ESPECTROFOTOMETRÍA CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS

1. INTRODUCCIÓN:

En bioquímica, es necesario analizar la concentración de ciertos compuestos que juntos

forman parte de una sola mescla. Uno de los métodos más utilizados es el de
espectrofotometría. A través de la espectrofotometría podemos medir las ondas
electromagnéticas que las moléculas tienen la capacidad de absorber o emitir. Dichas
ondas se caracterizan por poseer diferentes longitudes de onda, las cuales pueden ser
medidos y cuantificados por un fotómetro (Macarulla, 1994).

La función del fotómetro es proyectar un haz de luz a través de una muestra y medir la
cantidad de luz que fue absorbida por la misma. Esto le permite indicar la concentración
de una sustancia presente en una muestra (Olsen, 1990). Es por esto que se usa la
espectrofotometría para medir las concentraciones de ciertas moléculas en una solución,
ya que al tener diferentes rangos de absorción de energía. Como por ejemplo, sabemos
que la mayoría de aminoácidos que componen a las proteínas absorben a 280nm se puede
poner objetivos específicos en cuanto a la medición (Macarulla, 1994). Normalmente se
utilizan dos tipos de longitudes de onda: El rango ultravioleta (180-380 nm) y el visible
(380-700 nm) (Macarulla, 1994).

En el presente trabajo se tratará de medir la concentración de proteínas en una muestra a

partir de la concentración de una muestra conocida.

2. Objetivos

Objetivo general

Conocer cuál es la concentración de proteína en una muestra problema, a partir de una

muestra estándar conocida.

Objetivos específicos

Realizar un espectrofotómetría para conocer la absorbancia de la muestra problema y la

muestra estándar.

Hacer una curva de calibración para conocer la absorbancia adecuada de la muestra

problema.

Obtener la fórmula de la regresión lineal de la curva de calibración y realizar los cálculos

para obtener la concentración de proteínas de la muestra problema.

3. METODOLOGIA

1. Se realizan los cálculos para la curva de calibración para obtener concentraciones

de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mg/m L.
2. Se pesan 10mg de BSA (SIGMA) y se diluye en 1mlde agua destilada esteril.
 3. Se hacen las diluciones para obtener concentraciones de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mg/m
L.
4. Se mide la absorbancia de estas concentraciones en el espectrofotómetro a una λ
280 nm.
5. Con los datos obtenidos se registran los datos en excel y se realiza un gráfico de
concentración vs absorbancia.
6. Se realizan las diluciones de la clara de huevo para obtener la absorbancia que
este dentro del rango.
7. Una vez obtenida la absorbancia se realizan la ecuación x= y-b/m, donde y es la
absorbancia, m y b son constantes que se obtienen de la ecuación de la curva de
calibración y donde x es la concentración de proteínas que hay en la clara de
huevo.

4. RESULTADOS:

De acuerdo a las concentraciones proporcionadas (mg/ml) a partir de una solución stock

de 10mg/ml de albúmina, se realizó la curva de calibración, empleando la relación
concentración-volumen C1V1=C2V2 y la posterior espectrofotometría, obteniendo los
siguientes datos:

Tabla No. 1: CURVA DE CALIBRACIÓN

Concentración Sc. Stock Vol H2O Vol (uL) Absorbancia

(mg/ml) (uL)
0.2 20 980 0.155
0.4 40 960 0.346
0.6 60 940 0.482
0.8 80 920 0.641
1 100 900 0.788
Volumen Final: 1000uL (1ml)

Mientras tanto se realizaron las siguientes diluciones de muestra problema (clara de

huevo):
Tabla No. 2: DILUCIONES MUESTRA PROBLEMA
DILUCIÓN ABSORBANCIA
1/10 2.671
1/100 0.111
1/1000 0.017
1/10000
1/50 0.528

Finalmente se ingresaron los datos en Excel y con los datos de la curva de calibración, el
despeje del valor x a partir de la ecuación obtenida y teniendo en cuenta el factor de
dilución y=0.528 en esta ecuación, se obtiene la concentración total de proteína en la
muestra problema, multiplicada por el factor de dilución (50):
 Curva de Calibración
0.9
0.8 y = 0.7805x + 0.0141
R² = 0.9973
0.7
0.6
Curva de Calibración
0.5
0.4
Linear (Curva de
0.3 Calibración)
0.2
0.1
0
0 0.5 1 1.5

