Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias (FICA)

IBT611 - ENZIMOLOGÍA

GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Ingeniería en Biotecnología

Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias| Guía para Prácticas de Laboratorio 1

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Presentación

La presente Guía para Prácticas de Laboratorio ha sido desarrollada para que los
estudiantes de la asignatura de Enzimología dispongan de la información necesaria para la
realización de las prácticas correspondientes de acuerdo a los temas, objetivos y
resultados de aprendizaje definidos. En este documento se incluye el proceso en el
laboratorio de experimentación e investigación, con los respectivos recursos y resultados
esperados, para que el estudiante pueda desarrollar su práctica-taller y la elaboración de
sus respectivos informes o cualquier otra evidencia de aprendizaje, que serán evaluadas
con las rúbricas que constan en los anexos.

La Guía presenta una secuencia donde se especifica cada sesión de prácticas en

laboratorio con su respectivo proceso didáctico y formativo.

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ASIGNATURA: Enzimología SIGLA: IBT611 PARALELO: PERIODO:

1y2 2017-2

Fecha: PRÁCTICA SESIONES: 2 TEMA: Determinación de parámetros cinéticos de

11/04/2017 No: 2 una enzima.
12/04/2017

1.- OBJETIVO

General:

- Determinar experimentalmente el valor de los parámetros cinéticos de velocidad máxima

y constante de disociación de la enzima lipasa.

Específicos:

- Obtener datos cuantitativos mediante espectrofotometría continua, de la actividad

cinética de lipasa en la degradación de p-nitrofenol palmitato.
- Calcular los valores de los parámetros cinéticos a partir de los datos obtenidos en el
laboratorio.

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

Adquirirás las siguientes habilidades:

- Adquirir destreza en el método espectrofotométrico para la cuantificación continua de la

actividad enzimática.
- Aplicar la teoría de las reacciones cinéticas simples en medios homogéneos, para la
determinación de parámetros cinéticos

3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS

Materiales:

- 5 celdas espectrofotométricas
- 5 tubos para microcentrífuga (eppendorf)
- Puntas para Micropipetas de 1000 µL y 200 µL
- Vaso de precipitación de 100 mL y 250 mL

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- Micropipetas de 1000 µL y 200 µL

Reactivos:

- Enzima lipasa de Rhizopus arrhizus

- P-nitrofenil palmitato a distintas concentraciones
- Buffer tris HCl, pH 8.

Equipos:

- Espectrofotómetro

4.- METODOLOGÍA

4.1. FASE DE LABORATORIO

El p-nitrofenol palmitato es un sustrato utilizado en técnicas enzimáticas para la medición de la

actividad lipasa. Este sustrato es incoloro y consta de una molécula de p-nitrofenil unida mediante
un enlace éster a una molécula de palmitato. Al adicionar una enzima con actividad éster
hidrolasa, se rompe el enlace que une estas dos moléculas y se libera el p-nitrofenil, que en estado
libre tiene un color amarillo. A medida que avanza la reacción, se puede determinar la
concentración de p-nitrofenil en el tiempo mediante espectrofotometría, de este modo y a través
de una curva de calibración previamente elaborada, se puede obtener el valor de la velocidad de
reacción a partir de una regresión lineal en un gráfico concentración de p-nitrofenil versus tiempo.
La velocidad será equivalente a la pendiente de la ecuación obtenida por su regresión lineal.

A los estudiantes se les proveerá de los reactivos previamente preparados, 5 tubos de micro-
centrífuga cada una con distintas concentraciones de p-nitrofenil palmitato, el buffer Tris HCl y la
enzima. El alumno deberá colocar en la celda espectrofotométrica las siguientes cantidades:

 Tris HCl: 1,3 mL

 Sustrato (p-nitrofenil palmitato): 25 µL.

