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ZONA XALAPA
PROGRAMA EDUCATIVO:
INGENIERÍA AMBIENTAL
TESIS
Experiencia Recepcional
P r e s e n t a:
Asesor:
Al Dr. Epifanio Morales Zarate y la Dra. Yolanda Cocotle por los consejos
brindados a lo largo de mi tesis.
II
ÍNDICE
RESUMEN ................................................................................................................ 1
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 2
3. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 3
5. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 15
6. OBJETIVOS ........................................................................................................ 16
6.1 OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 16
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 16
III
7.2.2 QUÍMICO ....................................................................................................... 18
7.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA .................................................................................... 18
7.4 DETERMINACIÓN DE RENDIMIENTOS ................................................................... 19
7.5 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES ..................................................... 19
7.6 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ........................................................... 20
7.7 ACTIVIDAD DE CELULASAS TOTALES ................................................................... 20
7.8 ACTIVIDAD ESPECÍFICA ...................................................................................... 21
7.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS .................................................................................... 21
8. RESULTADOS ..................................................................................................... 21
8.1 PRE TRATAMIENTO ALCALINO ............................................................................. 21
8.2 PRE TRATAMIENTO ÁCIDO .................................................................................. 24
8.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA .................................................................................... 27
8.3.1 A PARTIR DEL PRE TRATAMIENTO ALCALINO ..................................................... 27
8.3.2 A PARTIR DEL PRE TRATAMIENTO ÁCIDO .......................................................... 30
8.4 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS Y CELULASAS ............................................................... 32
9. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 33
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
V
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA 6. ANÁLISIS DE VARIANZA DE DOS VÍAS DEL PRE TRATAMIENTO NaOH. ............... 22
TABLA 8. ANÁLISIS DE VARIANZA DE DOS VÍAS DEL PRE TRATAMIENTO H2SO4. .............. 26
VI
Resumen
1
1. Introducción
2
Sin embargo, dichos residuos pueden ser reincorporados al medio ambiente al
someterse a un proceso de compostaje o vermicompostaje, o estos subproductos
pueden servir como una materia prima para otros procesos fuera de la industria
cafetalera, como la producción de etanol a partir de azúcares reductores totales,
llegando a tener un valor agregado, contribuyendo en la reducción del impacto
ambiental negativo por contaminación de suelo, agua y aire. La pulpa de café, es
el residuo de mayor volumen dentro del beneficio, representando el 56% del
volumen del fruto y el 40% del peso seco del grano (Anacafé, 1999). Sin
embargo, existen pocos estudios realizados en el campo de generación de ART,
particularmente para uso en biocombustibles, a partir de la pulpa de café (Braham
y Bressani, 1978). Este trabajo se basa en encontrar, entre un tratamiento ácido y
otro alcalino; el mejor para después de una hidrólisis enzimática obtener la mayor
concentración de azúcares reductores totales, proceso del cual no se encontraron
referencias.
3. Justificación
3
lignina, estos, al ser tratados de forma física, química, biológica o una
combinación entre ellos y posteriormente ser sometida a una hidrólisis enzimática,
se podrían obtener azúcares reductores; que son la base para la obtención, por
ejemplo, de biocombustibles de segunda generación y de prebioticos. En este
trabajo se busca estudiar a la pulpa de café, pre tratada por medios químicos y
biológicos, como posible residuo con potencial para la generación de azúcares
reductores totales.
4. Marco teórico
4
En la Fig. 1 y 2 se muestra la producción de café en el 2013 en México y los 10
mayores productores en Veracruz, respectivamente; según datos del Servicio de
Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP, 2013) de la Secretaría de
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación(SAGARPA).
FIGURA 1. PRODUCCIÓN DE CAFÉ EN MÉXICO, (SIAP, 2013).
