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BMC Biología del desarrollo BioMed Central
Artículo de búsqueda Acceso

abierto
Función de estabilidad de cromosoma y telomere
longitud en el
Producción de líneas de célula viable para somatic célula transferencia
nuclear
Gabriela F Mastromonaco, Steve D Perrault, Dean H Betts y W Allan King*
Dirección: Departamento de Biomedical Ciencias, Ontario Universidad Veterinaria, Universidad de Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canadá
Email: Gabriela F Mastromonaco - gmastrom@uoguelph.ca; Steve D Perrault - sperraul@uoguelph.ca; Dean H Betts - bettsd@uoguelph.ca; W
Allan King* - waking@uoguelph.ca
* Correspondiendo autor
Publicado: 09 agosto 2006 Recibido: 01 junio 2006

Aceptado: 09 agosto 2006
BMC Biología del desarrollo 2006, 6:41 doi:10.1186/1471-213X-6-41
Este artículo es disponible de: http://www.biomedcentral.com/1471-
213x/6/41
© 2006 Mastromonaco et al; licensee BioMed Central Ltd.
Esto es un artículo de Acceso Abierto distribuido bajo los plazos del Creativos Commons Licencia de Atribución
(http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), el cual permite unrestricted uso, distribución, y reproducción en cualquier medio, proporcionado
el trabajo original es correctamente citó.
Abstracto
De fondo: Somatic célula transferencia nuclear (SCNT) proporciona una alternativa de
apelar para la preservación de material genético en no-doméstico y endangered especie.
Un importante prerequisite para exitoso SCNT es la disponibilidad de células de donante de
calidad buenas, embrión tan normal el desarrollo es dependiente a apropiado reprogramming
de el genoma de donante de modo que los genes embrionarios pueden ser apropiadamente
expresó. Las características de líneas de célula del donante y su capacidad de producir
embriones por SCNT estuvo evaluado por probar los efectos de colección de muestra del tejido
(biopsia de DARDO, biopsia de PERFORADORA, correo-mortem muestra de OREJA) e
iniciación de cultura (explant, collagenase digestión) técnicas.
Resultados: las diferencias en medida de muestra inicial basaron encima técnica de colección
de la muestra tuvo un efecto en la cantidad de cronometrar necesario para conseguir
confluencia primaria y el número de población doublings (PDL) produjo. Así, DARDO y
biopsias de PERFORADORA resultaron en culturas con decreased lifespans (<30 PDL)
acompañó por senescence-gustar morfología y decreased contenido de cromosoma normal
(<40% células normales en 20 PDL) comparó a el largo-vivido (>50 PDL) y chromosomally
establo (>70% células normales en 20 PDL) las culturas produjeron por correo-mortem
muestras de OREJA. Estabilidad de cromosoma estuvo influida por técnica de colección de la
muestra y era dependiente a la cultura inicial telomere longitud y su índice de acortar encima
pasos de célula. Siguiente SCNT, corto-vivió las culturas resultaron en significativamente
bajar blastocyst desarrollo ( 0.9%) comparó a altamente proliferative culturas (11.8%).
Estabilidad de cromosoma y técnica de colección de la muestra eran factores significativos
en determinar blastocyst resultado de desarrollo.
Conclusión: Este dato demuestra la influencia de técnicas de establecimiento de la cultura
encima características de cultura de la célula, incluyendo el viability, longevidad y normalidad
de células. La identificación de un marcador cuantificable asociado con SCNT embrión
potencial del desarrollo, estabilidad de cromosoma, proporciona un medio por qué
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(La página numera no para propósitos
condiciones de cultura de la célula puede ser controlado y mejoró..
De fondo Propagación de líneas genéticas valiosas, y el preserva-

En años recientes, el desarrollo de embrión novel tion de endangered razas/de especie. A pesar de que los
produc- tion las tecnologías que incluyen somatic célula parámetros procesales numerosos quedan para ser
transferencia nuclear (SCNT) ha creado el potencial streamlined para aumentar el éxito de esta técnica para la
para la restauración y producción
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BMC Biología del desarrollo 2006, 6:41 http://www.biomedcentral.com/1471-213x/6/41
células anormales en culturas de paso tardío ha sido

De descendencia viva y normal, uno del importante demostradas por varios detectives [10-12]. Benn [10] observó
prereq- uisites de SCNT es la disponibilidad de células que el contenido de cromosoma de líneas de célula progresó de
de donante sano, los cuales necesitan ser reprogrammed aproximadamente 30% anormal a más grande que 60% células
para apoyar embrión apropiado y desarrollo fetal después anormales en pasos más tardíos. Simi-
de nuclear transplanta- tion.
La última década ha visto un aumento dramático en el

cryop- reserva de biomaterials. Bancos de recurso del
genoma han sido establecidos para la colección y
almacenamiento de somatic/ gonadal tejidos, células,
gametos y embriones de geneti- cally apellidos e
individual valiosos. Está pretendido que estos bancos
serán instrumentales en el genéticos dirigir- ment de
poblaciones cautivas y salvajes. Wildt [1] declaró que
bancos de recurso del genoma no sólo facilitan el dis-
persal de material genético entre poblaciones, pero
proporcionará seguro contra la pérdida repentina de
diversidad o una población. Aun así, carencia de
estandarizó técnicas para colección de muestra y el
almacenamiento ha resultado en un abun- baile de pobre-
la calidad amontonó material. Así, un mejor entendiendo
de los efectos de colección de tejido y cul- ture técnicas
de establecimiento encima célula viability está requerido.
Para asegurar que las células son de la calidad suma para
uso posible como donantes para SCNT, una necesidad
existe para la identificación de marcadores
cuantificables con una relación directa a devel- opmental
potencial.
Es bien sabido que más somatic las células crecidas en

vitro tener un limitado proliferative lifespan [2], en qué
punto introducen una fase de arresto de crecimiento
denominó replicative senescence. Este estado irreversible
es distinguishable del quiescence consiguió por suero-
inanición o densidad- inhibición de crecimiento
dependiente [3] aquello es necesario a syn-.
chronize Células de donante en el G o fase para SCNT.
Senescent Las células quedan metabolically activos,
arrestados en el G1/S frontera y careciendo de la
capacidad de dividir [revisado por
[4]]. Un senescent fenotipo, por el cual el cambio de
células en forma y función, ha sido descrito. Las
características incluyen alteraciones en morfología
(superficie de célula aumentada y volumen, flattening de
la célula), función (encima-expres- sion de cytokines) y
patrones de expresión del gen, resistencia a apoptosis y
acortado telomere longitud [revisado por [5]]. En vitro
lifespan está afectado por genético y environ- factores
mentales, como edad de donante, estado fisiológico, cul-
ture condiciones y sembrando densidad [5-7].
Serial prolongado cultivation de células en vitro

