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ARTIGO BIOQUIM

RESULTADOS

2.2. TA-tratamento melhorou placas de amilóide no cérebro de APP /

Ratos PS1

Na análise imuno-histoquímica, analisamos a quantidade de placas amilóides presentes no cérebro de camundongos APP-PS1. Uma ANOVA unidirecional encontrou uma diferença geral nos depósitos amilóides no córtex (F = 31,10, P <0,0001) e no hipocampo (F = 30,38, P <0,0001) de camundongos entre grupos. As deposições de Ab1-42 no córtex e no hipocampo dos ratinhos APP / PS1 foram significativamente maiores do que nos ratos de controle (P <0,001), enquanto o grupo TA tratou significativamente a deposição (P <0,001) em comparação com o grupo APP / PS1 . N = 6 por grupo.

2.3. O tratamento TA reduziu a resposta inflamatória crônica no

córtex e hipocampo dos ratinhos APP / PS1

Na análise imuno-histoquímica, utilizou-se um anticorpo anti-GFAP como indicação de astrócitos ativados. Uma ANOVA unidirecional encontrou uma diferença geral na expressão de GFAP no córtex (F = 77,03, P <0,0001) e o hipocampo (F = 86,51, P <0,0001) de camundongos entre grupos. Os níveis de GFAP no córtex e hipocampo dos camundongos APP / PS1 foram significativamente maiores do que nos ratos de controle (P <0,001), enquanto o grupo TA tratou significativamente (P <0,001) em comparação com o grupo APP / PS1. N = 6 por grupo. Veja a Fig. 3. Na análise imuno-histoquímica, utilizou-se um anticorpo anti-IBA1 como indicação da ativação da microglia. Uma ANOVA de sentido único encontrou uma diferença geral na expressão de IBA-1 no córtex (F = 28,71, P <0,0001) e o hipocampo (F = 66,42, P <0,0001) de camundongos entre grupos. Os níveis de IBA-1 no córtex e no hipocampo dos camundongos APP / PS1 foram significativamente maiores do que nos ratos de controle (P <0,001), enquanto o grupo TAtratment diminuiu significativamente (P <0,001, P <0,01) em comparação com a APP / Grupo PS1. N = 6 por grupo. Veja a Fig. 4.

2.4. O tratamento TA suprimiu o estresse oxidativo no córtex e

hipocampo de ratinhos APP / PS1

Na análise imuno-histoquímica, o 4-HNE foi medido como indicador de peroxidação lipídica. Uma ANOVA de sentido único encontrou uma diferença geral na expressão de 4-HNE no córtex (F = 60,60, P <0,0001) e o hipocampo (F = 35,22, P <0,0001) de camundongos entre grupos. As expressões de 4-HNE no córtex e hipocampo dos camundongos APP / PS1 foram significativamente maiores do que nos ratos de controle (P <0,001), enquanto o grupo de tratamento TA diminuiu significativamente (P <0,001) em comparação com o APP / PS1 grupo. N = 6 por grupo, ver Fig. 5a. Na análise imuno-histoquímica, o 8-OHdG foi medido como um indicador de oxidação do DNA. Um ANOVN de sentido único encontrou uma diferença geral na expressão de 8-OHdG no córtex (F = 38,72, P <0,0001) e no hipocampo (F = 56,60, P <0,0001) de camundongos entre grupos. As expressões de 8-OHdG no córtex e no hipocampo dos ratinhos APP / PS1 foram significativamente maiores do que nos ratos de controle (P <0,001), enquanto o grupo de tratamento TA diminuiu significativamente (P <0,01, P <0,001) em comparação com o grupo APP / PS1. N = 6 por grupo,

2.5. O tratamento TA aumentou os neurônios imaturos no giro dentado de Ratinhos APP / PS1

Na análise imuno-histoquímica, número de neurogênese, avaliado por doublecortin (DCX). Um ANOVN de sentido único encontrou uma diferença geral na célula positiva DCX no giro dentado (F = 43,61, P <0,0001) de camundongos entre grupos. Os números de DCX foram muito reduzidos nos ratos APP / PS1 (P <0,001) em comparação com os

ratos de controle. Embora o tratamento TA tenha impedido parcialmente a redução (P <0,001) em comparação com os camundongos APP / PS1. N = 6 por grupo.

2.6. TA-tratamento reverteu a diminuição dos níveis de BDNF no hipocampo de ratinhos APP / PS1

BDNF, um fator neurotrófico chave no cérebro, foi detectado pela análise de Western Blot. Uma ANOVA de sentido único encontrou uma diferença geral entre os grupos (F = 20,01, P <0,001). A expressão de BDNF no hipocampo foi reduzida no grupo APP / PS1 (P <0,001) em comparação com o grupo controle. O tratamento TA reverteu a diminuição (P <0,05) comparado ao grupo APP / PS1. N = 6 por grupo.

