Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
n-butanol a attiré l'attention dans le contexte (Dong et al., 2012; Dürre, 2008). Alors que plus de 80
milliards de litres d'éthanol sont utilisés actuellement comme carburant de transit (Smith et al.,
2012), le butanol n'est pas utilisé aujourd'hui comme combustible de transit dans une mesure
significative, bien qu'il ait un impact potentiel sur la transformationmodécodynamique des hydrates
de carbone, de la densité énergétique et physique. propriétés plus fongibles avec l'essence, par
exemple avec un pipeline (Dürre, 2008). La voie de n-butanol la plus étudiée est celle de
Clostridium acetobutylicum et d'autres clostridies apparentées qui ont été utilisées à partir des
années 20 dans le processus de Weizmann (Jones et Woods, 1986). Les gènes impliqués dans le
parcours ont été clonés, les protéines ont été caractérisées (Boyntonetal, 1996, Fischer et al., 1993,
Petersen et Bennett, 1991, Stim-Herndon et al., 1995), et les mécanismes de contrôle associés au
rasage acide et dissolvante étude (Gheshlaghi et al., 2009). Dans C. acetobutylicum, les gènes
primaires responsables de la production de n-butanol sont thl, hbd, crt, bcd, etfA, etfAB, adhE2 et
quiactiventetactiventlesbosubstratsacétyl-CoAandbutyrylCoAforethanoletn-butanolproduction,
respectivement.Manymesophilesincluding Escherichiacoli, Bacillussubtilis, Pseudomonasputida et
Lactobacillusbrevis ont été mis au point pour produire du n-butanol par expression hétérologue de
ces gènes à partir de C. acetobutylicum (Atsumietal., 2008; Berezinaetal., 2010; Inuietal., 2008;
Nielsenetal., 2009). Utilisation des processus biotechnologiques de type bactérien, antimicrobien et
anaérobie, ont été mis au point pour permettre aux agriculteurs potentiels de tolérer des
changements potentiels, y compris un risque réduit de contamination, des taux de réaction plus
élevés et des coûts différentiels plus faibles pour le chauffage et le refroidissement (Barnard et al.,
2010; 1979). La SoucheM571 de Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum (anciennement
Clostridiumthermosaccharolyticum) a été rapportée pour produire du n-butanol (Freierschroderetal.,
1989) bien que ce ne soit pas systématique (Demainetal., 2005; Hilletal., 1993; Mistry et Cooney,
1989). De plus, le n- Cependant, les bactéries putatives responsables de la production de n-
et 65 ° C et entre 4,0 et 6,8 (Shawetal., 2008a). T.saccharolyticum est capable d'utiliser une variété de
sarments trouvés dans la biomasse le glucose, le xylose, le mannose, le galactose, et l'andabinose. Il
peut catalyser le xylane, un composant important de la biomasse cellulosique, ainsi que le
de H2, en dirigeant le flux de carbone et d'électrons vers l'éthanol (Shawetal., 2008b, Shawetal.,
2009). En allégeant ses capacités d'utilisation et sa disponibilité de développé, T.saccharolyticum est
un hôte intéressant pour la production de n-butanol hétérologue. Ici, l'ingestion de
Des expériences de transformation de .saccharolyticum allstrain ont été faites à55 1C inTSC1medium
(Shawetal., 2011), contenant par litre - 5 gofcellobiose, 1,85 g de (NH4) 2SO4, 0,05 g de FeSO4 ?