resultados en la acumulación de aberraciones numerosas.
Genómico instability y telomere el acortamiento tiene
ambos sido correlativo con tiempo aumentado en cultura
[8-10], y mostrado para ser prevalent en replicative
senescence. Un aumento dramático en chromosomally las
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BMC Biología del desarrollo 2006, 6:41 línea de célula, estandarización de técnicas para tejido
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larly, Strelchenko [11] y Giraldo et al. [12] col- lection, procesando y la cultura tiene que ser
informó 81% y 98% células anormales en culturas implementada para asegurar aquello amontonó las
de paso tardío, respectivamente. Ambas culturas son una fuente viable de material genético. La
anormalidades estructurales y numéricas han sido célula apropiada que amontona las técnicas son de
documentadas, incluyendo fin-a-fusiones de fin, importancia crítica en especie no doméstica,
translocaciones, aneuploidy y polyploidy. específicamente endangered fauna y flora, donde el
acceso a los animales es mínimo y, en algunos casos,
Una función importante en estabilidad genómica impide la colección de bueno qual- ity muestras de
está llevada a cabo por el telomeres [13]. tejido.
Telomeres Es sabido de mantener estructura de
cromosoma y función por impedir fin- a-fusiones
de fin y degradación de los fines de cromosoma
[14]. Tan telomeres acortar con cada ciclo de
célula, los "fines" pegajosos son prone a fusiones
y ventaja de translocaciones- ing a alteraciones de
cromosoma estructural y subsiguientes
cromosómicos instability [15]. Alteraciones de
cromosoma numérico, por otro lado, está pensado
para resultar del missegregation de cromosomas
debido a la pérdida de p53 y Rb, reguladores del
mitóticos spindle aparato [15]. Ambas
anormalidades de cromosoma y critically cortos
telomeres está pensado para ser capaz de señalar
la respuesta de ADN averiada irreversible que
causas las células para introducir la fase de arresto
de crecimiento que dirige a senescence [4,16].
En vitro producción de embriones,

particularmente por SCNT, está asociado con
compromised pre- y correo-desarrollo de
implantación. Cytogenetic Los estudios en
embriones indican aquellas anormalidades de
cromosoma están asociadas con calidad de
embrión pobre y aumentado embrionario y fetal
wast- edad [17]. Anormalidades de cromosoma
están pensadas para ser una causa importante de
pérdida embrionaria durante desarrollo
temprano [18,19]. Entre en vitro fertilized (IVF)
y SCNT embriones, un porcentaje más alto de
chromosomally abnor- mal los blastómeros
estuvieron observados en embriones en
desarrollo más lentos, embriones con números
de célula más baja y embriones de grado más
pobre [17,20,21]. Los estudios tienen
correlativos la ocurrencia de anormalidades de
cromosoma en SCNT embriones con la
frecuencia de anormalidades en la línea de
célula del donante [22,12]. No
sorprendentemente, líneas de célula del donante
con un porcentaje más alto de células anormales
generó un índice más alto de chromosomally
blastómeros anormales en el SCNT embriones.
Para mejorar SCNT éxito, la atención prudente

tiene que ser dada a el establecimiento de
célula viable , normal las líneas desde embriones
de calidad buena dependen de el chromo- somal
integridad de la célula de donante. Debido a los
factores medioambientales numerosos que
influyen el crecimiento de plazo largo de una
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13.
Los objetivos de este estudio eran para investigar los

efectos de colección de muestra del tejido y tecnología de
iniciación de cultura de célula- niques encima dinámica
de cultura de la célula y sus efectos en el potencial del
desarrollo de clonó embriones siguiendo SCNT. Nuestro
objetivo era para identificar parámetros de cultura de la
célula que serviría tan predictors del potencial del
desarrollo de una línea de célula en las etapas iniciales de
en vitro cultura, para seleccionar y muestras bancarias
que proporcionaría el resultado mejor cuando células de
donante para SCNT. Además, para determinar la
viabilidad de la célula que amontona en un no-domos-
especie de tic que requiere especializó manejar técnicas
los experimentos estuvieron actuados en un endangered Figura 2
ganado spe- cies, el gaur (Bos gaurus), utilizando ganado Replicative lifespan De ganado y gaur culturas de
doméstico (Bos taurus) como controles. célula. Los números de población doublings para lograr
senescence está mostrado para la colección de muestra
Resultados (DARDO, PERFORADORA, PIEL/ de OREJA) y
disociación de célula (EXPL, COLL) grupos de tratamiento.
Características de cultura estuvieron examinadas para
Diferencias en el número de población doublings con
DARDO, PERFORADORA y PIEL/de OREJA las anterioridad a senescence estuvo observado entre las
muestras establecieron utilizar EXPL y COLL técnicas. El técnicas de colección de la muestra y sólo entre técnicas
tiempo a confluencia primaria acuerdo diverso- ing a la de disociación de la célula cuándo cortas-vivió las
técnica de colección de la muestra utilizada (Figura 1). culturas estuvieron producidas.
Muestras iniciales pequeñas, cuando en DARDO,
requirió >20 días a
Consigue la confluencia comparó a muestras más grandes, cuando en OREJA,
Cuál requirió sólo 5–6 días (COLL) y 11–12 días

(EXPL). En todos los casos, EXPL los tratamientos números de los días necesarios para el disoció células para
requirieron más tiempo que COLL para conseguir devenir confluent monolayers está mostrado para la colección de
confluencia. muestra (DARDO, PERFORADORA, PIEL/ de OREJA) y
disociación de célula (EXPL, COLL) grupos de tratamiento. Tiempo
para lograr confluency variado según la muestra col- lection y
Las culturas eran passaged routinely hasta que lograron
técnicas de disociación de la célula utilizaron.
senescence y las diferencias estuvieron observadas en el
número de PDL a senescence entre los tratamientos
(Figura 2). Los controles de ganado (PIEL y OREJA) y
gaur la OREJA produjo mucho tiempo-vivió culturas con
50 > PDL. En estos casos, ningún signif- icant el efecto de
técnica de disociación de la célula era evidente después
de que
Figura 1
Longitud de cronometrar para lograr confluencia
primaria para gato- tle y gaur culturas de célula. Los
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Mucho tiempo-cultura
BMC Biología de plazo.
del desarrollo Ambos DARDO
2006, 6:41 http://www.biomedcentral.com/1471-213x/6/41
y la PERFORADORA produjeron cortos-vivió
culturas (<10 PDL, EXPL; <30 PDL, COLL). En
estos casos, técnica de disociación de la célula
tuvo un efecto, con COLL culturas que
experimenta más PDL que EXPL cul- tures.
Para examinar phenotypic cambios durante serial

cultivation, morfología de cultura estuvo
evaluada. Mucho tiempo-vivió culturas (gaur
OREJA, Figura 3; PIEL de ganado y la OREJA
no mostrada) exhibió una tendencia típica de el
estrechamente compacto spindle- shaped células
en cultura temprana (Figura 3Un–D) a un gradual
ampliando de células hasta el spread fuera,
estrella-shaped pheno- tipo de senescence estuvo
observado (Figura 3yo–J). En contraste, dentro del
primeros pocos pasos, cortos-vivió culturas
(DARDO y PERFORADORA, Figura 4) mostró
el phenotypic cambios (ampliando y extendiendo)
característica de las células de paso tardías de
largos-vivió culturas acercando prpers senescence.
Para examinar cambios en estabilidad genómica