5
En el proceso del café poco menos del 5% de la biomasa generada es
aprovechada para la elaboración de la bebida, el resto queda en forma de
residuos. En el proceso del café existen dos etapas donde se generan los
residuos, la primera es en la recolección del fruto donde se generan tallos, hojas,
ramas y frutos verdes que se caen y la segunda es en el proceso de extracción
del grano de café conocido como beneficio de café. Este proceso incluye todas
aquellas operaciones que eliminan la pulpa, mucílago y pergamino, dejando los
granos de café listos para ser tostados y es donde se produce la mayor cantidad
de subproductos residuales como el mucilago, pulpa, borra, cisco y aguas del
remojo de la pulpa; siendo la pulpa el de mayor volumen consistiendo cerca del
44% del volumen total del grano (Rodríguez y Zambrano, 2010).
El fruto del café está compuesto por 5 partes (Fig. 3, Coste, 1968):
6
FIGURA 3. COMPOSICIÓN DEL FRUTO DE CAFÉ (TOMADO DE COSTE, 1968).
La pulpa de café es el principal residuo sólido del beneficio húmedo del grano de
café, constituyendo entre el 42 y el 44% del peso del grano de café. Según datos
de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
(FAO, por sus siglas en inglés), en 1996 la producción mundial de residuos de
café se estimó cerca de 22 millones de toneladas métricas (TM) de pulpa, 2.4
millones TM de mucílago y 8.6 de pergamino (FAO, 2000) Por lo que la pulpa de
café representa una materia prima lignocelulósica de interés. La pulpa posee
sustancias químicas útiles para la alimentación (azúcares libres, proteínas,
hemicelulosas, celulosa) como se muestra en la Tabla 1; pero a su vez contiene
sustancias con un posible efecto anti fisiológico (cafeína, ácido caféico, fenoles
libres, polifenoles), es decir, sustancias que han mostrado efectos nocivos o
toxicos en animales (Bressani & Braham, 1978); además contiene taninos
hidrolizables y condensados (Tabla. 2).
7
Tabla 1. Constituyentes de paredes celulares y polisacáridos estructurales en la pulpa de café.
Tomado de (Elias, 1978).
Constituyente %
Contenido celular 63.2
Fibra detergente neutra 36.8
Fibra ácida detergente 34.5
Hemicelulosa 2.3
Celulosa 17.7
Lignina 17.5
Proteína lignificada 3
Proteína cruda 10.1
Cenizas insolubles 0.4
8
Por su naturaleza, los pre tratamientos se pueden dividir en cuatro grupos: físicos,
físico-químicos, químicos y biológicos (Sun y Cheng, 2002), como se muestra a
continuación (Tabla 3).
Tabla 3. Tipos de pre tratamiento (Modificado de Abril y Navarro, 2012; Cuervo et al, 2009)
Tratamiento Método Observaciones
Físico Pulverizado • Molida en molinos de bolas (0,2 a
mecánico 2,0 mm), de cuchillas o martillos
(3 a 6 mm).
• Residuos de maderas, maíz,
bagazo de caña y pajas.
Pirólisis • T>3000°C Hidrólisis con H2SO4
1N, 970°C 2,5 horas de los
residuos de maderas y residuos
de algodón.
Físico- Explosión con • Se emplea H2SO4 , SO2 y CO2
Químico vapor como catalizador.
catalizada • Es el proceso más empleado.
con ácidos • Funciona bien con astillas de
maderas duras, menos con
suaves.
Explosión con • Altos consumos de energía con
amoniaco maderas.
(AFEX) • El AFEX no genera inhibidores.
Químico Ácidos • Efectivo para residuos agrícolas.
diluidos • Menos eficiente para maderas y
(H2SO4, cultivos energéticos.
HCl,H3PO4) • Problemas de corrosión.
Ácidos
orgánicos
Organosolv • Preferido para fraccionar
biomasa.
• Extrae lignina de gran calidad.
• Es un proceso caro.
Biológico Bacterias y • Amigables con el ambiente e
Hongos incrementan la accesibilidad al
material celulósico.
• Alto rendimiento del producto, las
condiciones moderadas de la
reacción, la poca generación de
compuestos tóxicos.
