Extracción de enzima polifenol-oxidasa

García-Báez, A., Martínez-Cervantes, E., Padilla-Molina, A. K.

01-02-18/14-02-18

OBJETIVO GENERAL

Se prepararán las soluciones amortiguadoras pertinentes para la extracción de la enzima polifenol oxidasa por medio
del tejido vegetal de la manzana verde “Granny Smith”. Determinando el efecto de la concentración del sustrato y la
temperatura sobre la actividad enzimática.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Se realizaran los cálculos para las soluciones amortiguadoras que se usaran posteriormente para la
extracción de enzimas con tejidos vegetales.
 Se extraerá a partir del tejido dé la manzana la enzima poliferol oxidasa y se determinará el efecto de la
concentración del sustrato sobre la actividad enzimática.
 Se extraerá a partir del tejido de la manzana la enzima poliferol oxidasa y se determinará el efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimática y así determinar la temperatura óptima.

METODOLOGÌA

 Redacción objetiva del procedimiento realizado

El tejido vegetal (Granny Smith), fue adquirido del centro comercial. La enzima de manzana se llevó a cabo bajo el
protocolo expuesto por la Dra. Lizette Liliana Rodríguez VerásteguiL la manzana se homogenizo en buffer de fosfatos.
La mezcla fue centrifugada por 30 minutos y se recolecto el sobrenadante en tubos falcon para realizar las prácticas
establecidas.

La actividad de PFO fue determinada aplicando el método propuesto por Espin et al., (1995) utilizando un
espectrofotómetro. Se determinó experimentalmente la longitud de onda correspondiente a la máxima absorción para
ambos pigmentos, formados por la oxidación de catecol por PFO de manzana. Estos valores están de acuerdo con el
rango de máxima absorción (390-480 nm) para quinonas reportado por Stauffer (1989).

De esta manera, se determinó la actividad de la enzima midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm para manzana.
La velocidad inicial fue calculada a partir de la pendiente de la curva absorbancia versus tiempo. Para los distintos
ensayos se utilizó solución buffer a los que se adicionó catecol. Se realizaron medidas de absorbancia a la respectiva
longitud de onda de máxima absorbancia, cada 30 segundos, durante 30 minutos.

La actividad de PFO de manzana fue obtenida a distintas temperaturas comprendidas entre 10 y 60°C al pH óptimo de
cada una de ellas. La mezcla de buffer y sustrato fue incubada hasta lograr la temperatura deseada. La actividad de
PFO a la temperatura específica fue determinada espectrofotométricamente por adición del extracto de la enzima a la
mezcla tan rápidamente como fue posible.

A los efectos de determinar la estabilidad térmica de PFO, se incubó a las temperaturas 10, 20, 30, 40, 50 y 60°C.
Luego la mezcla fue enfriada en baño de hielo, y una vez alcanzada la temperatura ambiente, se agregó el sustrato y
finalmente se determinó la actividad leyendo absorbancia a 420 nm.

Los datos obtenidos a partir de los perfiles de actividad térmica se utilizaron para analizar parámetros termodinámicos
relacionados con las reacciones de pardeamiento. Los datos para la inactivación térmica de la enzima fueron calculados
comparando los cambios en la actividad luego del calentamiento a las distintas temperaturas respecto de la enzima sin
calentar.

