métodos y servicios de laboratorio de AAFCO

Grupo de Trabajo de Mejores Prácticas de Grasa Cruda
Enero 2014
Los métodos de laboratorio de grasa bruta son métodos "definitorios" o "empíricos". La grasa cruda
La fracción se define por el solvente y las condiciones de extracción (tiempo, temperatura, tamaño
de partícula, proporción de solvente a porción de prueba, etc.) y no es específico para la extracción
de material lipídico.

Los lípidos se definen comúnmente como una amplia categoría de moléculas no polares que son
escasamente soluble o insoluble en agua, pero soluble en benceno, cloroformo, hexano, metanol y
éter dietílico. Los lípidos pueden ser ácidos grasos (unidos o libres) y derivados, fosfolípidos, ceras,
esteroles, tocoferoles, carotenoides, colesterol y similares compuestos.

Los lípidos en la naturaleza están asociados con proteínas, carbohidratos y otros lípidos. Estas las
asociaciones pueden ser interacciones de van der Waals (generalmente lípidos lipídicos);
electrostático y unión de hidrógeno (lípidos y proteínas); y covalente (lípidos, carbohidratos y
proteínas). Debido a los diferentes enlaces involucrados en una matriz celular compleja, diferente
Se requieren tratamientos químicos y físicos para la extracción de lípidos. Al igual que con
cualquier análisis químico, el muestreo representativo es esencial ya que el análisis debe reflejan
todo el lote de material y no solo la muestra individual.
Muestra: la preparación típicamente incluye secado, reducción del tamaño de partícula o hidrólisis,
solvente extracción, separación de fases líquidas y sólidas, eliminación de componentes no
lipídicos, eliminación del disolvente y secado del extracto. El análisis de grasa cruda a menudo se
considera un procedimiento simple. Debido a la variedad de matrices en tejidos de plantas y
animales, y alimentos procesados de origen animal, y variedad de clases de lípidos, lograr una
extracción completa puede ser todo un reto.

Además de los lípidos, los métodos de grasa cruda pueden coextraer cualquier otra sustancia que
sea soluble bajo las condiciones del método. Estos pueden incluir humedad residual, etanol
residual, pigmentos, carotenos, urea y otros compuestos. Debido a la naturaleza de estos métodos,
no son específicos de los lípidos, ni las condiciones de extracción aseguran que se extraerá el
100% del material lipídico.
Las muestras de grasa cruda deben secarse y molerse. Muchos solventes orgánicos (no polares)
extraerá agua junto con compuestos lipídicos, y esto puede ser una fuente de error. Como un
declaración general, el contenido de agua debe ser inferior al 8%, y el contenido de agua es menor
preferido siempre que la muestra no sufra daños por calor por secado excesivo. Alta temperatura
no se recomienda el secado debido al aumento de la unión de lípidos a proteínas y carbohidratos.
Estos lípidos unidos no se extraen fácilmente con disolventes orgánicos. Bajo la temperatura o el
secado al vacío es el método de secado preferido. Los disolventes polares pueden no Penetrar
muestras con una humedad superior al 8%, por lo que las muestras deben secarse antes de los
lípidos. extracción, y este paso de preparación de la muestra se describe en la mayoría de los
métodos de extracción.
El éter dietílico es higroscópico y cuando se satura con agua, la eficiencia de la extracción de
lípidos esta reducido. Muestras con niveles más altos de humedad y / o agua endógena a menudo
da como resultado un contenido de grasa cruda elevado (y erróneo). Las muestras de tierra tienen
un mayor área de superficie, lo que permite una mejor penetración de disolvente a lo largo de la
muestra y mejor eficiencia de extracción. La flotación de partículas puede ser un problema con
ciertas muestras de alimento que se muelen demasiado bien a menos que se tomen medidas
apropiadas durante el proceso de extracción. Esto puede incluir el uso de bolsas Dacron o
cubriendo el muestra con algodón o material similar que ya ha sido extraído proceso y no
contribuirá a los residuos de lípidos. El solvente debe gotear sobre penetrar uniformemente
(canalización mínima o nula) a través de la muestra.