Mientras la enzima no se haya adicionado a esta mezcla, no habrá reacción. El estudiante deberá
tener todo listo antes de iniciar sus actividades en el espectrofotómetro. Una vez que los
estudiantes tengan todo listo, se procederá a encender el espectrofotómetro, con la supervisión
del docente o algún ayudante, y se colocan los siguientes parámetros en el software de control
“Thermo Insight”, en la opción “Tasa” (rate):

 Tipo “longitud de onda individual”

 Medida “Hora de inicio (seg) = 0” “Hora de fin (seg) = 180”, “Intervalo (seg) = 5”
 Instrumento “Longitud de onda = 420 nm”
 Muestras “Número de muestras = 5”

A continuación, iniciar la medida. El equipo solicitará el blanco, el cual corresponderá a cada una

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de las celdas preparadas anteriormente (sin enzima). A continuación, el equipo solicitará la
muestra 1, solo en ese instante se deberá agregar la enzima a la celda en la siguiente cantidad:

 Enzima lipasa de Rhizopus arrhizus: 10 µL

Se agita brevemente y se coloca cuidadosamente la celda en el espectrofotómetro, se realiza la

medición. El proceso se lo repetirá con las 5 muestras.

Finalmente, los datos serán almacenados y entregados a los estudiantes para su respectivo
procesamiento.

4.2. FASE PROCESAMIENTO DE DATOS

A partir de los datos del protocolo y las medidas de los volúmenes utilizados en la preparación de
las soluciones, los estudiantes deberán calcular en primera instancia las diferentes
concentraciones del sustrato. Para la preparación de las distintas concentraciones de sustrato se
partió de una solución estándar 6,2 mM de sustrato, de la cual se tomaron distintos volúmenes y
se mezclaron con distintos volúmenes de disolvente. Los datos para la preparación de las distintas
concentraciones de sustrato se muestran a continuación.

Tabla 1: Tabla para la preparación de concentraciones de sustrato

Volumen estándar de sustrato Volumen de disolvente
6,2 mM [µL] [µL]
400 600
450 550
500 500
550 450
600 400
650 350
700 300

A continuación, deberán realizar los 5 gráficos de concentración de p-nitrofenil versus tiempo,

correspondientes a cada una de las distintas concentraciones de sustrato y obtener por regresión
lineal cada una de las pendientes (velocidades de reacción).
Con estas velocidades a las distintas concentraciones de sustrato, graficar utilizando cualquier
método de linealización (Lineaweaver-Burk, Eadie-Hofstee, etc) y determinar los valores de Km y
Vmáx de la enzima.

En el informe se deben presentar TODOS LOS CÁLCULOS DE FORMA EXPLÍCITA, así como las
unidades. La respuesta final deberá expresarse en unidades de mM/mL (enzima).min para la
Vmáx y en unidades de mM para Km. El informe se presentará según el formato establecido para
Informes de laboratorio de la carrera, subido al aula virtual.

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5.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:)

Cinética en fase homogénea, determinación de parámetros cinéticos, métodos de linealización,

curvas de calibración en método espectrofotométricos.
Se deberá contar con los resultados de la primera práctica de laboratorio, en la cual se obtuvo la
curva de calibración para el p-nitrofenil.

Descripción de la actividad:
La actividad involucra el uso del espectrofotómetro, curvas de calibrado y métodos de
linealización para la determinación de parámetros cinéticos en el área de enzimología. El
análisis de datos es de vital importancia para poder llevar a cabo el laboratorio de modo
adecuado, ya que pequeñas fallas en el cálculo de concentraciones o de métodos lineales,
implican grandes diferencias en las respuestas finales de Km y Vmáx.

6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Bisswanger, Hans. (2013) Practical Enzymology. John Wiley & Sons: Germany.

Liu, K., Wang, J., Bu, D., Zhao, S., McSweeney, C., Yu, P., Li, D. (2009). Isolation and biochemical
characterization of two lipases from a metagenomics library of China Holstein cow rumen.
Biochemical and Biophysical Research Communications.

Illanes, A. (2010). Enzime Biocatalysis, Principles and Applications. Berlin, Germany: Springer.

Tripathi, G. (2009). Enzyme Biotechnology, Jaipur, IND: Global Media (Libro virtual).

7.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS

La rúbrica para los informes de laboratorio se encuentra subida al aula virtual, al igual que el
formato de presentación de informes.

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