Se analizó el efecto inhibitorio de ácido cítrico (0.05M), una solución amortiguadora a base de ácido cítrico (0.1M) y
fosfato dibasico de sodio (0.1M) sobre la actividad de PFO de manzana, frente a catecol como sustrato. Para tal base
de fin, se realizaron absorbancias utilizando (2000-0 mL) de buffer pH óptimo, el extracto enzimático (250 mL) y catecol
(0-1750 mL) como sustrato, en presencia de las distintas concentraciones del inhibidor.
  Diagrama de flujo
Extracción de la enzima
polifenol oxidasa
Simbología
Practicas realizadas.
Pasos generales para
todas las prácticas
Paso diferente y crucial
de cada práctica.
Preparación de reactivos
para la extracción
enzimática de
polifenoloxidasa en
vegetales
polifenol oxidasa en
vegetales”
Extracción de la enzima
polifenol oxidasa y efecto de la
concentración de sustrato
sobre su actividad
Agregar la cantidad de enzima,
sustrato y solución
amortiguadora establecida en
el cuadro 1. Y mezclar durante
10 s
Extracción de la enzima
polifenol oxidasa y efecto de la
temperatura sobre su actividad
enzimática
Agregar la cantidad de enzima
y sustrato e incubar en el baño
maría de acuerdo al cuadro 1.
Y mezclar durante 10 s
Extracción de la enzima polifenol
oxidasa y efecto de inhibidores
sobre su actividad enzimática”
Agregar la cantidad de enzima
y sustrato einhibidor según sea
el caso. Y mezclar durante 10 s
Preparar cada solución a
utilizar en el proceso de
extracción.
 Solución
amortiguadora de
fosfatos.
 EDTA
 PVPP
 PMSF
 Solución de
sustrato (catecol)
 Solución
amortiguadora de
ácido cítrico
Fase 1 de la práctica. Extracción de la enzima
Meter al congelador el vaso de
la licuadora
Pesar 15 g de tejido vegetal y
triturar con 45 ml de solución
amortiguadora de fosfato la
cual debe contener 2 mM de
EDTA, 50 g/L de (PVPP) y
1mM de PMSF.
Filtrar el homogenado con
gasa y centrifugar a 14,000
rpm g a 4ºC por 30 minutos.
Colectar el sobrenadante en
tubos falcón perfectamente
limpios y secos
Colocar en una gradilla 12
tubos de ensayo
perfectamente limpios y secos.
Todos los tubos se miden en el
espectrofotómetro a 420 nm
por 3 minutos en intervalos de
30 segundos.
RESULTADOS

0.01
0.0088
Absorbancia

0.008
0.0063
0.005 0.005
0.0016
0 0.0011
30 60 90 120 150 180
Tiempo

Ilustración 1 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con 250s/250e (Concentración)

0.2
0.1742
Absorbancia

0.1476
0.1 0.12
0.0946
0.0701
0.0531
0
30 60 90 120 150 180
Tiempo

Ilustración 2 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con 250s/500e (Concentración)

0.3
Absorbancia

0.2 0.2004 0.2114

0.1563
0.1 0.1155
0.07620.0978
0
30 60 90 120 150 180
Tiempo

Ilustración 3 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con 250s/750e (Concentración)

0.3 0.2794
Absorbancia

0.2447
0.2 0.2077
0.1552
0.1 0.1103
0.0656
0
30 60 90 120 150 180
Tiempo

Ilustración 4 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con 250s/1000e (Concentración)

0.5
0.4 0.3906 0.4075
Absorbancia

0.3 0.3302
0.2675 0.2831
0.2 0.1919
0.1
0
30 60 90 120 150 180
Tiempo

Ilustración 5 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con 250s/1250e (Concentración)

 1
Absorbancia 0.7824
0.63140.7169
0.5 0.5246
0.2882
0.2005
0
30 60 90 120 150 180
Tiempo

Ilustración 6 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con 250s/1500e (Concentración)

0.8
0.7312
Absorbancia

0.6 0.6565
0.567
0.4778
0.4 0.3782
0.2
0
30 60 90 120 150
Tiempo

Ilustración 7 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con 250s/1750e (Concentración)

0.4
0.389
0.38 0.3804
Absorbancia

0.36 0.3639
0.34 0.3373
0.32
0.3
0 30 60 90
Tiempo

Ilustración 8 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa cuando se presenta temperatura de 10°C

1.28
1.26 1.2594
Absorbancia

1.24 1.246
1.2348
1.22 1.2175
1.2
1.18
0 30 60 90
Tiempo

Ilustración 9 Actividad enzimáticade la enzima polifenol oxidasa cuando se presenta temperatura de 20°C

0.5
0.4 0.3865 0.4036
Absorbancia

0.3497
0.3
0.2
0.1
0 0.017
0 30 60 90
Tiempo

Ilustración 10 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa cuando se presenta temperatura de 30°C
 0.45
Absorbancia 0.4076
0.4 0.3952
0.3665 0.3822
0.35
0.3
0 30 60 90
Tiempo

Ilustración 11 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa cuando se presenta temperatura de 40°C

0.42
0.4112
0.4047
Absorbancia

0.4
0.3936
0.38 0.3764
0.36
0.34
0 30 60 90
Tiempo

Ilustración 12 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa cuando se presenta temperatura de 50°C

0.4
0.39 0.392
0.3818
Absorbancia

0.38
0.37 0.368
0.3664
0.36
0.3551
0.35
0.34
0.33
0 30 60 90 120
Tiempo

Ilustración 13 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa cuando se presenta temperatura de 60°C