durante serial cultivation, contenido de
cromosoma de las culturas estuvo evaluado.
Análisis de metaphase spread en P-30 no fue
exitoso debido a los números bajos de
activamente dividiendo células en las culturas de
paso tardías. Una disminución en el porcentaje-
edad de chromosomally las células normales era
evidentes en todo cul- tures durante serial
cultivation (Figura 5Un–B). Las anormalidades
incluidas principalmente aneuploidy y poly-
ploidy. El porcentaje inicial células normales,
porcentaje final ni- mal células, y índice de
cambio (pendiente) variado entre culturas,
indicando diferencias debido a ambas muestra
collec- tion y técnicas de disociación de la célula.
Mucho tiempo-vivió culturas (OREJA de PIEL/del
ganado, Figura 5Un; gaur OREJA, Figura 5B) mostró
una disminución gradual (gama de pendiente: -
0.75 a -2.00, Mesa 1) en
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13.
Figura 3
Morfología de gaur culturas de célula durante serial cultivation en vitro. Contraste de fase micrographs de gaur
OREJA fibroblast las culturas de pasos tempranos y tardíos demuestran los cambios en morfología de célula que ocurrido
con aumentó pasos. Nota la morfología (ampliado y flattened células) característica de senescent culturas en (yo) y (J).
Ningún efecto importante de célula dissoci- ation las técnicas estuvieron observadas en estos largos-culturas de célula
vivida.
chromosomally Células normales de 82–90% normales centage De las células normales compararon a COLL
abajo a 42–70% normales por paso 25 (50 PDL). Corto- culturas. El DARDO EXPL línea de célula falló para
vivió culturas (DARDO y PERFORADORA, Figura 5B) establecer y no fue ana- lyzed allende P-1, el cual ya
inicialmente con- sisted de un porcentaje más bajo de constado de sólo 42% células normales.
chromosomally células normales y cayó dramáticamente
(gama de pendiente: -4.44 a - 10.00, Mesa 1) dentro del Para examinar los cambios en telomere longitud durante
primeros pocos pasos a 40% < ni- mal células. En general, serial cultivation, relativo telomere la longitud de las
EXPL las culturas resultaron en un más bajos por- culturas era
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13.
mostró un abnor- mal aspecto. Blastocyst Índices para gaur

Evaluado. Una disminución en RTL era evidente en todas células de OREJA averaged 11.8%. Desde el gaur ser de
las culturas dur- ing serial cultivation (Figura 6Un–B). embriones produjo era el resultado de interspecies SCNT, gaur
Diferencias definitivas debido a colección de muestra o embrión devel- opment estuvo esperado para ser más bajo que
técnicas de disociación de la célula no fueron claramente ganado. Aun así, una comparación entre el gaur líneas de célula
evidente, aun así algunas tendencias estuvieron utilizaron para SCNT mostró que el corto-PERFORADORA y
observadas. El inicial y final RTLs variado entre ganado DARDO vividos culturas
y gaur. Con una excepción, RTLs de culturas de ganado
eran más grandes que aquellos de gaur culturas. Más
importantly, ini- tial y final RTLs de largo-vivió las
culturas eran approxi- mately dos veces que de cortos-
vivió culturas, con la excepción de OREJA de ganado
EXPL y gaur OREJA EXPL cuál era ambos más bajo que
otro largo-vivió culturas. En más casos, el índice de
telomere acortamiento (pendiente) era similar (Figura
6Un–B, Mesa 1). El DARDO EXPL línea de célula falló
para establecer y no fue analizado allende el RTL inicial
en paso 1.
Estabilidad de cromosoma estuvo probada para

dependencia en el RTL inicial, RTL final, y índice de
RTL de cambiar para determinar si una relación
significativa existe. Además, diferir- ences entre los
animales, técnicas de colección de la muestra y técnicas
de disociación de la célula estuvieron probadas. El
chromo- algún índice de contenido del cambio no fue
encontrado para ser depender- ent encima cualquiera
telomere factor de longitud sólo, pero era altamente
dependiente en ambos el RTL inicial de la cultura (p
< 0.05) y el índice de RTL de cambio (p < 0.001) junto.
Inclusión del animal, técnica de colección de la muestra
y clase de técnica de disociación de célula las variables
revelaron que mientras técnica de disociación de la célula
no fue significativa, animal y técnica de colección de la
muestra era ambos signifi- cant (p < 0.05) factores.
Los efectos de calidad de cultura de la célula en la

producción de embriones por SCNT estuvo examinado
(Mesa 2). COLL único culturas estuvo utilizado como
EXPL culturas de DARDO y muestras de
PERFORADORA no produjeron bastantes células para
el SCNT experimentos. En los controles de ganado, la
PIEL y LA OREJA dieron resultados similares, con
aproximadamente 35% blastocyst desarrollo encima día
8 de cultura de embrión. Cuándo cercano- senescent
células de ganado (PIEL y OREJA, P-30) estuvo
utilizado para SCNT, significativamente (p < 0.05) el
desarrollo más bajo estuvo observado, con 11%
<blastocyst desarrollo para ambas culturas.
Curiosamente, cuándo las células eran trypsinized y
preparados para SCNT, las diferencias morfológicas eran
evi- abolladura entre el paso temprano y tardío células
(Figura 7). Preparaciones de célula de paso tempranas
constaron de pequeñas, spheri- cal, lisos-membraned
células, con un porcentaje pequeño de las células que
aparecen anormales (más grandes en medida con no-
esférico o ragged bordes). En la célula de paso tardía
preparaciones, una proporción más alta de células
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BMC Biología del desarrollo 2006, 6:41 emigran fuera del explants comparó a aquellos liberado
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Producido significativamente (p < 0.05) el por digestión de enzima. Así, estas culturas de densidad
desarrollo más bajo y estas preparaciones de baja pueden agotar más de su replicative potencial en la
célula eran similares en aspecto a las fase inicial de cultura. A pesar de que las biopsias
preparaciones de célula de paso tardías pequeñas son routinely utilizados en humanos para
(representa no mostrado). producir culturas de 40 >PDL [23], el gruesos- ness y
toughness de la piel en animales grandes gusta el ganado
Siguiendo la determinación que estabilidad de puede ser un factor para consideración cuándo
cromosoma era altamente dependiente en una intentando para obtener el grosor lleno del epidermal y
combinación de RTL y RTL iniciales índice de dermal capas.
cambio, examinamos la posibilidad que el
blastocyst índice de desarrollo de líneas de A pesar de que una discrepancia de edad existida entre el
célula utilizó para SCNT era dependiente en la ganado y gaur muestras cuando animales de matadero
estabilidad de cromosoma de la línea de célula son normalmente
del donante. De hecho, índice de contenido del
cromosoma de cambio y colección de muestra
la técnica era significativa (p < 0.01) factores en
determinar blastocyst resultado de desarrollo.
Discusión
Este estudio demostró que los métodos de tejido
sam- ple colección y cultura de célula la
iniciación influye el vía- bility, longevidad y
normalidad de las células crecidas en vitro, y su
potencial subsiguiente para desarrollo de embrión
fol- lowing SCNT. Además, estabilidad de
cromosoma estuvo identificada como parámetro
cuantificable en qué desarrollar- potencial mental
de SCNT los embriones es altamente
dependientes. La relación fuerte entre estabilidad
de cromosoma y somatic/célula embrionaria
viability hace esta célula char- acteristic un
parámetro valioso para pronosticar SCNT suc-
cess, y proporciona un medio por qué condiciones
de cultura de la célula puede ser controlado y
mejoró..
Efectos encima características de cultura