9
4.5.1 Pre tratamiento Físico
Los pre tramientos físicos son todos aquellos que solo cambian la estructura física
del material (molido, picado, pulverización), es el primer proceso que se lleva a
cabo para tener mejor acceso a la celulosa para la hidrólisis. La composición de
los materiales lignocelulósicos, constituidos por celulosa, hemicelulosas y lignina,
forman una estructura compleja muy difícil de ser penetrada y atacada por
agentes químicos solamente, por ello, es necesario que se lleve a cabo un pre
tratamiento físico, esto es para “romper” la estructura y así facilitar los procesos
posteriores (McMillan, 1994;Viñals-Verde, 2012).
10
4.5.2.2 Pre tratamiento ácido
Una de las desventajas al utilizar este tipo de pre tratamiento radica la acción
corrosiva del ácido sobre los equipos empleados en el procedimiento, lo que
causa un deterioro de las partes metálicas que este pueda tener, también existe la
degradación de los carbohidratos hidrolizados a compuestos derivados del furano,
como el furfural proveniente de la hidrólisis de las pentosas y el 5-
hidroximetilfurfural (5-HMF) por hidrólisis de las hexosas, compuestos que pueden
causar una inhibición en la fase de la fermentación. En la Tabla.4 se muestran
diferentes pre tratamientos usados para diversos sustratos.
11
Tabla 4. Parámetros de pre tratamientos usados para diversos sustratos
Los trabajos realizados con sub productos del café en materia de biocombustibles
han utilizado el mucilago (Delesma y Morales, 2006) , pulpa de café combinado
12
con mucilago para biogás (Cabrera et al., 1987) y los jugos de la pulpa de café
para biogás (Calzada et al.,1987).
13
Cellulasas Trichoderma La hidrólisis enzimática con (Rebolledo,
reesei celulasas de Trichoderma reesei, y 2013)
la fermentación de los azúcares de
manera simultánea con Zimomona
mobilis y Saccharoyse cerevisiae,
inmovilizadas en matrices de
alginato-quitosan, se generó
etanol, aunque con bajos
rendimientos.
Por otra parte, Alarcón (2010) utilizó harina de yuca y malanga con el fin de
determinar las mejores condiciones para la hidrólisis enzimática, usando a las
enzimas α-amilasa y amiloglucosidasa, bajo tres factores: temperatura (60 y
90°C), concentración de ácido sulfúrico (1 y 5% (v/v)) y tiempo de hidrólisis (1 y 5
14
h). El análisis de superficie de respuesta mostró que la respuesta fue mínima en
los puntos centrales para ambos tubérculos y que, con un nivel de confianza del
95%, las mejores condiciones para la hidrólisis enzimática fueron: 73.6 ° C, pH
4.08 y 24h, con un rendimiento de 0.64 g glucosa / g de harina de yuca.
Rebolledo (2013) utilizó bagazo de caña pre tratándolo con NaOH al 2%(p/v) con
un tiempo de 15 min en autoclave (1.2 Kg/cm2, 120°C), obteniendo 0.471± 0.038
g/L de azúcares reductores, utilizando celulasas de Trichoderma reesei (2.9 u/L) y
realizando una fermentación con Zymomonas mobilis y Saccharomyces
cerevisiae inmovilizadas en perlas de alginato-quitosano, obteniendo un
rendimiento de etanol de 52±12.18% con una productividad de 0.003±0.001 g/L/h.
5. Hipótesis
15
6. Objetivos
7. Materiales y métodos
16
Recolección*de*
la*pulpa
Secado*
Pre*tratamiento*
Físico
Tratamiento*
Tratamiento* Químico*
Químico*(H2SO4) (NaOH)
Determinación de*
ART
Tratamiento*
enzimático
Análisis*
estadístico
Representación*
de*resultados
Discusión de*
resultados
17
7.2 Pre tratamiento de pulpa
7.2.1 Físico
7.2.2 Químico
Previo a los análisis se preparó una curva patrón usando glucosa (Anexo. 1).
