QUI-325

Análisis Instrumental
1 Sem 2018- CSJ

Laboratorio N°1: Espectroscopía UV-VIS

Producción de Bioetanol y determinación de Glucosa

1.- Objetivos:

- Análisis colorimétrico del producto de fermentación de glucosa.

- Obtención de espectros en el rango UV-Vis de los reactivos involucrados en la reacción,
así como del producto de la reacción.

2.- Introducción:

Reacción de fermentación de glucosa: La levadura de cerveza, “saccharomyces

cerevisiae”, es capaz de fermentar muchos azúcares simples, tales como el monosacárido
glucosa o el disacárido sacarosa, para generar alcohol (etanol) y CO2.
La conversión de glucosa a etanol pasa por varios intermediarios, pero se considera los
productos finales según la siguiente reacción:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 (g)

Determinación de glucosa: La determinación de glucosa se realiza mediante el uso de

ácido 3,5-dinitrosalicílico, método DNS para azúcares reductores. Al combinar un azúcar
reductor con el ácido 3,5-dinitrosalicílico, el grupo funcional aldehído o el grupo funcional
cetona del azúcar, son oxidados a grupos carboxilos, mientras que el ácido 3,5-
dinitrosalicílico es reducido a ácido 3-amino,5-nitrosalicílico, el cual tiene una coloración
naranja cuya intensidad es proporcional a la concentración del azúcar. La determinación de
la absorbancia se realiza a una longitud de onda de 540 [nm].

3.- Materiales y Reactivos:

3.1.- Materiales:

- Vaso de precipitados de 100 [mL].

- Pipeta aforada de 1 [mL].
- Pipeta aforada de 5 [mL].
- Pipeta graduada de 10 [mL].
- Tubos con tapa rosca.
- Matraz aforado de 10 [mL].
- Cubetas de polimetilmetacrilato (PMMA) de 1 [cm] de paso óptico
- Cubetas de vidrio de 1 [cm] de paso óptico.
- Cubetas de cuarzo de 1 [cm] de paso óptico.

3.2.- Reactivos y soluciones:

- Agua desionizada.
- Solución de glucosa 0,01 M.
- Solución de NaOH al 10 %.
- Solución de reactivo DNS (*).

(*) Reactivo DNS: Ácido Dinitrosalicílico 1%

Tartrato de sodio 30%
Hidróxido de sodio 1,6%

3.3.- Equipos:

- Espectrómetro UV-VIS THERMO EVOLUTION 220.

- Espectrofotómetro JENWAY, Modelo 6300.

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4.- Trabajo experimental:

4.1.- Producto de fermentación de glucosa (muestra problema):

- Se pone en contacto una solución de glucosa al 8% con esferas de levadura-alginato en

un matraz erlenmeyer con tapón de goma y sello de fermentación.
- Se deja a temperatura ambiente durante una semana.
- Después de esta semana se obtiene la Muestra Problema, correspondiente al producto
de fermentación de glucosa.
-

4.2.- Preparación de la curva de calibración

- A partir de la solución de glucosa 0,01 M, tomar las alícuotas mencionadas en la

siguiente tabla y aforar al volumen indicado con agua desionizada.

Calibración Alícuota Patrón Glucosa Volumen aforo Concentración

0,01 M (mL) (mL) Glucosa (M)
Punto 1 5 0,001
Punto 2 10 0,002
Punto 3 20 50 0,004
Punto 4 40 0,008

4.3- Desarrollo de color y medida de absorbancia

- Transferir exactamente 1 [mL] de cada una de las soluciones de calibración y de

muestra problema (en triplicado) a diferentes tubos con tapa rosca. Llevar además,
un blanco de reactivos.
- A cada tubo adicionar ~3 gotas de solución de NaOH al 10% y 1 [mL] de solución de
reactivo DNS
- Homogeneizar la solución de cada tubo y dejar en baño a ebullición por 5 min.
- Retirar del agua caliente y enfriar en baño con hielo por 5 min.
- Traspasar a matraz de aforo de 10 [mL] y aforar con agua desionizada.
- Dejar reposar por 15 min.
- Leer la absorbancia de cada punto de la curva, la muestra y el blanco de reactivos a
una longitud de onda λ= 540 [nm], frente a un blanco con agua

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4.4.- Obtención de espectros en la región UV-VIS:

-Ajustes y selección de condiciones en Espectrómetro UV-VIS:

Al encender el equipo éste realiza automáticamente una calibración interna y ajustes del
sistema óptico. Una vez que termina de realizar este test de calibración está en
condiciones de ser usado:

a) Seleccionar el modo de trabajo, en este caso es “Barrido” o “Scan”. En este modo se

obtienen espectros de absorción.

b) Seleccionar el rango de longitudes de onda entre las cuales se obtendrá el espectro

de absorción.

Observación: El rango UV (ultravioleta) se considera habitualmente entre 200 y 350

nm aproximadamente. El rango VIS (visible) se considera habitualmente entre 350 y 700
nm aproximadamente.

c) Realizar un barrido utilizando solvente puro en las cubetas. Esto corresponde a una
“línea base” o “background”

d) Obtener los espectros de las siguientes soluciones detalladas en la Tabla, colocando

en una de las cubetas la muestra y en la celda de referencia el solvente puro:

Compuesto λ barrido (nm)

Producto de la reacción Glucosa-DNS 350 - 700
Reactivo DNS 350 - 700
Glucosa 200 - 700
Vainillina 200 - 700

e) Además se le entregará un espectro para cálculo del coeficiente de absortividad

molar, Є.

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Pauta Informe de Laboratorio

El informe debe incluir:

- Una breve descripción del trabajo realizado (Introducción, máximo 10 líneas)

- Resultados (según pauta).
- Referencias bibliográficas.
- Todos los registros de los espectros obtenidos, identificados y numerados.

Resultados:

a) Obtenga la regresión lineal de la calibración de la glucosa. Grafíquela y exprese el

coeficiente de correlación (r2)

b) Calcular el contenido de glucosa en la muestra fermentada, expresado como

concentración Molar e incluyendo el límite de confianza (95% confianza)

c) Determine el %Error, desviación estándar y desviación estándar relativa (C.V)

d) En base a los espectros de absorción del reactivo DNS (ácido dinitrosalicílico) y del
producto de la reacción DNS-glucosa (ácido 3-amino,5- nitrosalicílico), explique por qué la
medición de absorbancia debe efectuarse a una longitud de onda mayor a 500 [nm].

e) Explique y fundamente por qué debe efectuarse una reacción de la glucosa con el reactivo
DNS para este tipo de análisis.

f) Considerando los espectros obtenidos de Glucosa y Vainillina, explique (en base a sus
estructuras químicas) las diferencias observadas.

g) Calcule el coeficiente de absortividad molar “Є”, para el compuesto asignado en el

laboratorio, a la longitud de onda indicada, y explique cada término de la Ley de Lambert-
Beer.

Referencias:

1. “Análisis Instrumental”; Skoog, Holler y Nieman, 5a edición; Capítulos 13 y 14.

2. “Métodos Instrumentales de Análisis”; Willard, Hobart H.; Merritt, Lynne L (Jr); Dean, John
A.; Settle, Frank A. (Jr).

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