7H20, 1,0 g de KH2PO4, 1,0 g
(200 ug / ml). Des comparaisons de croissance ont été faites dans du milieu TSD (Shawetal., 2012) à
551C, contenant par litre - 1,85 g de (NH4) 2S04, 0,05 g de FeS04ß7H20, 1,0 g de KH2P04, 1,0 g de
MgS04, 0,1 g de
coli a été cultivé dans un milieu LB, supplémenté avec 1,5% de gélose et 50 µg / mL de kanamycine
ou 100 µg / mL d'ampicilline appropriée. Saccharomycescerevisiae wasgrowninYPDor SD-
Uramedium comprend les conditions de
croissance (Shanks et al., 2006). 2.2. Réactifs et produits chimiques Des produits chimiques ont été
obtenus à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) ou BDDifco (Franklin Lakes,
NJ). Les enzymes de
restriction et DNApolymerase (Phusion) ont été obtenues du Nouveau-Brunswick, Biolabs (Ipswich,
MA), et les oligonucleotides ont été commandés à partir de l'IDT (Coralville, IA). 2.3. Constructiondes
Plasmides Des techniques
T.saccharolyticum? Ldh? Pta? Ack Shawetal. (2011) M0210 T.saccharolyticum? Ldh , ermR
GiftfromMascomaCorp. M0350 T.saccharolyticum? Pta? Ack? PyrF Shawetal. (2011) Athl M0355,
kanR, thl (Tt) Cette étude Ahbd M0355,
kanR, hbd (Tt) Cette étude Acrt M0355, kanR, crt (Tt) Cette étude Abcd- etfAB M0355, kanR, bcd,
etfA, etfB (Tt) Cette étude AadhE M0355, kanR, adhE2 (Ca) Cette étude I2B T.saccharolyticum, thl
(Tt), hbd (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),
etfA (Tt), etfB (Tt), adhE (Ca), KanR Ceci étude M0210-V M0210, thl (Tt), hdb (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),
etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR Cette étude Plasmides pYC2 / CT S. cerevisiae-E.coli vecteur de
clonageInvitrogen pMU131
(Tt) b Cette étude pCRT pYC2 / CT, KanR, crt (Tt) c Cette étude pBCD-etfAB pYC2 / CT, KanR, bcd (Tt)
d, etfA (Tt) e, etfB (Tt) f Cette étude pADHE pYC2 / CT, KanR, adhE (Ca) g Cette étude pBu24 pMC500,
thl (Tt), hdb (Tt), crt
(Tt), bcd (Tt), etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR a thl (Tt), thiolase provenant de
T.thermosaccharolyticum (Tthe_1656). b hbd (Tt), ß-hydroxybutyrylCoAdehydrogenasefrom
T.thermosaccharolyticum (The_1657). c crt (Tt),
ATCC27405), genecluster etfA, hbd, thl (de T.thermosaccharolyticum DSM571) fusedtopromoter cbp
(de C . thermocellum ATCC27405) et de la résistance à la kanamycine recombinante
wéréclonedinplasmidpMC500, aderivative de
pMC200 (Currie et al., 2013) contenant des régions amont et aval de xynA. Les séquences complètes
pour tous les plasmides sont disponibles sur les figures S1-S6. 2.4. La construction de l'ADN des
souches de Saccharolyticums
a été amplifiée via PCR à partir des plasmides pTHL, pHBD, pCRT, pBCD-etfAB, et pADHE. Les régions
amplifiées par PCR comprenaient les régions amont et aval du locus pta-ack qui fournissaient
l'homologie à T.saccharolyticum,
chambre de culture anaérobie (laboratoires Coy, GrassLakeMI) par inoculation de 10mL de TTSm1
avec 1 µL de particules décongelées.Sur 1mL des cultures, on a ajouté à ADN ADN plasmidique. Les
cultures ont été incubées
pendant 15 à 18 heures et les dilutions ont été suspendues dans du diméthylsC1 à pH 6,7 et ont été
solidifiées avant l'incubation à 55 ° C (Shaw et al., 2010). Colonies de T.saccharolyticum résistantes à