19
7.6 Determinación de proteínas totales
20
7.8 Actividad específica
La actividad específica es el cociente de actividad enzimática (expresada en
unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas, es la velocidad a la que
una enzima completa una reacción química y produce un producto químico final.
La actividad específica de una enzima describe la velocidad enzimática por
miligramo de enzima (Garret y Grisham, 2013).
8. Resultados
21
3.5
2
3.0 1.5
1
2.5 0.5
0
ART(g/L)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
15
30
60
5
Tiempo (min)
SC Grados SM F p
de
libertad
β0 Intercepto 754.79 1 754.79 7769.30 0.00
β1 Concentración 156.89 4 39.22 403.75 0.00
22
Donde β0 (el intercepto), β1, β2 y β3, son los coeficientes de la ecuación
correspondiente a las variables predictoras; X1 valor de la concentración del
NaOH, X2 valor del tiempo, X3 el producto del tiempo * concentración, e es el
error.
Tabla 7. Rendimientos de conversión del pre tratamiento alcalino (% en base a ART generados en
cada tiempo de pre tratamiento).
23
por acción del hidróxido de sodio, que los destruye, los rendimientos de
conversión positivos (datos en negro) nos indica que la generación o liberación de
azúcares es mayor que el consumo de los mismos y los datos en azul son los
valores mas altos obtenidos.
Dentro de todos los datos, encontramos dos que son los más altos, los cuales
superan el 70% de rendimiento de conversión, en la tabla anterior se confirma que
el mejor tratamiento fue la condición de 5 minutos y una concentración del 2%
(w/v) de NaOH, obteniendo un rendimiento de conversión de 72.42%. A su vez, el
análisis de varianza y el Tukey previamente mostrados, sustentan que este fue el
mejor tratamiento, el cual fue el que se utilizó para la siguiente fase; la de
hidrólisis enzimática.
A diferencia del pre tratamiento alcalino, en el pre tratamiento ácido no existe una
pérdida de azúcares, esto es por que el acido trabaja directamente a hidrolizar la
celulosa a diferencia del hidróxido que trabaja sobre la lignina y reduce la
cristalinidad y polimerización de la celulosa, es por esto que los ART aumentaron
de 5.48 ±0.11g/L con 5 min de reacción a 7.57 ±0.23 g/L con 60 min; usando 1%
de ácido. Las condiciones que generaron más ART fueron 1 y 1.5 % de ácido
sulfúrico (7.57 ±0.23 y 7.87 ±0.18 g/L, respectivamente; Fig. 6).
24
8.5
8.0 0
7.5 0.5
7.0 1
6.5
1.5
6.0
5.5 2
5.0
ART(g/L)
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
15
30
60
5
Tiempo (min)
25
Tabla 8. Análisis de varianza de dos vías del pre tratamiento H2SO4.
SC Grados SM F p
de
libertad
β0 Intercepto 1874.463 1 1874.463 30434.00 0.000000
β1 Concentración 370.915 4 92.729 1505.55 0.000000
β2 Tiempo 16.063 3 5.354 86.93 0.000000
β3 Concentración 12.747 12 1.062 17.25 0.000000
* Tiempo
e Error 3.695 60 0.062
Ecuación y=β0+β1X1+β2X2+β3X1X2+ e
26
Tabla 9. Rendimientos de conversión del pre tratamiento ácido. (% en base a ART generados en
cada hora de tratamiento)
Tiempo Concentración
g/L Rendimiento de conversión
(min) (v/v)
0 1.19 Control
0.5 2.29 91.91
5 1 5.49 360.39
1.5 6.24 423.41
2 5.82 388.36
0 1.24 Control
0.5 2.36 90.07
15 1 6.39 415.11
1.5 6.94 458.95
2 6.64 435.34
0 1.32 Control
0.5 2.98 126.47
30 1 6.72 410.33
1.5 7.10 439.40
2 5.54 320.72
0 1.79 Control
0.5 4.04 125.43
60 1 7.54 320.14
1.5 7.88 339.06
2 5.76 221.08
27
los azúcares, siendo muy marcado en la segunda hora, donde casi ha sido
duplicada la cantidad de azúcares liberados, en las horas posteriores la
liberación de azúcares se incrementó paulatinamente, obteniéndose la máxima
concentración (6.32±0.13 g/L) después de 8 horas de hidrólisis enzimática (Fig.