EXTRACCION SOLVENTE
La mayoría de los métodos de laboratorio más antiguos implican la extracción con disolvente y el
pesaje de los residuos de lípidos después de evaporación del solvente Para la grasa cruda, el éter
dietílico es a menudo el disolvente preferido, ya que es relativamente no polar y extrae la mayoría
de los componentes no polares (triacilgliceroles, esteroles, tocoferoles y compuestos similares),
pero tiene una pobre capacidad para extraer los lípidos polares, tales como glicolípidos y
fosfolípidos). La "grasa cruda" a menudo es sinónimo de "extracto de éter" y generalmente se
refiere a lípidos "libres" que se pueden extraer en solventes menos polares como éter de petróleo o
éter dietílico. Los lípidos "enlazados" requieren solventes más polares para extracción.

La elección de los solventes se basa en las características del solvente. Las consideraciones
deberían incluyen el uso de una alta potencia solvente (solventes no polares) para lípidos; y el uso
de un bajo poder solvente (solventes polares) para proteínas, aminoácidos y carbohidratos. En
algunos instancias, esto puede ser un solo solvente, o puede ser una combinación de 2 o más
solventes en proporciones específicas. Generalmente se prefiere un único solvente para minimizar
el fraccionamiento y los requisitos de tiempo para la separación de fase / disolvente para el
aislamiento de la fracción lipídica. Una sola el sistema solvente usualmente permite una
recuperación más completa del solvente si se desea y / o necesario desde un punto de vista
ambiental. No hay un solo solvente que sea ideal para todas las muestras. El (los) disolvente (s)
seleccionado (s) debe (n) tener un punto de ebullición relativamente bajo para permitir baja
evaporación de la temperatura y no deja residuos. Idealmente, los solventes seleccionados
deberían ser seguro de usar (no inflamable y no tóxico en los estados líquido y de vapor). Residuos
eliminación, ya sea por evaporación en el aire o eliminación de líquidos en aguas residuales debe
siempre ser considerado. El (los) disolvente (s) debe (n) penetrar fácil y muestra para proporcionar
una extracción de lípidos más completa. El (los) disolvente (s) también deben relativamente barato
y no higroscópico.

Los disolventes orgánicos (polares) comúnmente utilizados incluyen éter de petróleo, éter dietílico,
cloroformo, metanol, etanol, isopropanol, n-butanol, acetona, acetonitrilo, isopropilo éter, dioxano,
tetrahidrofurano, diclorometano, pentano, hexano, benceno, ciclohexano, iso-octanol o mezclas de
estos disolventes. Carcinogenicidad, toxicidad, la inflamabilidad, la higroscopicidad y el costo
deben considerarse al elegir un solvente.

El éter de petróleo (éter de petróleo) es un disolvente de uso común debido a su costo

relativamente bajo en comparación con otros solventes orgánicos. Es menos higroscópico que el
éter dietílico, es menos inflamable que el éter dietílico, y es más selectivo para los lípidos
hidrófobos que el dietilo éter. Muchos laboratorios usan éter de petróleo como solvente único
mientras que otros laboratorios usan un específico mezcla (proporción) de éter de petróleo y éter
dietílico para la extracción de lípidos. éter de petróleo generalmente disuelve más lípidos no
polares que el éter dietílico y tiene menos potencial para formación de peróxido
El éter de petróleo también se conoce como bencina, nafta de pintor, nafta de petróleo, nafta
ASTM, alcoholes de petróleo, X4 o Ligroin. Químicamente, no es un éter como éter dietílico (los
éteres contienen el grupo funcional R-O-R '), pero es intermedio entre la nafta más ligera y el
queroseno más pesado. La gravedad específica puede variar entre 0.6 y 0.8 dependiendo de su
composición. El éter de petróleo se puede dividir en varios fracciones durante la destilación del
petróleo basadas en rangos de temperatura de ebullición. Los fracción de destilación de éter de
petróleo de 60 a 80 o C a menudo se usa como un reemplazo para hexano Debido a varios
idiomas e interpretaciones del mundo, la bencina (éter de petróleo) no se debe confundir con el
benceno o el bencino, ni se debe confundir con gasolina. En muchos idiomas, la palabra para
gasolina se deriva de la palabra similar a bencina, p. "Benzin" (alemán), "benzine" (neerlandés),
"benzina" (italiano) o "benzină" (Rumano). El éter de petróleo es un grupo de diversos líquidos
volátiles, altamente inflamables mezclas de hidrocarburos usadas principalmente como solventes
no polares, y es una mezcla de alcanos, por ejemplo, pentano, hexano y heptano, mientras que el
benceno es cíclico, aromático hidrocarburo, C6H6.