1
0.8755
0.8 0.7894
Absorbancia

0.6816 0.6257
0.6 0.5619
0.4
0.2
0
0 30 60 90 120
Tiempo

Ilustración 14 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con Ácido cítrico (inhibidor) en tiempo de 0 a 2 minutos

1.2
1 1.0261
0.9409
Absorbancia

0.8 0.8097
0.6 0.6104
0.4 0.4848
0.2
0
0 30 60 90 120
Tiempo

Ilustración 15 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con Ácido Cítrico (inhibidor) en el tiempo de 2 a 4 minutos
 1
0.8
Absorbancia
0.7767 0.7704
0.7048 0.6693
0.6
0.523
0.4
0.2
0
0 30 60 90 120
Tiempo

Ilustración 16 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con Ácido cítrico (inhibidor) en el tiempo de 4 a 6 minutos

1
Absorbancia

0.8446
0.5726 0.6388
0.5 0.4634

0
0 30 60 90
Tiempo

Ilustración 17 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con Ácido cítrico (inhibidor) en el tiempo de 6 a 8 minutos

0.8
0.7026 0.6606 0.7185
Absorbancia

0.6 0.5851
0.4733
0.4
0.2
0
0 30 60 90 120
Tiempo

Ilustración 18 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con Ácido cítrico (inhibidor) en el tiempo de 8 a 10 minutos

1
0.8 0.7809
Absorbancia

0.7298
0.6 0.6615
0.5634
0.4
0.2
0
0 30 60 90
Tiempo

Ilustración 19 Actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa con Ácido cítrico (inhibidor) en el tiempo de 10 a 12 minutos

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

De acuerdo a la ilustración 1 en donde la cantidad de sustrato es la misma que la cantidad de enzima, se demuestra
que la actividad enzimática obtenida llega a un punto maxico y decrece, esto por la falta de sustrato en la muestra, a
comparación de la ilustración dos en donde la actividad es lineal ya que la cantidad de sustrato aumento el doble del
volumen pero en la ilustración 3 en donde hay más cntidad de sustrato que de enzima, se nota que hay un
decrecimiento mayor pero también mayor actividad después de mas tiempo.En la ilustración 4 hay mas variaciones
ya que la cantidad de sustrato es mayor a la de la enzima, por lo que hay mayor variación en su actividad.

Esto se debe a que la enzima polifenol oxidasa tiene

CONCLUSIONES

García-Báez, A.

Se determinó que al pasar el tiempo hay mayor actividad enzimática de la enzima polifenol oxidasa y baja actividad
enzimática en la fase inferior esto de acuerdo a la concentración; al aplicar temperatura en la enzima esta se vuelve
mayor, es constante hasta que se aplica más aumento de temperatura, a mayor temperatura menor actividad
enzimática; cuando un inhibidor entra en contacto con la enzima se percibió que esta pudo ser constante pero en al
paso del tiempo está ya no es constante y disminuye su actividad enzimática.

Martínez-Cervantes, E.

Se extrajo e inhibió la enzima polifenol-oxidasa del tejido vegetal de manzana verde “Granny Smith” con ayuda de las
soluciones amortiguadoras realizadas en el laboratorio a base de cálculos mediante la fórmula de Henderson-
Hassenbalch para los diferentes ensayos realizados con la finalidad de observar la actividad enzimática de esta,
determinando el efecto de la concentración de sustrato, de la temperatura y del ácido cítrico actuando como inhibidor,
graficando los resultados obtenidos de las absorbancias vs tiempo, para así obtener la pendiente y finalmente graficarla
vs tiempo, comparando y discutiendo resultados obtenidos se observa que la enzima PO de esta manzana presenta
una temperatura optima de 30ºC, aunque este parámetro puede ser una variante ya que hay cambios de temperatura,
se observa que a mayor concentración de sustrato mayor actividad enzimática, al mismo tiempo que mayor cantidad
de inhibidor menor actividad enzimática. Todo esto llevado a cabo en base a métodos físicos y químicos realizados en
el laboratorio de la universidad politécnica de Tlaxcala.

Padilla-Molina, A. K.

La actividad enzimática de la manzana verde se debe a una enzima llamada “poliferol-oxidasa”, esta actividad se
controló usando métodos físicos y químicos como la reducción de temperatura. En este caso nuestra temperatura
óptima fue de 30°C, controlando también la concentración y usando como inhibidor al ácido cítrico que disminuye el
pardeamiento de las frutas.

BIBLIOGRAFÍA