Cultura-los factores concretos ejercen efectos
significativos en el proliferative lifespan de
culturas de célula, con sembrar la densidad que es
proporcionalmente relacionado a lifespan [6,7].
De modo parecido, en nuestras diferencias de
estudio que resultan de la muestra collec- tion las
técnicas mostraron que la medida de muestra
inicial, aquello es, el número de células
potencialmente disponibles de iniciar la cultura
(sembrando densidad), tuvo un efecto en la
cantidad de cronometrar necesario para conseguir
confluencia primaria y el número de PDL
produjo. Rápidamente dividiendo, mucho tiempo-
vivió las culturas eran sólo obtenidas de piel y
muestras de oreja correo recogido-mortem. En las
muestras más pequeñas de biop- sies obtenidos
por dardo o establecimiento de perforadora
manual de las líneas de célula era también
afectado por la técnica de disociación de la célula.
El tiempo más largo a confluencia primaria y el
significativamente reducido lifespans del
explanted líneas de célula pueden ser el resultado
de un número más pequeño de las células que
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13.
Figura 4
Morfología de gaur culturas de célula durante serial cultivation en vitro. Contraste de fase micrographs de gaur
DARDO y PEGAR fibroblast las culturas de pasos tempranos y más tardíos demuestran cambios en morfología de célula.
Senescent Morfología (ampliado y flattened células) estuvo observado dentro del primeros pocos pasos cuando
mostrados en (yo) a (L). Efectos de tecnología de disociación de la célula- niques era aparente en estos corto-culturas
de célula vivida.
confluencia primaria y el número de PDL estuvo observado, con

Menos de 5 años, mientras que el gaur era 18 años, no
tenga un efecto en el observó resultados. Gaur Muestras
de OREJA obtuvieron confluencia primaria dentro del
mismo marco de tiempo cuando OREJA de ganado y, de
modo parecido, produjo célula mucho tiempo vivida
líneas con 60 o más PDL. Cristofalo Et al. [23] observó
que a pesar de que fetal y adulto fibroblasts hubo dif-
ferent características de crecimiento, ningún efecto de
edad de donante en replicative lifespan era evidente. El
dato informó aquí estuvo generado de las muestras
obtuvieron de uno gaur individual debido a la dificultad
en obtener ambas biopsia y correo-mortem muestras de
este endangered especie. Aun así, los resultados similares
estuvieron obtenidos de biopsias de DARDO de 8 otro
gaur y de biopsia de PERFORADORA y OREJA de uno
otro gaur (observaciones personales).
Una relación entre la cantidad de cronometrar a

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BMC Biología del
Las culturas quedesarrollo 2006, 6:41 establecidos
son exitosamente http://www.biomedcentral.com/1471-213x/6/41
sólo de preparaciones de célula que confluencia
conseguida dentro de la posición- ard tiempo-
marco para aquella técnica (explants: 10–12 días;
digestión: 5–6 días). Las culturas que requieren
>10 días para formar un confluent monolayer
digestión de enzima siguiente era indicative de la
célula tacha aquello experimentó replicative
senescence prematuramente. Esto muestra que
controlando la fase inicial de establecimiento de
cultura proporciona importante infor- mation para
determinar las capacidades reproductivas de una
línea de célula y decidiendo si para proceder con
la cultura. Bartels Et al. [24] amontonó culturas de
célula de leones africanos (Panthera leo) de quién
tiempo malo a confluencia en 50 ml flasks
digestión de enzima siguiente era 18.6 ± 3.1 días .
A pesar de que ninguna información es disponible
en el viability de estas culturas, nuestro dato
sugiere que estas culturas que crecen lentas no
producirá sano, altamente proliferative líneas de
célula.
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Mesa 1: Índice de cambio (pendiente) de contenido de

cromosoma y relativo telomere la longitud que sigue serial
cultivation en vitro.
Animal Cultura de CC RTL

célula
GANAD PIEL EXPL -1.51 -0.06
O
PIEL COLL -1.07 -0.04
OREJA EXPL -1.75 -0.03
OREJA COLL -0.82 -0.04
GAUR DARDO EXPL - -

DARDO COLL -4.52 -0.04
PERFORADO -10.00 -0.17
RA EXPL
PERFORADO -5.87 -0.05
RA COLL
OREJA EXPL -1.60 -0.02
OREJA COLL -1.79 -0.11
Las pendientes estuvieron obtenidas análisis de regresión lineal

siguiente de el dato en figuras 5 y 6. Efectos de colección de
muestra y técnicas de disociación de la célula encima CC
pendientes, pero no pendientes de RTL, estuvo detectado en el
gaur culturas de célula. CC = contenido de cromosoma; RTL =
relativo telomere longitud.
Porciones de aneuploid, poliploides y dicentric chromo-

Figura 5 somes ha sido documentado con número de paso
Contenido de cromosoma de culturas de célula creciente [10-12,26,27]. En uno estudia el porcentaje de
durante serial cultivation en vitro. Porcentajes de aneuploid las células variaron de 61.5% a 100% en
chromosomally células normales (% Células Normales) tardíos pas- células de salvia [27]. Nuestros resultados de
estuvo evaluado para (Un) ganado y (B) gaur culturas de modo parecido demuestran aquellas anormalidades de
célula. Una disminución en chromosomally las células cromosoma devienen cada vez más preva- dejados en las
normales ocurrieron en todas las culturas con aumentó células que se acercan el fin de su replicative lifespan.
pasos. Diferencias en el porcentaje inicial y el índice de
Rápidamente dividiendo, morfológicamente las células
disminución de chromosomally las células normales
estuvieron observadas en el diferentes tratar- ment normales tuvieron un porcentaje alto de chromosomally
grupos. Los efectos de técnicas de colección de la células normales, en más casos >80% normales. Después
muestra eran claramente evidentes en el gaur culturas de un tiempo prolongado en cul- ture, el número de
de célula. anormalidades de cromosoma gradualmente aumentadas,
deviniendo más prevalent en células de paso tardío con
hasta 58% células anormales como las culturas se
acercaron senescence. Aun así, en el mal estableció
culturas
Resultando de muestras iniciales pequeñas un porcentaje alto
de
Anormalidades de cromosoma estuvieron observadas
inicialmente o
Replicative senescence Está acompañado por un cambio mortem. Los cambios importantes eran sólo evidentes dentro
en el fenotipo de la cultura [5]. Las alteraciones en del último 10 PDL. Culturas que fallados para establecer
morfología están descritas como un aumento en exitosamente dis- jugó el senescence fenotipo inicialmente o
superficie de célula y volumen (i.e. medida) y un dentro del primer pocos PDL. Este overt el cambio en
flattening de la célula, ambos evidente por microscopia morfología sugiere que observación visual del fenotipo de una
ligera. Morfología de célula estuvo afectada por el índice cultura puede ser un indicador eficaz de el replicative potencial
de crecimiento y lifespan de la cultura y, por tanto, de una línea de célula.
influido por la colección de muestra y técnicas de
disociación de la célula cuando describió encima. Mucho Senescent Las células han sido según se dice caracterizadas por
tiempo-vivió las culturas exhibieron un gradual cambio niveles altos de anormalidades de cromosoma [25]. Aumentado
en morfología con número de paso aumentado cuando pro-
observado en piel y muestras de oreja correo recogido-
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Dentro 10 PDL.
BMC Biología Consiguientemente,
del desarrollo 2006, 6:41 corto-vivió http://www.biomedcentral.com/1471-213x/6/41
las culturas estuvieron caracterizadas por un
número bajo de chromosomally células normales
en la cultura primaria (42%) o por una
disminución rápida en chromosomally células
normales dentro del primer 5–10 pas- salvias
(72%–84% abajo a 32%–42% células normales).
Decreased Sembrando la densidad puede jugar
una función en acuciar senescence como las
divisiones de célula numerosas requirieron para
pri- mary la confluencia puede resultar en
primeras células de paso que son en una etapa
más tardía de replicative potencial. Otros estudios
han mostrado que culturas con inicialmente
niveles altos de chromosomally células
anormales (>40%) hubo casi 100% abnor- mal
metaphase extiende dentro 9 [12] y 17 pasos [26].
Desde entonces es altamente improbable para el
donante para tener niveles altos de chromosomally
células anormales con una gama de aneuploidies,
evidencia de este en pasos tempranos, sugiere un
problema con la colección y/o método de cultura.
Cambios en contenido de cromosoma ocurrido en
todas las culturas con el tiempo y el dato indica
que colección de muestra y técnicas de
disociación de la célula tienen algún efecto en
ambos el
Página 13 de
13.
Aquello el contenido de cromosoma de una cultura de