Ligroin es una fracción refinada de hidrocarburos saturados de petróleo similar al éter de petróleo
y se usa principalmente como disolvente de laboratorio. Es principalmente C7 a C11 en forma de
aproximadamente 55% de parafinas, 30% de monocicloparafinas, 12% de alquilbencenos y 2% de
dicicloparafinas, y es no polar Generalmente ligroin grado de laboratorio hierve a 60 a 90 ° C.
Con frecuencia hay algunas diferencias en la coherencia entre los proveedores de petróleo éter,
algunas diferencias en la consistencia de lote a lote y algunas diferencias en la consistencia de
país a país. La amplia gama de temperaturas de ebullición hace que la recuperación y volver a
usar difícil. La solubilidad de los lípidos en los solventes se basa en la proporción relativa de
polares y no polares grupos en la matriz. Lípidos con poco o ningún grupo polar (triacilglicéridos,
colesterol ésteres) son altamente solubles en hexanos, benceno o ciclohexano, y en condiciones
más polares disolventes tales como cloroformo y éter dietílico, pero son insolubles en metanol. los
la solubilidad de estos lípidos aumenta en disolventes alcohólicos a medida que la longitud de la
cadena de carbonos del el alcohol aumenta, por lo que son más solubles en etanol y n-butanol. La
cadena más corta los ácidos grasos en los lípidos tendrán una mayor solubilidad en los disolventes
más polares. Lípidos polares son escasamente solubles en solventes de hidrocarburos, pero se
disuelven fácilmente en más polares disolventes tales como metanol, etanol o cloroformo. Sabores
solubles en aceite, vitaminas y los colores generalmente se extraen con lípidos cuando se usan
solventes menos polares. Los solventes son cubierto con considerable detalle en el libro Food
Lipids (Capítulo 5) enumerado en referencias. Los hexanos suelen ser un mejor disolvente para la
grasa cruda de los forrajes que el éter de petróleo

MÉTODOS DE HIDROLISIS
El método de hidrólisis ácida es aplicable a productos horneados y alimentos para mascotas, y
facilita la extracción de ácidos grasos de glicéridos, glucolípidos y fosfolípidos y ésteres de esterol
que de otro modo podrían dejarse sin extraer debido a enlaces covalentes e iónicos.

Sin embargo, también puede facilitar la coextracción de materiales adicionales no lipídicos. Los la
adición de ácido clorhídrico rompe los enlaces covalentes e iónicos de los lípidos a las proteínas y
carbohidratos, de modo que los lípidos comúnmente unidos a estas fracciones puedan extraerse.

Cuando el valor del análisis de grasa cruda es menor de lo esperado, especialmente para cualquier
alimento de origen animal producto que ha sido procesado por calor o que contiene ingredientes
que han sido calentados la hidrólisis ácida procesada se debe considerar como el método de
elección.
El ácido
El método de hidrólisis también se usa con frecuencia cuando los productos con alto contenido de
grasa, como las sales de calcio de los ácidos grasos, se analizan para determinar la grasa cruda y
las grasas emulsionadas.
Como punto de referencia para alimentos procesados por calor que deben analizarse con ácido
hidrólisis, las temperaturas del producto alcanzadas durante la granulación son generalmente 160-
1850 ° F y puede no necesitar hidrólisis ácida para la determinación de grasa cruda. Expulsado y
expandido las temperaturas del producto son generalmente 240-2800° F, productos de extrusión de
alta temperatura son generalmente procesado a 280-3250° F (alimentos secos para mascotas) y
las temperaturas de los productos para hornear son generalmente 325-4000° F. El proceso de
extrusión a alta temperatura generalmente es seguido por un secador, donde las temperaturas del
aire son típicamente 400-6000° F para eliminar la humedad. Mascota mojada
los alimentos (latas, bandejas o bolsas) suelen estar sujetos a temperaturas de retorta de 240-
260°F, y puede requerir un análisis de hidrólisis ácida después de que se haya realizado el secado
inicial en el paso de preparación de muestra. Las golosinas para mascotas son típicamente una
extrusión a baja temperatura proceso y generalmente están más cerca de las temperaturas del
expulsor (240-2800° F) y puede o puede no pasar por una secadora. La fabricación de sales de
calcio de ácidos grasos también es una gran proceso de temperatura, por lo que la hidrólisis ácida
es necesaria para la determinación de la grasa cruda. Rociar las temperaturas de secado pueden
ser 275-3250° F, que puede justificar la hidrólisis ácida para la grasa cruda.
Como una declaración muy general, aquellos productos producidos con temperaturas de
procesamiento más de 2000° F puede necesitar ser analizado por un método de hidrólisis ácida.
La mayoría de los productos lácteos y productos con alto contenido de azúcar requieren un
pretratamiento alcalino con amoníaco para romper las grasas emulsionadas y solubilizar las
proteínas antes de la extracción con solvente, usualmente con una mezcla de éter dietílico y éter
de petróleo. Esto se conoce comúnmente como el método Roese-Gottlieb.

