TRABAJO PRACTICO Nº5:

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

NOMBRES: EVA REVECO

DIEGO MORALES
SECCION: 701
PROFESORES: ERIC HERDOCIO
FELIPE CAMPOS
FECHA ENTREGA: 31/05/17
 DISCUSION
Para comenzar, nos entregaron la muestra, que en este caso fue hígado de
pollo, a la cual se le agregó 100 Ml de suero y ULTRA-TURRAX, para lograr el
homogenizado total (HT)
Luego esta mezcla se mantiene en hielo, para evitar la activación de enzimas
y que estas ataquen nuestro organelo a estudiar.
De los 10 ml repartidos a cada grupo de trabajo, se guardó 1 ml de la muestra
en un tubo eppendorf que siguió en hielo y los 9 ml restantes fueron a la
centrifugación a 2500 RPM aprox. a 4ºc por 10 minutos.
Pasado el tiempo, el sobrenadante se transfiere a un tubo de centrifugación
para su recentrifugación por 20 minutos a 6000 RPM. El pellet precipitado
(Fracción nuclear), se conserva en hielo.
Luego de los 20 minutos, se separa el sobrenadante 2 del pellet, volviéndolo
a poner en otro tubo de centrifugación para repetir el proceso anterior por
20 minutos a 4ºc y 6000 RPM. El pellet sobrante (Fracción mitocondrial), se
conserva en hielo.
Finalmente, se guarda el ultimo el pellet (Fracción miscrosomal) y eliminar el
sobrenadante

En la segunda parte del practico, se analizó la fracción nuclear P1 obtenida de

la primera centrifugación. Esta, debe analizarse dos veces, la primera con
azul de tripàn y la segunda sin esta tinción.

Para terminar y comprobar que nuestro experimento fue un éxito, se le

agregó a cada tubo lo siguiente:
1) 400 μL de cada muestra (Control, HC, P1, P2, SN3)
2) 400 μL de agua (800 μL en el tubo control)
3) 100 μL de azul de metileno
4) 400 μL de succinato 0,1 M
5) 200 μL de vaselina (para minimizar la exposición al oxigeno del ambiente y
asi mantener las funcionalidades mitocondriales por largo tiempo)

Por último, se colocaron los tubos a un baño termorregulador

A 37ºC por 10 minutos.

OBSERVACION Y ANALISIS:
1º TUBO: El tubo nº1 es el llamado “control”, el cual no debería presentar
variabilidad en color, ya que esta muestra no contiene organelos de ningún
tipo.
2º TUBO: El tubo nº2 es el homogenizado crudo (HC), el cual debe contener
todos los organelos, incluidos mitocondrias y núcleos, ya que esta muestra es
previa a la centrifugación. El color correcto debería ser celeste verdoso.
3º TUBO: El tubo nº3 es la fracción nuclear (P1), la cual es el resultado de la
primera centrifugación, supuestamente contenedora solamente de núcleos.
Nuestro experimento no resultó así, dándonos un color verde, el cual no es
del todo convincente a la hora de comprobar si es que efectivamente
contiene solamente núcleos. Al comprobar con experimentos similares, el
color verde no es una opción correcta para este experimento, debido a que el
color mencionado se debe a la suspensión de mitocondrias.
Nuestra hipótesis del por qué existe una suspensión de mitocondrias en el
pellet, el cual debería llevar solamente núcleos es bastante sencilla, y se debe
a que la muestra se expuso a un excesivo uso de la velocidad de
centrifugación, haciendo pasar núcleos y mitocondrias a la vez.

4º TUBO: El tubo nº4 es la fracción mitocondrial (P2), en donde deberían

estar, valga la redundancia, las mitocondrias y que, por lo tanto, el color del
tubo debería ser blanco por la presencia de estas. Pero como explicamos
anteriormente, el tubo no puede lograr un color completamente blanco,
debido a que algunas de las mitocondrias bajaron en la primera
centrifugación y no están en todo su esplendor en P2.
Eso si, los resultados no están completamente erróneos, ya que se observa
un precipitado blanco en el tubo, que además es de color verde, el cual indica
la presencia de mitocondrias.

5º TUBO: el ultimo tubo es la fracción microsomal (SN3), donde se debería

encontrar vesículas del R.E.G.
El color resultante de esta muestra fue ser azul, debido a la carencia de
mitocondrias.
 CONCLUSIÓN
 Al momento de visualizar a través del microscopio la muestra
de P1, se logró ver gracias a la tinción colocada su contenido,
los núcleos.
 La experimentación de P1 no fue del todo exacta, pero se
puede rescatar algo de relevancia en el resultado final.
 Del método de fraccionamiento subcelular se puede concluir,
que es un procedimiento el cual sirve para aislar y separar los
componentes celulares. Sin embargo, nuestros resultados no
son del todo acertados, pero si la mayoría y que, a su vez, se
podría afirmar que el objetivo del practico y el uso y
experimentación del método se cumplió, el cual fue
reconocer a través de la centrifugación diferencial, las
densidades de los distintos organelos.

BIBLIOGRAFIA
 Biología celular y molecular de De Robertis, editorial El
Ateneo, 2004.
 Elementos de biología celular y genética, 1993.
 Biología Molecular de la Célula (Alberts), 2009.