Georgina Mitjans Domenech

CUESTIONARIO PRÁCTICA 9

1.Qué valores de DO600 obtienes en los pre-cultivos saturados, en su dilución inicial 1:20, y

en el momento de inducir los cultivos? Estima el tiempo de duplicación del cultivo en esta

fase, y discute si este valor se aproxima y o no al tiempo de duplicación de 20 min en

condiciones optimas.

2.Discute los motivos por los que se realiza la dilución 1:20, por qué la inducción con IPTG se

hace cuando el cultivo alcanza una DO600 de 0,3-0,5, y por qué la inducción se realiza a 25

grados y no a 37 grados.

Se realiza la dilución 1:20 ya que, si se mantiene la alta concentración inicial de lípidos, la

absorbancia que se obtiene en someter las muestras al espectròmetro, se obtienen unos valores

fuera del limite de detección , es decir, no se puede fijar un valor de absorbáncia. La inducción

con IPTG se hace cuando el cultivo alcanza una D600 en este rango porque se considera que

entre estos valores, el cultivo se encuentra en fase de crecimiento , es decir, es la fase en que se

obtienen medidas más precisas. También, se realiza la inducción a 25 grados y no a 37 para evitar

que el crecimiento siga avanzando cuando queremos parar-lo.

3.Explica el fundamento de la separación de lípidos mediante TLC. Describe la naturaleza

química en la fase estacionaria, de la fase móvil, y de los compuestos lípidos que queremos
separar , así como las interacciones que se dan entre ellos durante su separación

cromatografica.

La cromatografía es una técnica que se utiliza para separar e identificar los

componentes de una mezcla. Se basa en el reparto de cada compuesto entre una fase móvil y

una fase estacionaria. El reparto se produce sobre la fase estacionaria, que tiende a retener el

compuesto por adsorción. La fase móvil discurre a través de la fase estacionaria y tiende a

arrastrarlo . Los componentes de la mezcla se separan porque responden de forma distinta a

las fuerzas de adsorción/desorción. En la TLC la fase estacionaria es silicagel y la fase móvil

una mezcla de disolventes (eluyente). El eluyente se selecciona de acuerdo con los lípidos que se

desean separar: los lípidos neutros se separan con eluyentes apolares y los lípidos cargados con

eluyentes polares. Cada lípido migra a una distancia característica en función de su polaridad que

le hace identificable al compararlo con patrones.

4. Cómo explicas el patrón de manchas en la TLC obtenido en la cepa de E.coli que expresa

GT MG517 respecto al control? En base a la bibliografía (Romero-García et al, 2013), a

qué tipo de sustancias lipídicas corresponde cada una de las manchas de la TLC? Qué

tipo de análisis podríamos realizar para confirmar su identidad? 


1 2 3 4 5 6
1. lípido

2 lípido

3 lípido

4 glicoglicerolipido

5 glicoglicerolipido

6 glicoglicerolipidos

7. triaciglicerido

En el patrón de manchas en la TLC obtenido en la cepa de E.coli se encuentran 3 partes muy

diferenciadas: por una parte, en la parte superior (mas alejada de la linia de carga) se

encuentran los componentes apolares de la muestra, en este caso los triacigliceridos de la

muestra, que se alejan al máximo de la linea de carga. A continuación, se pueden

distinguir dos tipos de manchas. Las 3 primeras, se trata de las 3 muestras de E.coli

control (sin el plasmido) , es decir, sin la GT MG517 , y en cambio, en las 3 muestras

siguientes, E.coli tenia el plasmido incorporado y las manchas tienen lugar a dos alturas en

la misma linea, es decir, hay presencia de glicoglicerolipidos, y no solo de lípidos como las

3 manchas de E.coli control.

5. Consideras que la glicosiltransferasa GT MG157 de Mycoplasma genitalium es activa en

E.coli? Por qué?

Sí, la glicosiltransferasa GT MG157 de Mycoplasma genitalium es un enzim que en E. coli es actiu

sempre i quan sigui transferit a traves d’un plasmid artificialment, és a dir, E.coli no es

capaç de sintetitzar-lo per ella mateixa. Un cop es trasfereix la glicosiltransferasa, comença

a sorgir efecte en la sintesi de glicoglicerolipidos en la bacteria.


6. Explica el fundamento del revelado universal de la TLC con ácido sulfúrico, y discute

por qué los distintos lípidos de la muestra presentan distintas coloraciones en la TLC? 


El revelado universal de la TLC con ácido sulfúrico se basa en la degradación que provoca

el acido fuerte concentrado a la materia orgánica, en este caso los glicoglicerolípidos

(lípidos y glúcidos) sintetizados por la glicosiltransferasa. Los distintos lípidos de la muestra

presentan distintas coloraciones en la TLC ya que dependiendo de la estructura que

presente la biomolecula en cuestion, será degradada con mayor o con menor efectividad,

es decir, obtendrá mas coloración o menos dependiendo de la facilidad del acido para

degradar estos lípidos.

7. Discute cómo podríamos determinar los niveles de expresión de la GT MG517

respecto la cepa control, y elabora un protocolo de purificación y detección en E.coli

(sistema heterólogo).