cinq kanamycines
dehydrogenaseandbutanoldehydrogenaseassays.Forprepara- ofthecell-freeextracts,
100mLcultureswerecentrifugedat 4 1C at6000g dans aBeckmanCoulterAvantiJ-25centrifuge.Thecell
culot
wasresuspendedin4mLofappropriatebufferasrequired Pour le dosage et l'utilisation d'un
MisonixSonicator4000 équipé d'un micro-tipina10mLglassbeakerpour8minutesavec10pulse
et10spulsseoffat50%
bromure sont comprises entre 1,5 et 3,6 mg / mL. La thiolase (EC2.3.1.9) a été mesurée dans la
direction de l'acétoacétyl-CoA cleavageat303nm. La réaction de réaction a été contenue dans 100
mM de Tris-HCl, 1 mMDTT, 10
mMMgCl2 à pH 8,0 (at55 1C). l'extrait a été additionné, mesuré à blanc, suivi par la définition du
substrat - 50 uM d'acétoacétylCoA et 0,2 mM de coenzyme A initié la réaction (Hartmanis et
Gatenbeck, 1984). L'activité de la ß-
DTTatpH7,8 (à 55 ° C). L'extrait acellulaire a été ajouté, suivi par une réaction de butyraldéhyde-1-
méthylènediamine (PM) à 0,23 mMNAD (P) (Dürre et al., 1987). 2.6. Méthodes analytiques
liquidchromatographywithanAminexHPX-
Une colonne de silice a été utilisée, une isotherme isotherme à 60 ° C avec 20 ml / min. Le volume
d'injection était de 500 ul et la longueur de l'eau était de 1 minute. 2.7.
Carbone etélectroniqueléquilibre Les bilans de carbone ont été calculés en calculant l'intensité des
moles de carbone dans lesproduitstomolesdelabasubstituéencarbone consommé,
avecconduitcarbondioxcomptepourla
électronique est calculée en fonction de la proportion de produits oxydés à des produits réduits (O /
Rratio) en tant que fonction des perméabilités électromagnétiques des substrats et des produits
(Moatetal., 2002; Papoutsakis,
2000). 3. Résultats Des enzymes individuelles de la voie du n-butanol ont été exprimées de manière
fonctionnelle dans l'organisme hôte T.saccharolyticum provenant des organismes sources
T.thermosaccharolyticum et C.
acetobutylicum. Après vérification des activités individuelles, un n- La voie de butanol a été exprimée
dans des souches de T.saccharolyticum pour la démonstration de laproduc- tion hétérologue du n-
butanol. 3.1.Expression
remplacé par la séquence consensus pour chacun des construits. Le tableau 2 présente les activités
des enzymes impliquées dans la formation de n-butanol chez T.thermosaccharolyticum de type
sauvage, les souches sauvages et
les souches génétiquement modifiées de T.saccharolyticum, et les valeurs de la ture pour C.
acetobutylicum. Les souches parentales de T. saccharolyticum - WT, M0355 et M0210 - n'ont pas
détecté d'activité pour les cinq
genre T.thermosaccharolyticum et dans les rapports littéraires pour C.aceto butylicum. Alors que les
activités hétérotoxiques de la crotonase chez T.saccharolyticum étaient de 2,5 à 5 fois plus tard que
l'activité de
été couplée à une réduction de l'oxydoréduction (Li etal., 2008). En outre, la comparaison génétique
des gènes de T.thermosaccharolyticum bcd, etfA et etfB (The_1660, The_ 1659, The_1658) montre
une hyperhomologie aux gènes
d'enzymes (Li et al., 2008). L'hétéro Les activités dépendantes du carbonate de ribonucléotides
radioactif dans la souche de T. saccharolyticum étaient de 3 fois plus faibles que celles de
T.thermosaccharolyticum.
