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PROCEDIMIENTO GENERAL

PARA SECUENCIAR ADN

EXTRACCION

AMPLIFICACION

SECUENCIACION
Estructura del DNA

Polímero de Nucleótidos
TEJIDOS USADOS PARA LA
EXTRACCION DE ADN

1. Huesos, plumas, escamas, pelo,


musculo, piel, sangre, contenidos
estomacales.

2. Cerebro, genitalia, higado, riñón,


corazón (vertebrados), eritrocitos (no-
mamiferos), leche (mamiferos), puntas
de clips (anuros y lagartijas), muestras
de pelo y fecales (mamiferos),
embriones, gonadas y tejido muscular
(insectos).

3. Hojas, tallos, semillas, raices, flores,


polen, esporas, gametofitos.
Extracción de DNA

1. Lisis para liberar el DNA:


• Romper tejidos mecánicamente.
• Romper la membrana celular, precipitar
lípidos, proteinas, mantener estable el pH de la
solución.

2. Eliminación de proteinas
• Desnaturalizar de las proteinas por
calentamiento.
• Eliminar las proteinas.

3. Precipitación y limpieza del DNA


• Adherir el DNA a partículas de sílica.
• Diluir del DNA en solución.
ELEMENTOS BASICOS
EXTRACCION
Amplificación del DNA
Reacción en cadena de la Polimerasa
-PCR- (Polymerase Chain Reaction)

La Polimerasa (TAQ Polimerasa)


proviene de Thermus aquaticus

Aguas termales en el Parque Nacional Yellowstone


(USA) a 79-85ºC.

Tomado de: http://waynesword.palomar.edu/lmexer3b.htm


TERMOCICLADOR
Amplificación del DNA
Reacción en cadena de la Polimerasa

94 o 95ºC

Alineamiento
40-60ºC

72ºC

Al inicio: 95ºC. Al final: 72ºC, luego 4ºC


http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml
Amplificación del DNA

http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml
AMPLIFICACION:

Generacion de multiples copias de la region seleccionada usando


la reaccion en cadena de la Polimerasa PCR (Polymerase Chain
Reaction)

SOLUCION MAESTRA
H2O 9.3 µl
Buffer + MgCl2 2.5 µl
dNTPs 2.5 µl
BSA 2.5 µl
BETAINA 5 µl
F primer 1 µl
R primer 1 µl
Taq (Thermus aquaticus
DNA polimerasa) 0.2 µl
DNA (plantilla) 1 µl
______________________________
__
TOTAL 25 µl
VISUALIZACION
SECUENCIACIÓN