1. DISCUSIÓN:

Al realizar el estudio de la concentración de proteínas en una muestra problema, se tomó

en cuenta la cantidad de luz que pueden absorber las mismas, lo cual se encuentra dentro
del rango de 275 a 280 nm. El cual es producto de dos aminoácidos aromáticos: Trp, Tyr,
dicho rango existe gracias a residuos de Trp y Tyr que se encuentran en las proteínas
analizadas (Schmid, 2001). Esto permitió la especificación de la molécula a analizar el
momento de realizar la espectrofotometría, cuyo principio fundamental consiste en medir
la cantidad de luz que es absorbida y a su vez dar información acerca de la cantidad de
luz transmitida; para esto el espectrofotómetro emite 10 fotones por segundo, parte de los
cuales no son absorbidos, dándonos a conocer no solo la absorbancia sino también la
transmitancia tras varios cálculos (Barwick, 2003).
Se debe recalcar que antes de realizar la medición de la solución problema, es necesaria
la calibración del espectrofotómetro, para lo cual se utilizó una curva de calibración.
Dicha curva fue tomada con un analito conocido, en este caso debido a que las mediciones
tentativas fueron de proteínas, el analito utilizado fue: albúmina, una proteína. Al realizar
la curva de calibración, el objetivo es crear un rango con un máximo y un mínimo, además
de ciertos puntos específicos dentro del mismo, con el que se compara la muestra
problema con el propósito de saber si las mediciones hechas son confiables. Esta
comparación es hecha debido a que la espectrofotometría, como muchos de los análisis
instrumentales no es absoluta sino relativa (de Galan, 2014). En el caso particular del
experimento, un vez hecha la curva de calibración se procedió a las mediciones
obteniendo como resultado varias muestras fuera del rango (0,155-0,788); lo cual obligó
a que se realicen nuevas diluciones hasta lograr entrar dentro del rango permitido
obteniendo así, 0,528 en una solución 1/50. Con un resultado aceptable, se hizo la
regresión lineal de la ecuación empírica que viene a ser la curva de calibración, con el
afán de obtener la absorbancia en función de la concentración que es el valor a encontrar
(Stone & Ellis, 2006). Una vez obtenido el valor de la concentración de la muestra
problema (0,67) con un margen de error superior al o.99 se aceptó el resultado como
correcto. Obteniendo así una concentración total de proteína de 33mg, contenida en la
muestra problema, clara de huevo. Se debe considerar la posibilidad de cierto tipo de
errores, aunque el grado de error fue aceptable. Errores como: obtención de un volumen
menor por causa de mal pipeteo, impurezas en las paredes de la cubeta, burbujas en la
muestra el momento de ingresar al espectrofotómetro, etc.

2. CONCLUSIONES:

 Es necesario realizar una curva de calibración con un analito conocido, para tener
un rango que nos permita realizar las mediciones con la muestra problema y
obtener un resultado con un alto grado de confianza.
 Al realizar las respectivas mediciones con la muestra problema, se encuentra que
dependiendo de la concentración, la muestra es aceptada o descartada, según se
encuentre dentro o fuera del rango obtenido con el analito conocido
respectivamente.
 Al analizar los datos obtenidos, se debe tener en cuenta los posibles errores en el
manejo del material y de los equipos de medición.
3. BIBLIOGRAFIA:

Baarwiick, V. [en línea]. Preparation of Calibration Curves. Ver (Septiembre del 2003).
(Consulta: 28 de Agosto de 2014). Disponible en :
<http://www.nmschembio.org.uk/dm_documents/LGCVAM2003032_xsJGL.pdf>.

de Galan, J. [en línea]. Linear Calibration Curve. Ver 2014. Noruega. (Consulta: 28 de
Agosto de 2014). Disponible en:
<http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=ksckzDsHqnOxmOlIEcCzBkB&sub
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Macarulla, J., Goñi, F. [en línea]. Bioquímica humana: curso básico Ver 1994.
Barcelona, España. Editorial Reverté. (Consulta: 28 de Agosto de 2014). Disponible en:
<http://books.google.es/books?id=4h_IosytGvkC&pg=PA48&dq=espectrofotometria&
hl=es&sa=X&ei=oP7_U72EIISONozogYgK&ved=0CFYQ6AEwCA#v=onepage&q=e
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Olsen, E. [en línea]. Métodos ópticos de análisis. Ver 1990. Barcelona, España. Editorial
Reverté. (Consulta: 28 de Agosto de 2014). Disponible en:
<http://books.google.es/books?id=gtRcq1g4DmYC&pg=PA149&dq=metodo+espectrof
otom%C3%A9trico&hl=es&sa=X&ei=e_3_U-
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Schmid, f. [en linea]. Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry. Ver

2001. Alemania. (Consulta: 28 de agosto de 2014). Disponible en :
<http://www.life.illinois.edu/biochem/455/Lab%20exercises/2Photometry/spectrophoto
metry.pdf>.

Stone, D., Ellis, J. [En línea]. The regression line. Ver 2006. Canada. (Consulta: 28 de
Agosto de 2014). Disponible en: <
http://www.chem.utoronto.ca/coursenotes/analsci/StatsTutorial/RegrEqn.html>.