2.7. O tratamento TA reverteu a redução dos níveis de sinaptofisina

A sinaptofisina (SYN), um marcador sináptico, foi detectada pela análise de Western Blot. Uma ANOVA unidirecional encontrou uma diferença global entre os grupos (F = 20,46, P <0,001). O nível de SYN no hipocampo diminuiu no grupo APP / PS1 (P <0,001) em comparação com o grupo controle. Enquanto o TA-tratamento evita a redução (P <0,01) em comparação com o grupo APP / PS1. N = 6 por grupo. Veja a Fig. 7b

DISCUSSÃO 3. Discussão Os resultados demonstram pela primeira vez que o novo agonista do receptor GLP-1 / GIP / Gcg tem efeitos neuroprotetores claros no modelo de mouse APP / PS1 da AD. A formação de memória na tarefa de labirinto aquático espacial foi melhorada pela droga e a carga da placa amilóide no córtex e no hipocampo foi reduzida. Este resultado confirma as nossas descobertas anteriores de que os análogos GLP-1 ou GIP únicos podem proteger da perda de memória neste modelo de mouse de AD (Faivre e Holscher, 2013a, b; McClean et al., 2011; McClean e Holscher, 2014). A resposta inflamatória crônica, como se observa na ativação da microglia e dos astrócitos, é muito reduzida pela TA original, semelhante a agonistas únicos do receptor GLP-1 ou GIP (Duffy e Holscher, 2013; Ji et al., 2016a; McClean et al., 2011).

Os níveis do lipídeo peroxidado 4-HNE que também atua como um sinal pro-apoptótico nas mitocôndrias foram reduzidos pelo TA. 4-HNE é um dos marcadores da peroxidação lipídica da membrana induzida por radicais citotóxicos tais como? OH. 4-HNE tem propriedades citotóxicas, mutagênicas e genotóxicas e 4-HNE é relatado para estimular a apoptose via ativação da caspase 3 e induzindo o dano mitocondrial como mostrado na liberação do citocromo c (Ji et al., 2001). Os níveis do sinal de apoptose mitocondrial BAX (Kim et al., 2005) também foram reduzidos. Importante, a molécula de sinalização anti-apoptótica, linfoma Bcell 2 (Bcl-2), que é ativa nas mitocôndrias funcionais que possuem potenciais de voltagem da membrana interna normal (Kavitha et al., 2013) é regulada positivamente pelo TA, aumentando o efeito neuroprotetor. O nível de estresse oxidativo crônico como medida pelos níveis do nucleótido oxidado 8-hidroxiguanosina (8-OHdG) também foi reduzido pelo fármaco.

Neurogênese no giro dentado foi normalizado. Importante, os níveis do fator de crescimento chave BDNF foram normalizados no cérebro. O BDNF mostrou efeitos neuroprotectores claros em uma variedade de modelos animais de doença (Allen et al., 2013; Benedetti et al., 2014; Blurton-Jones et al., 2009; Nagahara et al., 2013). Um fator importante da atividade do BNDF é que ele mantém a atividade sináptica e protege as sinapses dos estressores (Kuipers e Bramham, 2006). A observação de que a sinaptofisina do marcador sináptico foi expressa em níveis normais após o tratamento TA também indica que os números sintáticos e a função foram melhorados no mouse AD. Já mostramos anteriormente que os análogos GLP-1 e GIP protegem as sinapses do estresse induzido por amilóides e as mantêm funcionais (Faivre e Holscher, 2013b; Gault e Holscher, 2008a; Gault e Holscher, 2008b; McClean e Holscher, 2014).

Recentemente, agonistas de múltiplos receptores foram desenvolvidos para tratar diabetes tipo II (Finan et al., 2013, 2015). Testamos novos agonistas de receptores GLP-1 / GIP duplos que apresentaram bons efeitos neuroprotetores

que são superiores aos análogos de GLP-1 únicos (Cao et al., 2016; Jalewa et al., 2017; Ji et al., 2016b; Yuan et al. al., 2017). A nova dupla agonista DA3-CH revelou-se superior à liraglutida em um modelo de camundongo da doença de Parkinson (Yuan et al., 2017), demonstrando que a estratégia de ativar mais de um tipo de receptor de incretina oferece uma vantagem em relação aos agonistas de receptores únicos. Aqui, mostramos que um novo agonista de receptores triplos também é promissor como um tratamento potencial para AD, mas outros testes de dose-resposta

e comparações diretas com outros medicamentos devem ser conduzidos para avaliar se esse novo medicamento é

superior aos anteriores. GLP-1, GIP e glucagon são membros da família de fatores de crescimento (Hölscher, 2016).