butanol dans les souches déficientes actées a donné lieu à une production de n-butanol de 1,05 g / L
à partir de 10 g / Lxylose, ce qui correspond à 26% du maximum théorique. 2013Publié
parElsevierInc.on est lauréat
deInternationalMetabolicEngineeringSociety 1. Introduction Il y a un effort intensif pour développer
une technologie de production durable de carburant de transport de la biomasse complète (Grayson,
2011, Lyndetal., 2008, Olson et
al., 2012) et le n-butanol a attiré l'attention dans le contexte (Dong et al., 2012; Dürre, 2008). Alors
que plus de 80 milliards de litres d'éthanol sont utilisés actuellement comme carburant de transit
(Smith et al., 2012), le butanol n'est
pas utilisé aujourd'hui comme combustible de transit dans une mesure significative, bien qu'il ait un
impact potentiel sur la transformationmodécodynamique des hydrates de carbone, de la densité
énergétique et physique. propriétés
plus fongibles avec l'essence, par exemple avec un pipeline (Dürre, 2008). La voie de n-butanol la plus
étudiée est celle de Clostridium acetobutylicum et d'autres clostridies apparentées qui ont été
utilisées à partir des années 20
dans le processus de Weizmann (Jones et Woods, 1986). Les gènes impliqués dans le parcours ont
été clonés, les protéines ont été caractérisées (Boyntonetal, 1996, Fischer et al., 1993, Petersen et
Bennett, 1991, Stim-Herndon
et al., 1995), et les mécanismes de contrôle associés au rasage acide et dissolvante étude (Gheshlaghi
et al., 2009). Dans C. acetobutylicum, les gènes primaires responsables de la production de n-butanol
sont thl, hbd, crt, bcd,
etfA, etfAB, adhE2 et adhE1 (JonesandWoods, 1986; Nöllingetal., 2001) exprimant l'enzyme
benzymesthiolase, ß-hydroxybutyrylCoAdehydrogenase, crotonase, butyrylCoAdehydrogenase, sous-
unité de flavoprotéines électro-
transférantAndBandthebi-functionalenzymealdehyde-alcohol-dehydrogenaset
quiactiventetactiventlesbosubstratsacétyl-CoAandbutyrylCoAforethanoletn-butanolproduction,
respectivement.Manymesophilesincluding Escherichiacoli,
un risque réduit de contamination, des taux de réaction plus élevés et des coûts différentiels plus
faibles pour le chauffage et le refroidissement (Barnard et al., 2010; 1979). La SoucheM571 de
Hilletal., 1993; Mistry et Cooney, 1989). De plus, le n- Cependant, les bactéries putatives
responsables de la production de n-butanol sont présentement en présence de T.
thermosaccharolyticum DSM 571 (Hemme et al., 2010). Il
semble que les gènes (crt, bcd, etfB, etfA, hbd et thl) responsable de la formation de CoA du butyryl-
Cooccursamulti-geneoperon. La souche JW / SL-YS485 de Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum,
étroitement apparentée à
T.thermosaccharolyticum, a été bien caractérisée et développée de façon extensive. une bactérie
anaérobie isolée du parc national de Yellowstone (Shao et al., 1995). Ce micro-organisme croît entre
des températures de 45 et 65 ° C
et entre 4,0 et 6,8 (Shawetal., 2008a). T.saccharolyticum est capable d'utiliser une variété de
sarments trouvés dans la biomasse le glucose, le xylose, le mannose, le galactose, et l'andabinose. Il
peut catalyser le xylane, un
des catalyseurs pour produire des rendements élevés en éliminant les gènes présents dans l'acide
organique et la production de H2, en dirigeant le flux de carbone et d'électrons vers l'éthanol
(Shawetal., 2008b, Shawetal., 2009). En
Des expériences de transformation de .saccharolyticum allstrain ont été faites à55 1C inTSC1medium
(Shawetal., 2011), contenant par litre - 5 gofcellobiose, 1,85 g de (NH4) 2SO4, 0,05 g de FeSO4 ?