célula es directamente relacionado a su calidad y
longevidad.
Schwartz Et al. [16] había mostrado que cromosoma

instability estuvo causado por telomere acortamiento.
Los "fines" pegajosos de acortó telomeres predispose los
cromosomas a las fusiones y las translocaciones sabidas
cuando telomeric associa- tions [15], uno de los tipos
importantes de anomalías en chromosomally las células
anormales que se acercan senescence [26]. Tan critically
corto telomeres provocar el arresto de ciclo de célula
irreversible que typifies replicative senescence, Allsopp et
al. [9] propuso que telomere la longitud es un indicador
bueno del en vitro lifespan de células. Nuestro dato
confirma que telomere la erosión ocurre durante serial
cultivation de células. Aun así, una correlación entre
inicial telomere longitud, su índice de disminución y el
tipo de la cultura establecida (largo- vivió vs. corto-
vivido) no fue claramente evidente. Conse- quently,
colección de muestra y tecnología de disociación de la
célula- niques no apareció para tener un efecto
importante en telomere longitud. A pesar de que RTL
sólo no fue indicative del cul- ture replicative
capacidades, aparezca que la información más lejana
podría ser obtenida si el índice de acortar de telomere
Figura 6 longitud durante serial cultivation estuvo evaluado
Relativo telomere longitudes de culturas de célula también. Este se mantuvo con el hecho que modeling
durante serial cultivation en vitro. Relativo telomere chromosome estabilidad contra telomere la longitud
longitudes (RTL) estuvo evaluado para (Un) ganado y mostró que estabilidad de cromosoma no fue dependiente
(B) gaur culturas de célula. Una disminución en RTL
encima cualquiera telomere factor de longitud sólo pero
ocurrido en todas las culturas con aumentados pas-
salvias. Efectos de colección de muestra y tecnología de que sea altamente depender- ent en ambos inicial
disociación de la célula- niques no fue claramente relativo telomere longitud y su índice de cambio. Estas
evidente. observaciones concur con hallazgos anteriores donde una
relación directa estuvo notada entre chromo- algún
instability, telomere longitud y proliferative lifespan
[16]. Evaluando ambos cromosoma y telomere la
dinámica de culturas proporcionaría el necesario predic-
Nivel inicial de anormalidades de cromosoma y el índice tive parámetros en el largos-plazo en vitro capacidades
de disminución de chromosomally células normales. de una cultura de célula.
Estos observa- tions junto con la evidencia de estudios
anteriores sugiere Efectos encima producción de embrión por SCNT
El maquillaje genético de la célula de donante es un
crucial compo- nent para el éxito de tecnologías de
embrión novel como.
Mesa 2: SCNT desarrollo de embrión que utiliza collagenase culturas de digestión.
Animal Cultura de célula Embriones totales Día 8 Blastocyst (%)

(N)
GANAD PIEL COLL 117 36.1 ± 3.4un
O
PIEL COLL P-30 121 10.7 ± 1.0b
OREJA COLL 94 34.7 ± 3.4un
OREJA COLL P-30 76 1.4 ± 1.4b
GAUR DARDO COLL 74 0.8 ± 0.8un

PERFORADORA COLL 90 0.9 ± 0.9un
Página 14 de
13.
OREJA COLL 154 11.8 ± 1.3b
Una disminución significativa en blastocyst el desarrollo estuvo observado en reconstruyó embriones de cortos-vividos y cercanos-senescent líneas
de célula. Este dato indica que influencia de parámetros de cultura de célula el embrión del desarrollo competence siguiendo SCNT. N = Número
total de reconstruyó embriones (exitosamente fusionados couplets) colocados en cultura. Todas las culturas para SCNT estuvo preparado en
P-3 a P-5 a no ser que otherwise declaró. Un, b los superíndices dentro de columnas denotan una diferencia significativa entre tratamientos (p
< 0.05).
Página 15 de
13.
Figura 7
Morfología de preparaciones de célula de OREJA de ganado para SCNT. Contraste de fase micrographs de (Un)
paso temprano (P-5) y (B) paso tardío (P-30) fibroblast las culturas prepararon para SCNT demostrar cambios que ocurre
seguir crecimiento prolongado en vitro. Un aumento marcado en células con la medida ampliada y la morfología anormal
estuvo observada en la cultura de paso tardía.
ser probada. Aun así, técnica de colección de la muestra signifi-

SCNT. Desarrollo de embrión es dependiente a
cantly desarrollo de embrión afectado al blastocyst etapa.
apropiado reprogramming del genoma de donante de
Células de donante tomadas de pasos 3 a 5 de largos-vivió.
modo que los genes embrionarios son apropiadamente
expresó. Un cromosoma normal complementa es un
importante prerequisite para expresión de gen apropiado
para ocurrir en el temprano cleavage embrión de etapa.
Ha sido documentado que anormalidades de cromosoma
son detrimental a desarrollo de embrión continuado y es
la fuente importante de pérdida embrionaria temprana
[18,19]. En ganado, embriones de calidad pobre han sido
mostrados para tener números más altos de
chromosomally células anormales [17,20] y aneuploidy
combinó con aumentó niveles de fragmentación de
ADN, sugestivo de apoptosis, era associ- ated con lento
creciendo embriones humanos [28]. Schwartz Et al. [16]
había declarado que cromosoma instability en las células
crecidas en vitro ventajas a arresto de ciclo de la célula,
el cual provoca apoptosis, y que estas anormalidades de
cromosoma surgen a raíz de acortados telomere
longitudes. Así, él nat- urally sigue aquello acortó
telomere longitudes también resultado en embriones de
calidad pobre. Varios estudios han mostrado que
decreased telomere las longitudes en gametos causan una
incidencia más alta de fragmentación citoplasmática, el
cual contribuye a apoptosis y anormal cleavage en
embriones tempranos [29,30]. Nuestro dato indica que
las características de las culturas de célula del donante
eran directamente relacionados al potencial del desarrollo
de SCNT embriones. Desde las células únicas obtuvieron
por collagenase la digestión estuvo utilizada para SCNT,
el efecto de técnica de disociación de la célula no podría
Página 16 de
13.
BMC
Las Biología
culturas del desarrollo 2006,
produjeron 6:41 blastocyst
adecuadas http://www.biomedcentral.com/1471-213x/6/41
índices de approxi- mately 35% y 12% para
ganado y gaur, respectivamente. Estos índices son
comparables a aquellos producidos por ganado y
gaur SCNT en otros estudios [31-33], y hemos
demostrado que el decreased blastocyst la cosecha
sigue- ing gaur SCNT se debió a el uso de
interspecies SCNT en qué un ganado exótico
núcleo de donante (gaur) está dirigiendo el
ganado doméstico recipient citoplasma (taurus)
[31]. En este caso, a pesar de que la dos especie
es estrechamente relacionada, suf- ficient las
diferencias existen entre ganado y gaur en el nivel
genético y molecular a cuenta para diferencias en
dinámica de crecimiento del embrión [31].
En el estudio presente, células de donante del