7).
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ART(g/L)
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
0
8
Tiempo(h)
En la Figura. 7 se observa una pendiente pronunciada entre los puntos del tiempo
0 h y 2 h indicando que la tasa de conversión de la enzima es muy rápida en esos
puntos, posteriormente a esos puntos, la producción de ART es más lenta; sin
embargo, la enzima continúa activa hasta las 8 horas de reacción.
28
Tabla 10. Análisis de varianza de una vía de la hidrólisis alcalina.
SC Grados SM F p
de
libertad
β0 Intercepto 1182.18 1 1182.18 3442.65 0.000000
β1 Tiempo 14.44 5 2.88 8.41 0.001278
e Error 4.12 12 0.34
Ecuación β0+β1x1+e
El análisis estadístico y la prueba Tukey nos marcan que el mejor tiempo para la
máxima liberación de azúcares fue a las 5 horas (datos en rojo).
Tabla 11. Rendimientos de hidrólisis enzimática después del pre tratamiento con NaOH (% en
base a ART generados en cada hora de tratamiento).
29
9.5
9.0
8.5
8.0
g/L
7.5
7.0
6.5
6.0
0
Tiempo (h)
De forma contraria al tratamiento con NaOH, la pendiente formada por los puntos
de los tiempos 0 h y 2 h no es tan marcada como en el tratamiento alcalino, pero
la pendiente formada por los puntos de los tiempos 0 h y 4 h se incrementa
abruptamente, y a partir de la esta última hora comienza a ser muy poca la
generación de azúcares. Esto quiere decir que la tasa de conversión enzimática
se ve favorecida por el tratamiento alcalino, debido a que fue mayor que la
registrada con el tratamiento ácido (Fig. 7 y 8). Posiblemente las condiciones
30
ácidas degradaron un poco a la enzima o existen inhibidores enzimáticos
generados bajo condiciones ácidas, lo que provocó una tasa menor. La enzima
fue más eficiente bajo condiciones alcalinas (Fig. 6).
El análisis de varianza indica que los azúcares reductores fueron afectados por el
tiempo de reacción (Tabla.12).
Tabla 12. Análisis de varianza de una vía de la hidrólisis posterior al pre tratamiento ácido.
SC Grados de libertad Sm F p
β0 Intercepto 1182.187 1 1182.187 3442.650 0.000000
β1 Tiempo 14.444 5 2.889 8.412 0.001278
e Error 4.121 12 0.343
Ecuación β0+β1x1+e
De acuerdo a la prueba de Tukey, para la hidrólisis enzimática después del pre
tratamiento ácido, el mejor tiempo de reacción durante la hidrólisis fue de 4 horas
(Fig.8).
Tabla 13. Rendimientos de conversión durante la hidrólisis enzimática del pre tratamiento con
H2SO4 (% en base a ART generados en cada hora de tratamiento).
31
8.4 Análisis de proteínas y celulasas
NaOH NaOH
1.2 400
1.1 350
Proteinas (mg/ml)
1.0 300
Celulasas (u/L)
0.9 250
0.8 200
0.7 150
0.6 100
0.5 50
0.4 0
0
8
Tiempo (h) Tiempo (h)
a) b)
H2SO4 H2SO4
1.2 400
1.1 350
Proteinas (mg/ml)
300
Celulasas (u/L)
1.0
0.9 250
0.8 200
0.7 150
0.6 100
0.5 50
0.4 0
0
32
Con los resultados anteriores se calculó la actividad específica, la cual indica que
no hubo diferencias entre las actividades enzimáticas de ambos tratamientos
(alcalino y ácido; Fig. 10)
NaOH H2SO4
400 400
Actividad específica (U/g)
8
0
Figura 10. Actividad Específica, a) hidrólisis con pre tratamiento alcalino y b) hidrólisis con
tratamiento acido.