7H20, 1,0 g de KH2PO4, 1,0 g
(200 ug / ml). Des comparaisons de croissance ont été faites dans du milieu TSD (Shawetal., 2012) à
551C, contenant par litre - 1,85 g de (NH4) 2S04, 0,05 g de FeS04ß7H20, 1,0 g de KH2P04, 1,0 g de
MgS04, 0,1 g de
coli a été cultivé dans un milieu LB, supplémenté avec 1,5% de gélose et 50 µg / mL de kanamycine
ou 100 µg / mL d'ampicilline appropriée. Saccharomycescerevisiae wasgrowninYPDor SD-
Uramedium comprend les conditions de
croissance (Shanks et al., 2006). 2.2. Réactifs et produits chimiques Des produits chimiques ont été
obtenus à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) ou BDDifco (Franklin Lakes,
NJ). Les enzymes de
T.saccharolyticum? Ldh? Pta? Ack Shawetal. (2011) M0210 T.saccharolyticum? Ldh , ermR
GiftfromMascomaCorp. M0350 T.saccharolyticum? Pta? Ack? PyrF Shawetal. (2011) Athl M0355,
kanR, thl (Tt) Cette étude Ahbd M0355,
kanR, hbd (Tt) Cette étude Acrt M0355, kanR, crt (Tt) Cette étude Abcd- etfAB M0355, kanR, bcd,
etfA, etfB (Tt) Cette étude AadhE M0355, kanR, adhE2 (Ca) Cette étude I2B T.saccharolyticum, thl
(Tt), hbd (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),
etfA (Tt), etfB (Tt), adhE (Ca), KanR Ceci étude M0210-V M0210, thl (Tt), hdb (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),
etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR Cette étude Plasmides pYC2 / CT S. cerevisiae-E.coli vecteur de
clonageInvitrogen pMU131
(Tt) b Cette étude pCRT pYC2 / CT, KanR, crt (Tt) c Cette étude pBCD-etfAB pYC2 / CT, KanR, bcd (Tt)
d, etfA (Tt) e, etfB (Tt) f Cette étude pADHE pYC2 / CT, KanR, adhE (Ca) g Cette étude pBu24 pMC500,
thl (Tt), hdb (Tt), crt
(Tt), bcd (Tt), etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR a thl (Tt), thiolase provenant de
T.thermosaccharolyticum (Tthe_1656). b hbd (Tt), ß-hydroxybutyrylCoAdehydrogenasefrom
T.thermosaccharolyticum (The_1657). c crt (Tt),
sélection avec une cartouche de résistance à la kanamycine (Maietal., 1997) (figure 1a).
T.saccharolyticum non réplicatifplasmidpBu24wasconstructed dans E. coliTop10 (Invitrogen,
GrandIsland, NY) en utilisantGibsonassembly
pMC200 (Currie et al., 2013) contenant des régions amont et aval de xynA. Les séquences complètes
pour tous les plasmides sont disponibles sur les figures S1-S6. 2.4. La construction de l'ADN des
souches de Saccharolyticums
a été amplifiée via PCR à partir des plasmides pTHL, pHBD, pCRT, pBCD-etfAB, et pADHE. Les régions
amplifiées par PCR comprenaient les régions amont et aval du locus pta-ack qui fournissaient
l'homologie à T.saccharolyticum,
chambre de culture anaérobie (laboratoires Coy, GrassLakeMI) par inoculation de 10mL de TTSm1
avec 1 µL de particules décongelées.Sur 1mL des cultures, on a ajouté à ADN ADN plasmidique. Les
cultures ont été incubées
pendant 15 à 18 heures et les dilutions ont été suspendues dans du diméthylsC1 à pH 6,7 et ont été
solidifiées avant l'incubation à 55 ° C (Shaw et al., 2010). Colonies de T.saccharolyticum résistantes à
cinq kanamycines
dehydrogenaseandbutanoldehydrogenaseassays.Forprepara- ofthecell-freeextracts,
100mLcultureswerecentrifugedat 4 1C at6000g dans aBeckmanCoulterAvantiJ-25centrifuge.Thecell
culot
bromure sont comprises entre 1,5 et 3,6 mg / mL. La thiolase (EC2.3.1.9) a été mesurée dans la
direction de l'acétoacétyl-CoA cleavageat303nm. La réaction de réaction a été contenue dans 100
mM de Tris-HCl, 1 mMDTT, 10
mMMgCl2 à pH 8,0 (at55 1C). l'extrait a été additionné, mesuré à blanc, suivi par la définition du
substrat - 50 uM d'acétoacétylCoA et 0,2 mM de coenzyme A initié la réaction (Hartmanis et
Gatenbeck, 1984). L'activité de la ß-
DTTatpH7,8 (à 55 ° C). L'extrait acellulaire a été ajouté, suivi par une réaction de butyraldéhyde-1-
méthylènediamine (PM) à 0,23 mMNAD (P) (Dürre et al., 1987). 2.6. Méthodes analytiques
liquidchromatographywithanAminexHPX-
87Hcolumn fermentationproductsweremeasuredbyhigh pression (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA) .Themobilephaseconsistedof5mM acidata sulfurique métabolites flowrateof0.6mL /
min.Thedetectionofthe
Une colonne de silice a été utilisée, une isotherme isotherme à 60 ° C avec 20 ml / min. Le volume
d'injection était de 500 ul et la longueur de l'eau était de 1 minute. 2.7.