ganado que se acercan replicative senescence
(paso 30; 60 PDL) utilizó para SCNT produjo
significativamente bajar blastocyst desarrollo. Los
resultados similares estuvieron informados por
Lanza et al. [34] quién notó sólo 5% blastocyst el
desarrollo que sigue SCNT utilizando bovino
fibroblasts passaged a más grande que 95% de su
lifespan y mostrando las señales morfológicas
consisten- ent con senescence. En paso 30, las
células de donante del ganado en este estudio
exhibieron cambios en morfología indicative del
impending arresto de crecimiento, un aumento en
chromo- algunas anormalidades y una
disminución en telomere longitud. El uso de gaur
células de donante de cortos-vivió las culturas
obtuvieron por dardo y biopsias de perforadora
manual para SCNT también producidos
significativamente bajar blastocyst el desarrollo
comparó al largo-cultura vivida del gaur oreja
sam- ple. Estas células de donante tuvieron
características similares al paso de ganado 30
células, con cambios morfológicos y
Página 17 de
13.
vides evidencia que la implementación de estandarizó

Anormalidades de cromosoma aumentado. Un directo
técnicas para la preparación y la valoración de líneas de célula
correla- tion puede ser hecho entre las alteraciones en
es vital al éxito del genoma que amontona. Utilizando
carácter de célula- istics y desarrollo de embrión pobre.
criterios de selección apropiada, líneas de célula con el
El análisis estadístico de nuestro dato indicó que
potencial para éxito- ful el desarrollo puede ser considerado
blastocyst índices de desarrollo de culturas de célula
para estudio más lejano y amontonando.
utilizaron para SCNT era dependiente encima técnicas de
colección de la muestra y estabilidad de cromosoma de la
línea de célula del donante. Estudios por Slimane et al de
Agencia. [22] y Giraldo et al. [12] ha demostrado que la
frecuencia de anormalidades de cromosoma en la línea
de célula del donante cor- responde a la frecuencia de
anormalidades de cromosoma en el SCNT los embriones
produjeron. Así, un porcentaje alto de anormalidades de
cromosoma [12,22] o decreased telomere longitudes
[29,30] en los blastómeros de SCNT embriones, puede
resultar en aumentó niveles de apoptosis o arresto de ciclo
de la célula, los cuales pueden ser un factor de contribuir
a su defunción temprana.
Conclusión
Un aumento dramático en la pérdida de hábitats
naturales, índices altos de inbreeding, y reducidos
reproductivos actuar- ance en ambos animales salvajes
y domésticos han creado el necessity para recurso de
genoma que amontona de valioso indi- viduals, razas o
especie globalmente. Muestras de tejido para el
establecimiento de líneas de célula está siendo recogido,
las células crecidas en vitro y cryopreserved utilizando
colección de muestra numerosa y técnicas de
establecimiento de la cultura. A pesar de que viable
para uso en estudios moleculares, estos sam- ples puede
probar para ser inadecuado para uso con tecnologías
como SCNT. Este estudio estuvo actuado para obtener
un mejor entendiendo de los efectos de tecnología de
iniciación de la cultura- niques encima características
de cultura y el potencial del desarrollo subsiguiente de
SCNT embriones. Además, esperamos establecer
marcadores de célula viability para asistir con la
selección de líneas de célula de calidad buenas para
SCNT. Hemos mostrado que colección de muestra y
técnicas de disociación de la célula influyen el en vitro
características de crecimiento y lifespan, morfología,
contenido de cromosoma y telomere dinámica de
líneas de célula. La relación entre los parámetros
examinó aquí y el replicative lifespan de células en
vitro, muy en particular, tiempo a primario conflu-
ence, morfología de célula y contenido de cromosoma,
demonio- strate que varios marcadores pueden ser
evaluados en las fases iniciales de cultura para evaluar
el proliferative potencial de una línea de célula. La
correlación significativa entre chromo- alguna
estabilidad y SCNT desarrollo de embrión proporciona
el investigador con un medio para evaluar el
developmen- tal potencial de una línea de célula del
donante y así dejando la selección de un protocolo de
establecimiento de la cultura que pro- duces la mayoría
de culturas genéticamente estables. Este estudio pro-
Página 10 de
13.
cada línea dehttp://www.biomedcentral.com/1471-213x/6/41
célula. En paso 1 (P-1) y cada cinco pasos
Métodos
BMC Biología del desarrollo 2006, 6:41
(P-5, P-10, etc) hasta que senescence, las muestras
Todas las sustancias químicas estuvieron
estuvieron evaluadas para morfología (bajo la
adquiridas de Sigma Químicos Co. (St. Louis,
microscopia ligera que utiliza un Leica inverted
MO, EE.UU.) a no ser que otherwise declaró.
microscopio en 40X magnification), contenido de
Diseño experimental cromosoma y telomere longitud. Células de collagenase
A) Efectos de técnicas de colección de muestra de tejido los tratamientos estuvieron preparados y utilizados para
SCNT en pasos 3 a 5..
Las muestras estuvieron recogidas de un gaur toro
como sigue: un) obteniendo la piel que utiliza 3
mm × 10 mm dardos de biopsia despidieron de
una pistola de aire (DARDO), b) obteniendo la
piel que utiliza 4 mm × 6 mm perforadoras de
biopsia manualmente en un anestesiados animal
(PERFORADORA), y c) obteniendo una porción
del correo de oreja- mortem (OREJA). Cuando
controles, las muestras estuvieron recogidas de un
toro doméstico por obtener una porción de piel
(PIEL) y oreja (OREJA) correo-mortem.
B) Efectos de técnicas de disociación de la célula

Cada muestra recogió estuvo sometido al
siguiente dos tratamientos: un) explants de tejido
(EXPL) y b) collagenase digestión de tejido
(COLL).
Preparación de fibroblast culturas de célula