Por ultimo, con la actividad específica se confirma que la enzima sigue presente y
puede continuar generando azúcares en el medio.
9. Discusión
Para poder validar los resultados presentados en este trabajo, se compararon con
los resultados de autores, que trabajaron de manera similar diferentes sustratos
para obtener azúcares y algunos llevándolos hasta la fermentación.
33
Mateus et al.(2012), usando 15 g de pasto marafalfa, obtuvieron los mejores
resultados a 150°C y concentraciones de ácido de 0.8% y 1.2% (v/v); y a 130°C
con concentraciones de 2% (v/v), los autores indican que la temperatura a la que
se lleva acabo el pre tratamiento influye de forma importante para hidrolizar la
glucosa del sustrato, y que, a su vez, una alta temperatura (190°C) puede formar
inhibidores como lo es el furfural y el 5-HMF.
En este trabajo solo se manejó una sola temperatura que fue a 120ºC, dando
buenos resultados en la obtención de los azucares con las concentraciones
utilizadas.
34
conversión de los azúcares iniciales a 8 horas de hidrólisis, bajo condiciones
alcalinas. Lo anterior está en acorde a lo reportado por Contreras y Córdoba
(2012), usando Bagazo de Caña de Azúcar, con condiciones de 121°C, 90 min,
10 ml al 2%(p/p) de hidróxido/ g de bagazo, 8 FPU/g, 8 g/L de bagazo y tamaño
de partícula de 1,41 a 3,36 mm y 52h de hidrólisis, obtuvieron 83.6% de
conversión azúcares reductores y, aumentando a 20 FPU/g sin modificar las
demás variables, obtuvieron 91.7% de conversión de azúcares.
Como este trabajo se basó en las técnicas usadas por Rebolledo, es el trabajo
con el que se puede comparar directamente, aunque los sustratos son muy
diferentes se observan tendencias muy parecidas, como se muestra la
concentración seleccionada de las pruebas de pre tratamiento que mejor
resultados fue al 2%(p/v); los tiempos de hidrólisis donde se obtuvieron la
obtención de azucares mas significativa fue a las 5 horas con el hidróxido de
sodio y a las 4 horas con el ácido, resultados similar al obtenido por la hidrólisis
con BCA que fue a las 6 horas.
35
sacarificación, es decir, se podría considerar este tratamiento como posible
candidato con algunas mejoras.
Por otro lado se observó que las celulasas de Trichoderma reseei trabajaron sin
problemas en los medios ácidos y alcalinos, al igual que con la pulpa de café.
Por ultimo, la hipótesis inicial de este trabajo fue la obtener al menos el 50% de
rendimiento en el proceso de hidrólisis química y posterior hidrólisis enzimática.
Teniendo rendimientos máximos de 284.6% con el tratamiento alcalino y de
135.75% con el tratamiento ácido, los resultados indican que con la hidrólisis
enzimática, posterior al tratamiento de la pulpa de café con NaOH 2%(p/p) y 5
min; y con el tratamiento con ácido sulfúrico al 1% (v/v) y 60 min, se alcanza
rendimientos de conversión superiores al 50%, planteados al inicio.
10. Conclusiones
36
11. Recomendaciones
37
12. Bibliografía
Abril, A., & Navarro, E., (2012), Etanol a partir de biomasa lignocelulósica, Cuba,
Editorial Aleta.
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41
Anexo.1 Curva patrón de azúcar
0.5, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.5, 1.7 y 1.9 g/L. Desarrolle la reacción con el reactivo DNS
(mismo método que para las muestras).
Replicas
Concentración (g/L) 1 2 3 Promedio (g/L) DS
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Anexo.2 Tampón CITRATO
Soluciones Stock
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