Carbone etélectroniqueléquilibre Les bilans de carbone ont été calculés en calculant l'intensité des
moles de carbone dans lesproduitstomolesdelabasubstituéencarbone consommé,
avecconduitcarbondioxcomptepourla
électronique est calculée en fonction de la proportion de produits oxydés à des produits réduits (O /
Rratio) en tant que fonction des perméabilités électromagnétiques des substrats et des produits
(Moatetal., 2002; Papoutsakis,
2000). 3. Résultats Des enzymes individuelles de la voie du n-butanol ont été exprimées de manière
fonctionnelle dans l'organisme hôte T.saccharolyticum provenant des organismes sources
T.thermosaccharolyticum et C.
acetobutylicum. Après vérification des activités individuelles, un n- La voie de butanol a été exprimée
dans des souches de T.saccharolyticum pour la démonstration de laproduc- tion hétérologue du n-
butanol. 3.1.Expression
remplacé par la séquence consensus pour chacun des construits. Le tableau 2 présente les activités
des enzymes impliquées dans la formation de n-butanol chez T.thermosaccharolyticum de type
sauvage, les souches sauvages et
été couplée à une réduction de l'oxydoréduction (Li etal., 2008). En outre, la comparaison génétique
des gènes de T.thermosaccharolyticum bcd, etfA et etfB (The_1660, The_ 1659, The_1658) montre
une hyperhomologie aux gènes
d'enzymes (Li et al., 2008). L'hétéro Les activités dépendantes du carbonate de ribonucléotides
radioactif dans la souche de T. saccharolyticum étaient de 3 fois plus faibles que celles de
T.thermosaccharolyticum. vTable2 Activités
spécifiques des enzymes dans la voie du butanol. Souche enzymatique Activité spécifiquea (umol /
min / mg de protéine totale) Référence Thiolase T.t. 5. 08 70.74Cette étude Athl2.4770.37Cette
étude I2B 3.9670.82 Thisstudy
M0210-V4.0671.23Cette étude M0355, M0210, T.s. n.d.b Cette étude C.a. 11 Hartmanis et
Gatenbeck (1984) 3-hydroxybutyrylCoAdehydrogenase T.t. 14.4370.65 Thisstudy Ahbd 6.8170.39
Thisstudy I2B 8.2170.68Cette étude
M0210-V8.7270.44Cette étude M0355, M0210, T.s n.d. Thisstudy C.a. 8 Hartmanis et Gatenbeck
(1984) Crotonase T.t. 11.9571.15Cette étude Acr2.5670.19Cette étude I2B 4.8170.92 Thisstudy
M0210-V5.1770.79 Thisstudy M0355,
M0210, T.S. Thisstudy C.a. 135 Hartmanis et Gatenbeck (1984) Butyryl CoAdehydrogenase T.t.