Os seus respectivos receptores são receptores acoplados de proteína de 7-membrana clássicos, receptores acoplados a proteína G que ativam a síntese de cAMP (Campbell e Drucker, 2013; Doyle e Egan, 2007; Holst et al., 2011). A ativação da cascata do segundo mensageiro cAMP-PKA-CREB induz uma série de processos citoprotectores, incluindo a normalização da utilização de energia, o reparo celular e a expressão gênica relacionada ao fator de crescimento (Holscher, 2014; Jalewa et al., 2016; Perry e Greig , 2004, Sharma et al., 2013). Importante, GLP-1 e GIP também possuem propriedades anti-inflamatórias. Astroglia e microglia expressam os receptores e a ativação destes reduz a resposta inflamatória (Duffy e Holscher, 2013; Jalewa et al., 2017; Parthsarathy and Holscher, 2013; Spielman et al., 2017). A inflamação crônica é o principal motor de distúrbios neurodegenerativos e uma redução da inflamação no cérebro mostra efeitos protetores (Akiyama et al., 2000; Clark et al., 2012; Lee et al., 2010).

Com base nos impressionantes dados pré-clínicos que demonstram a neuroproteção de tais fármacos, iniciaram-se ensaios clínicos que investigam os efeitos neuroprotetores dos agonistas do receptor GLP-1 exendin-4 (Byetta, Bydureon?) E liraglutide (Victoza?) Em pacientes com AD ou com Doença de Parkinson (PD). Um estudo piloto que testou a liraglutida analógica de GLP-1 em pacientes com AD apresentou resultados promissores. Em um ensaio duplo cego, controlado por placebo, os pacientes com AD não apresentaram deterioração na atividade cerebral, conforme medido na análise de PET 18FDG após 12 meses de tratamento com drogas. Em contraste, o grupo placebo apresentou reduções claras na atividade cortical conforme esperado para esta doença neurodegenerativa progressiva (Gejl et al., 2016). Um ensaio clínico de fase II está atualmente em curso (Hölscher, 2016).

Um teste experimental experimental exendin-4 em pacientes com DP apresentou bons efeitos (NCT01174810). Este estudo aberto avaliou os efeitos da exendina-4 em 45 pacientes. Houve melhorias claras na coordenação motora, como mostrado na avaliação da parte 3 do MDSUPDRS, e a cognição foi melhorada, conforme medido pela bateria de teste Mattis DRS-2, que foi projetada para avaliar deficiências cognitivas em pacientes com DP (Aviles-Olmos et al., 2013). Os pacientes foram re-testados 12 meses depois, e as diferenças no desempenho motor e nas pontuações cognitivas ainda eram visíveis (Aviles-Olmos et al., 2014). Um ensaio clínico controlado com placebo de fase II, duplo- cego, que testou a formulação semanalmente de exendina-4, Bydureon ?, confirmou os resultados do estudo piloto.

O grupo de drogas não se deteriorou na avaliação da parte 3 do MDS-UPDRS após 48 semanas de tratamento e, após

12 semanas de um período de lavagem, o efeito modificador da doença ainda era visível. Em contraste, o grupo placebo deteriorou-se ao longo do tempo como seria esperado nesta doença (Athauda et al., 2017). Além disso, iniciou-se um teste de fase II de liraglutida em pacientes com DP, testando pacientes em um estudo duplo cego, controlado por placebo por um ano (NCT02953665). Um outro ensaio clínico que teste o agonista do receptor de GLP-1 Lixisenatide em pacientes com DP está no planejamento.

Estes pré-clínicos muito promissores e os primeiros resultados clínicos demonstram a eficácia desses novos agonistas de receptores múltiplos que originalmente foram desenvolvidos para tratar diabetes tipo II, mas demonstraram efeitos neuroprotetivos consistentes em vários estudos. No presente estudo, o romance TA melhorou a aprendizagem e a memória, reduziu a carga de placa amilóide, inflamação crônica e estresse oxidativo, bem como a sinalização do estresse mitocondrial e liberação de BDNF melhorada e marcadores sinápticos enquanto normalizava a neurogênese no giro dentado. O novo agonista do receptor GLP-1 / GIP / Gcg triplo mantém uma clara promessa de ser desenvolvido para um novo tratamento para distúrbios neurodegenerativos crônicos, como a doença de Alzheimer.