Ganado doméstico (Bos taurus) las muestras de
piel u oreja estuvieron obtenidas de material de
matadero. Gaur (Bos gaurus) Las muestras de piel
u oreja estuvieron obtenidas de gaur albergados en
el Zoológico de Toronto. Inmediatamente a
colección, las muestras eran inmediatamente
colocadas en fosfato buffered saline (PBS) + 1%
antibiótico-antimycotic (ABAM; Invitro- gen Inc.
de Canadá, Burlington, ENCIMA, Canadá)
encima hielo para transportar al laboratorio. Cada
muestra era chopped a piezas pequeñas (1 mm × 1
mm) cuál era equitativamente dis- tributed al
fondo de una cultura de tejido flask para
explanting o digerido para 3–5 horas en 0.5%
collagenase tipo yo en Dulbecco está Modificado
el medio del águila (DMEM). Todas las muestras
eran cultivadas en DMEM + 1% ABAM + 20%
suero bovino fetal (FBS) en 25 cm2 cultura de
tejido flasks en
38°C en airea contener 5% CO 2 y el medio estuvo
reemplazado cada 3 –4 días hasta que la
confluencia estuvo conseguida.
El número de días requirió para conseguir la
confluencia de la cultura primaria estuvo grabada
para cada muestra (confluencia primaria). Todas
las líneas de célula eran passaged en confluency en
DMEM + 1% Penicilina/Streptomycin (P/S;
Invitrogen Inc. de Canadá) + 10% FBS en una
dilución de 1:4 para approxi- mately 2 población
doublings (PDL) por paso hasta senescence.
Senescence Estuvo caracterizado por el fracaso de
la población para plegar después de que 3 semanas
de cultura con reg- ular cambio de medio. El
número de PDL a senescence estuvo grabado para
Página 11 de
13.
Análisis de contenido del cromosoma volúmenes de reacción (utilizando 2 l de muestra por reacción)
Metaphase El Spread estuvieron obtener utilizando para control 293T ADN y todas las muestras. El LightCycler
Faststart ADN Maestro SYBR caja Verde (Roche Diagnósticos,
tecnología estándar- niques. Brevemente, 0.05 g/ml de
Indianapolis, EN, EE.UU.) estuvo utilizado con un 3 mM
colcemid (Invitrogen Lata- ada Inc.) estuvo añadido a un
concentración final de MgCl 2. El ensayo incluido
activamente creciendo cultura para 2– 3 horas. Las
Amplificación de el telomere (T) y un solo-copia (S)
células estuvieron cosechadas y tratados con hypotonic
Gen (BTF3) para normalización. Las dos reacciones eran
solución (0.075 M KCl) siguió por fijación con metha-
nol:ácido acético (3:1/v:v). Las células estuvieron
extendidas a deslizamientos y stained para 15 minutos
con 4% Giemsa. Cincuenta giemsa stained metaphase
spread de cromosoma de cada sam- ple estuvo
examinado en 100× magnification y el porcentaje células
normales y anormales estuvieron grabadas. Índices de
cambio de contenido de cromosoma sobre pasos en
cultura (pendiente) estuvo obtenido de análisis de
regresión lineal del por- céntimo células normales.
Relativo telomere análisis de longitud

a) DNUna extracción
Las células cosecharon por trypsinization estuvo lavado
una vez con PBS y las pelotitas de célula estuvieron
congeladas en -80°C hasta que extracción de ADN
podría ser llevada a cabo. Extracción de ADN y pre-
cipitation estuvo llevado a cabo utilizando un fenol
estándar-etha- nol técnica. Brevemente, un volumen
igual de cloroformo/ de fenol/isoamyl alcohol (PCI)
estuvo añadido a las pelotitas de célula en un 1.5-ml
microcentrifuge tubo. La solución estuvo mezclada
suavemente para 5 minutos y centrifuged para 10 min-
utes en 10,000 rpm en temperatura de habitación. La fase
acuosa que contiene el ADN estuvo sacado y transferido
a un tubo nuevo. Esto estuvo repetido varios tiempo . Un
volumen igual de cloroformo: isoamyl alcohol (24:1/v:v)
era entonces añadido y la solución estuvo mezclada
suavemente para 2 min- utes seguido por centrifugación
para 1 minuto en 10,000 rpm. La fase acuosa que
contiene el ADN estuvo sacado, transferido a un tubo
nuevo y 2 volúmenes de hielo- frío 100% etanol estuvo
añadido. La solución de ADN estuvo mezclada
suavemente y colocado en -20°C por la noche o en -70°C
para 1 hora. El supernatant estuvo sacado después de
centrifuga- tion para 20 minutos en velocidad máxima.
70% etanol era cuidadosamente añadido a la pelotita en
temperatura de habitación y cen- trifugation en la
velocidad máxima estuvo repetida. La pelotita era
entonces secada en temperatura de habitación, disuelto
en 20–50
l De Tris-EDTA buffer (pH 8.0) y almacenado en -
20°C hasta que
Necesitado.
b) Relativo Telomere Longitud (RQ-Telo Ensayo)

Cuantificación de tiempo real de relativo telomere
longitud (RTL) para uso con el LightCycler estuvo
basado en el original pro- tocol descrito por Cawthon
[35] y modificado por Gil y Coetzer [36]. Brevemente,
las reacciones estuvieron actuadas en triplicate en 10 l
Página 12 de
13.
BMC Biología RTLs. http://www.biomedcentral.com/1471-213x/6/41
Preparado dedeluna
desarrollo
mezcla2006, 6:41 sola, y el
maestra
telomere y amplificaciones de gen de copia sola
estuvieron actuadas en serial. Primers Para el Somatic Célula transferencia nuclear
telomere la reacción estuvo añadida en una SCNT Estuvo llevado a cabo según el protocolo de Mas-
concentración final de 0.2 M y 0.3 M para Tel tromonaco et al. [32]. Piel de adulto u oreja fibroblasts
1b y Tel 2b, respectivamente. El BTF3 primers era cultivado cuando describió anteriormente y
estuvo añadido en un final con- centration de 0.5 mantenido en con- fluence para 1–3 días hasta que
pM. El telomere primer las secuencias eran como procesados para SCNT. Brevemente, cúmulo de ganado
sigue:. doméstico-complejos de oocito estuvieron recogidos
Tel 1b: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGTTT-

GGGTTTGGGTT-3'
Tel 2b: 5'-

GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTAC-
CCTTACCCT-3'.
El primer las secuencias para el gen de copia sola

eran tan fol- lows:
BTF3u: 5'-AGGAACTGCTCGCAGAAAGA-
3' BTF3d: 5'-
GCCCGTAATGGTGAAAGTGT-3'.
El telomere ensayo de longitud constó de un 10

minuto incu- bation en 95°C para activación de
enzima, seguido por 20 ciclos en 95°C para 5
segundos, 56°C para 10 segundos, y 72°C para 60
segundos y adquisición de fluorescencia. El
ensayo de gen de copia sola constó de un 10
minuto incuba- tion en 95°C, seguido por 35 ciclos
en 95°C para 5 segundos, 60°C para 5 segundos, y
72°C para 20 segundos y fluores- cence
adquisición. Cruzando puntos (Cp) estuvo
determinado por el segundo método derivado que
utiliza el LightCycler software.
c) RQ-Telo Análisis
El RQ-Telo el ensayo determina el telomere señal
de una muestra por normalización al gen de copia
sola amplifi- catión, y está expresado relativo a
una muestra de control que está amplificado en
todos los ensayos. Para cada muestra, tomando el
median Cp de triplicate telomere y
amplificaciones de gen de copia sola error
minimizado. El T/S la proporción para una
muestra sola estuvo definida como la diferencia
en Cp entre el telomere y gen de copia sola, o [2
Cp(telomere)/2Cp(BTF3) ] = 2-Cp [35]. Finalmente, el
T/S la proporción de cada muestra era com- pared

con la muestra de referencia para dar el pariente
T/S proporción por 2-(Cp1-Cp2). Un T/S la
proporción para cada muestra era allí- fore
determinado, y expresado como relativo T/S
proporción, o relativo telomere longitud (RTL) a
la muestra de referencia. Índices de cambio de
RTLs sobre pasos en cultura (pendiente) estuvo
obtenido de análisis de regresión lineal de el
Página 13 de
13.
contenido del cromosoma de valores de cambio. Los análisis de