0.6770.04c Cette étude Abcd-etfAB 0.2170.05c Cette étude I2B 0.2770.10c Cette étude M0210-
V0.2370.09c Cette étude M0355,
M0210, T.s n.d.c Cette étude C.k. 4d Hartmanis et Gatenbeck (1984) Butyraldehydedehydrogenase
(withNADHasco-factor) AadhE0.0470.01Cette étude I2B 0.0470.06Cette étude M0210-V0.0570.08
Thisstudy M0355, M0210, T.s
n.d. Thisstudy C.a. 0,038 Dürre et al., (1987) Butyraldéhydéhydrogénase (avec un facteur
PHascoNAD) AadhE0.0270.01Cette étude I2B 0,0270,07 Thisstudy M0210-V0.0270.08 Thisstudy
M0355, M0210, T.S. Thisstudy C.a. 0,005
Dürre etal (1987) Butanol déshydrogénase (avec le facteur NHasco) AadhE0.2070.01Cette étude I2B
0.2270.05 Thisstudy M0210-V0.2170.08 Thisstudy M0355 0.0470.01Cette étude T.s 0.1170.
04Cette étude M0210 0,0770.03 Thisstudy C.a. 0,02 Dürre et al. (1987) Butanol déshydrogénase
(avec NADPHasco-facteur) AadhE0.1370.01Cette étude I2B 0.1870.04Cette étude M0210-V0.1970.02
Thisstudy T.s.s. 0.0470.04Cette
étude M0210 0.0670.05 Thisstudy M0355 0.2070.01Cette étude C.a. 0,14 Dürre et al (1987) T.t,
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum; T.s., Thermoanaerobacterium saccharolyticum;
C.a., Clostridium acetobutylicum; C.k.,
Clostridium kluyveri. aLes données sont montrées dans l'estimation raisonnable des mesures exactes.
Les activités spécifiques sont mesurées à partir desextracts sans protéinconcentration. b Non
détecté. c Les activités
spécifiques sont reflétées par un essai couplé avec un couplage d'oxygène (Li etal., 2008). d La
référence indique une activité spécifique pour une protéine purifiée, lorsque des activités spécifiques
sont déterminées dans le cadre de
noter que les concentrations de butyraldéhyde réduites (Tableau 2) ont été démontrées. Bien que les
souches de T. saccharolyticum aient démontré une faible activité de l'hydrogènehydrogène, il n'y
avait aucune preuve de
- a été améliorée par rapport aux souches mères - M0355, WTandM0210. 3.2. Construction d'une
voie de synthèse de sulfonate de n-butanol sur une voie de n-butanol Après avoir vérifié l'expression
de la fonction des enzymes
n-butanol ont été borborés sur un plasmide réplicatif pBu24 pour l'intégration dans le chromosome
de T. saccharolyticum. On a ajouté un adénocarcinome de C.acetobutylicum au promoteur xynA de la
T.saccharolyticum. Le
promoteur du gène xynA a déjà présenté un système inductible dans T.saccharolyticum (Currieetal.,
2013) et il a constaté que la toxicité de l'acide acétylsaloïque peut être due à une expression négative
de C. acetobutylicum.
T.saccharolyticum. L'expression des gènes crt, bcd et etfB de T.thermosaccharolyticum a été médiée
par le promoteur glycéraldéhyde-3-phosphatedehydrogénase (gapDH) de C. thermocellum
ATCC27405 et l'expression de etfA, hbd
T.saccharolyticum - WT,? Ldh,? Pta? Ack et? Ldh? Pta? Ack - avec le plasmide de réplication
plasmidique pBu24.Whileapproximately103 transfor- mants / ug d'ADN ont été obtenus pour les
souches de Wtand? ldh, aucun
transformant n'a été obtenu avec des souches de pta? ack et? ldh? pta? ack
génotypedespitesimultaneou des transformations réussies avec un plasmide de contrôle de dépôt
pMC500. 3.3. La caractérisation de la production de
caractérisation supplémentaire, désignées par le terme I2B et M0210-V, respectivement. WT, I2B,
Ahl et M0210-V sont des milieux définis avec des xyloseastesolecarbonates pour induire l'expression
d'adhE (Ca) (figure 4).