OTROS METODOS
La espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) se puede utilizar como un método no destructivo de
determinar la grasa cruda Esto requiere una calibración cuidadosa y es más preciso cuando

El instrumento NIR se calibra usando un método validado consistente y con el la matriz de

alimentos se medirá Los efectos de matriz pueden generar errores significativos si no
apropiadamente calibrado Se han desarrollado métodos de espectroscopía de resonancia
magnética nuclear (RMN), y requiere una calibración cuidadosa con métodos y matrices
específicos para una mayor precisión.
Extracción de fluido supercrítico usando CO2 y, en algunos métodos combinados con etilo alcohol,
también se han desarrollado para lípidos no polares.

ANÁLISIS DE ÁCIDO GRASO

Si el material extraído de lípidos debe analizarse más a fondo en busca de ácidos grasos, se debe
tener cuidado en opciones de solventes y metodología para minimizar la degradación de los
lípidos. Cloroformo, cloroformo-metanol, y el hexano-isopropanol menos tóxico se utilizan con
frecuencia para extracción inicial El método más común es mantener las muestras de lípidos
extraídos en el frío a -20º C hasta el análisis. Otras opciones de almacenamiento incluyen la
adición de un antioxidante, generalmente BHA. La preparación de la muestra a menudo es abierta
(baja presión) cromatografía usando diferentes proporciones (paso a paso) de dietil éter y hexano,
seguido por métodos de determinación de TLC, LC, SPE o HPLC de ácidos grasos u otros lípidos
fracciones. Algunos de los métodos GC requieren temperaturas muy altas y / o derivatización para
bajar el punto de ebullición para el análisis. Dado que la mayoría de estos métodos requieren altas
temperaturas, se debe tener cuidado para asegurar que los compuestos lipídicos sean no
degradado durante el análisis cromatográfico. Como en toda metodología, el paso a paso exacto
método debe seguirse para mayor precisión y precisión. Si se analizan los ácidos grasos para la
verificación de las variaciones de los métodos de grasa cruda, glicerol también debe ser tenido en
cuenta. Si un laboratorio elige verificar los resultados de esta manera, debe ser considera que esta
es la verificación del nivel de triacilglicérido en la matriz, y puede haber ser otras fracciones de
lípidos (fosfolípidos, ceras, colesterol, tocoferoles que variarán entre matrices) que no se tienen en
cuenta.

RESUMEN
Incluso la modificación menor de cualquiera de los métodos de grasa cruda produce un poco
diferente fracción y un ligero resultado diferente, y es, por lo tanto, aún un método diferente. Por lo
tanto, se debe tener cuidado con cualquier método empírico para seguir el método exactamente
como se indica.
Cualquier variación de un método o método que no se use dentro de su alcance debe ser validado
Llevar a cabo un perfil de ácidos grasos y la suma de los ácidos grasos para producir grasa total es
la mejor manera de evaluar la efectividad de un método de grasa en una matriz particular.
Recomendaciones: Debido a que el analito se define por el método, es crucial enfatizar que los
métodos de grasa se siguen exactamente y el método y el disolvente deben ser identificado en el
título del analito en un informe de análisis. Por ejemplo, "Crude Fat by AOAC" 920.39, Extracto de
éter de dietilo "o" Grasa bruta por AOAC 954.02, hidrólisis ácida ", etc. es incorrecto e inexacto dar
a cada uno de estos métodos el mismo nombre de analito cuando se dirigen / extraen diferentes
fracciones de lípidos.

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