Por aspiración de folículo y entonces cultivado en regresión eran significativos con un p-valor de
modificado syn- thetic oviductual medio fluido < 0.05.
(mSOFaa) + 2% steer hormonas + de suero (E2, FSH y
LH; USDA Nacional Hor- mone y Programa de Péptido, Autores' contribuciones
Torrance, CA, EE.UU.) en 38.5°C en 5% CO2 en aire GFM Participó en el diseño del estudio, actuó la cultura y SCNT
para 18 horas. Oocitos con un. experimentos, incluyendo PDL, mor- phology, contenido de
El cuerpo polar era stained con Hoechst 33342 para cromosoma y desarrollo de embrión
visualizar
El metaphase plato. Oocito enucleation y transferencia de
célula del donante estuvo llevada a cabo en modificó
Tyrode medio debajo aceite de silicona. Fusión de célula
estuvo llevada a cabo en 0.28 M mannitol solución + 100
M MgCl2 + 100 M CaCl2 con
Un estímulo eléctrico de 1.5 kV/cm para 40 s.
Recon-
structed Embriones (exitosamente fusionados couplets)
era acti- vated utilizando 5 M ionomycin seguido por
10 g/ml cycloheximide. Los embriones eran cultivados
en mSOFaa medio + 8 mg/ml fatty ácido-libre BSA en
38.5°C en 5%
CO2, 5% O2, 90% N2 para 8 días, y evaluados para blasto-
desarrollo de quiste encima día 8 en 196 horas de
cultura..
Análisis estadístico
a) SCNT Desarrollo de embrión
Para cada línea de célula utilizó, SCNT estuvo repetido 3
tiempo con N representando el número total de
reconstruyó los embriones colocados en cultura.
Blastocyst Índices de desarrollo estuvieron determinados
como porcentaje del número de recon- structed los
embriones produjeron. Los valores están informados
cuando significa
± El error estándar del malo (SEM). El efecto de los
tratamientos estuvo analizado utilizando el-manera
ANOVA, fol- lowed por Tukey correo-hoc análisis
(Minitab para Ganar- dows, Minitab Inc., 1998), o el
equivalente no- parametrical prueba (Kruskal-Wallis
prueba) cuándo las muestras no conocieron la suposición
de distribución normal u homo- geneity de varianza.
Diferencias con probabilidades (p) <
0.05 estuvo considerado significativo.
b) Chromosome Y telomere dinámica

Para determinar si había una dependencia significativa
de estabilidad de cromosoma, definido como el
cromosoma con- índice de tienda de cambio sobre pasos
en cultura, en telomere dinámica, telomere valores
(variables continuas) includ- ing inicial, final, y índice de
RTL de cambio, y valores de fuente (variables de clase)
incluyendo animal, método de colección de la muestra, y
método de disociación de la célula estuvo probado por
mul- tiple análisis de regresión lineal (SAS 8.0) contra el
chromosome dato de contenido. Para determinar si
había una dependencia significativa de blastocyst
desarrollo encima estabilidad de cromosoma, blastocyst
dato de desarrollo estuvo probado por análisis de
regresión lineal múltiple (SAS 8.0) contra el índice de
Página 14 de
13.
L: Aneu- ploidy y telomere attrition es determinantes
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proporcionada de los resultados y contenidos de 18. King WA, Coppola G, Alexander B, Mastromonaco G, Perrault S,
manuscrito, y adquirió el fondo- ing para el Nino-Soto MI, Pinton Un, Joudrey EM, Betts DH: El impacto
de
programa de búsqueda. Todos los autores leídos
y aprobó el manuscrito final.
Acknowledgements
Este proyecto se mantuvo con NSERC (GFM), CIHR (DHB y
WAK) y el CRC Programa (WAK). El deseo de autores para
dar las gracias a Dr. Graham Craw- shaw y el personal de
cuidado animal en Zoológico de Toronto, Ed Reyes, Liz St. John,
Grant Perry, Raj Kukreja y Lucy Lin para asistencia técnica.
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telomere longitud. Mol Biotech 2004, 27:169-172.
diseminar los resultados de biomedical búsqueda en nuestro
lifetime."
Enfermero de Paul del señor, Búsqueda de Cáncer Reino Unido
Vuestros papeles de búsqueda serán:

Disponible libre de cobrar al entero biomedical comunitario
Páginacitada
peer revisado y publishedimmediately a la aceptación 16 de
13.
en PubMed y archived en PubMed Central
Página 17 de
13.

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Artículo de búsqueda Acceso

Publicado: 09 agosto 2006 Recibido: 01 junio 2006

De fondo Propagación de líneas genéticas valiosas, y el preserva-

células anormales en culturas de paso tardío ha sido

La última década ha visto un aumento dramático en el

Es bien sabido que más somatic las células crecidas en

Serial prolongado cultivation de células en vitro

En vitro producción de embriones,

Para mejorar SCNT éxito, la atención prudente

Los objetivos de este estudio eran para investigar los

Cuál requirió sólo 5–6 días (COLL) y 11–12 días

Para examinar phenotypic cambios durante serial

Para examinar cambios en estabilidad genómica

mostró un abnor- mal aspecto. Blastocyst Índices para gaur

Estabilidad de cromosoma estuvo probada para

Los efectos de calidad de cultura de la célula en la

Efectos encima características de cultura

confluencia primaria y el número de PDL estuvo observado, con

Una relación entre la cantidad de cronometrar a

Mesa 1: Índice de cambio (pendiente) de contenido de

Animal Cultura de CC RTL

GAUR DARDO EXPL - -

Las pendientes estuvieron obtenidas análisis de regresión lineal

Porciones de aneuploid, poliploides y dicentric chromo-

Aquello el contenido de cromosoma de una cultura de

Schwartz Et al. [16] había mostrado que cromosoma

Mesa 2: SCNT desarrollo de embrión que utiliza collagenase culturas de digestión.

Animal Cultura de célula Embriones totales Día 8 Blastocyst (%)

GAUR DARDO COLL 74 0.8 ± 0.8un

ser probada. Aun así, técnica de colección de la muestra signifi-

En el estudio presente, células de donante del

vides evidencia que la implementación de estandarizó

B) Efectos de técnicas de disociación de la célula

Preparación de fibroblast culturas de célula

Relativo telomere análisis de longitud

b) Relativo Telomere Longitud (RQ-Telo Ensayo)

Tel 1b: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGTTT-

Tel 2b: 5'-

El primer las secuencias para el gen de copia sola

3' BTF3d: 5'-

El telomere ensayo de longitud constó de un 10

T/S la proporción de cada muestra era com- pared

contenido del cromosoma de valores de cambio. Los análisis de

b) Chromosome Y telomere dinámica

Alteración de cromosoma encima desarrollo de embrión.

Vuestros papeles de búsqueda serán:

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