changements ont été observés dans les produits de fermentation, les chaînes d'insuline I2B et
M0210-V avec du butanol étant produites (tableau 3). Puisque les chaînes de production de butanol
genethatuses acétylCoAassassinat,
saccharolyticum a été régulée de façon inattendue, mais les promoteurs de recombinaison ne sont
plus que des agents de blanchiment, mais seulement du olétane, mais ils peuvent être cultivés en
présence de xylose, mais on
peut également obtenir des quantités correctes de butanol en présence de glucose. Les
caractéristiques de croissance des souches de T. saccharolyticum Le taux de croissance spécifique de
0,15 h? 1 du taux de croissance
spécifique du bas de la chaîne de production du butanol est de 30% par rapport au taux de
croissance spécifique de la souche W de 0,21 h? 1. De même, la souche M0210-V produisant du
butanol a un taux de croissance spécifique
butanol qui se produisait. Cependant, des travaux supplémentaires ont été effectués pour
déterminer la souche de type. Le taux de croissance spécifique de 0,15 h? 1 de la chaîne de
production de butanolI2Bhada est inférieur à celui
a réduit le pourcentage de souches M0210 (0,074 g / gxylose), I2B (0,07 g / gxylose) et M0210-V
(0,058 g / gxylose) de 25%, 30% et 42% comparé à WTcellyieldof0.1g /
gxylose.Onepossibilityforthelellle rendement de la
nécessitait un supplément d'ADN des électronéducteurs. Dans ce cas, il est nécessaire de remplacer
les molécules de NADH par le catalyseur de butyrate de butyryle, de manière à ce que la solution de
carbone butyrylcétonique
des oxydes de carbone qui ont été ajoutés pendant l'oxydation du pyruvate.Il a été dit que si l'on a
reporté directement le NADH, cet équilibre de cofacteur a été corrigé; cependant, comme l'a révélé
le T.saccharolyticum génome
induit que la ferrédoxine bien connue: la nicotinamide-oxydo-réductase est codée par les gènes
nfnAB de l'enzyme NADH-dépendentreducedoxine: NADPþ oxydoréductase (Wangetal., 2010), qui
transfère de façon réversible des
et que l'on réduisait en excès les quantités produites par les deux voies, en les convertissant à
l'hydrogène.Selon les spécificités de l'hydrate de butyraldéhyde et de la n-butanol déshydrogénase
(et la participation de nfnAB dans la
1, respectivement (tableau3).
En premier La production de n-butanol thermophile, dont les auteurs ont obtenu des résultats
comparables, a été comparée à celle du travail initial avec des mésophiles non monophyliques
produisant du n-butanol -
E. coli (0,4-1,2 g / L) (Atsumi et al., 2008; Inui et al., 2008), P.putida (0,12 g). / L), B. subtilis (0,024 g /
L) (Nielsen et al., 2009), S. cerevisiae (0,0025 g / L) (Steen et al., 2008) et L. brevis (0,3 g / L) (Berezina
et al., 2010).
Cependant, pour atteindre un rendement maximal, il est bénéfique de diriger directement le flux de
carbone et d'électrons vers le butanol. Des efforts d'ingénierie pour augmenter le n-butanol le
rendement nécessitera le métabolisme
de l'éthanol au butanol, et il est probable qu'il faudra remplacer les générations productrices
d'éthanol naturel dans T.saccharolyticum par des protéines qui ont une spécificité supérieure pour la
production de butanol (Lehmann a été
modifié au cours de 2012, Sillers et al., 2009). De plus, si n- La production de butanol est
stoechiométriquement couplée au H2 et à la production d'acétate, puis l'expression des enzymes qui
produisent des productions de n-butanol
à des degrés indépendants devrait augmenter, mais cette solution pourrait être une expression
hétérologue du complexe Rnfenzyme (BuckelandThauer, 2012; Müller et al., 2008), qui transfère
directement des électrons provenant
Remerciements Ce travail a été soutenu par la Corporation Mascoma et par le Centre Scientifique
Bioénergie. Nous aimerions remercier DanaOlson et Elizabeth Mearls pour
http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2013.10.012. il