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rccerían por mutaciones independientes del medio ambiente con una pos-
terior selección de aquellos tipos mejor adaptados. Varios experimentos
que levantaron gran expectación demostraron que las mutaciones en las
bacterias también eran espontáneas y no direccionales. De estos experi-
mentos clásicos presentaremos aquí tan sólo uno; es fácil de comprender
y demuestra la técnica de los calcos actualmente muy practicada en todos
tos laboratorios.
Selección indirecta d e mutantes por transferencia con calcos. El expe-
rimento de selección de LEDERBERG ( 1952) resiste cualquier objeción. En
esta experiencia se empleó por primera vez la técnica de los calcos, actual-
mente muy utilizada. Sobre una superficie de agar con colonias crecidas
se aprieta un calco recubierto con terciopelo y de un diámetro algo infe-
rior al de la placa de Petri. Los pelos del terciopelo quedan así cargados
de un inóculo. Si se presiona entonces con este calco sobre una placa de
agar no inoculada se transferirán todas las colonias y con la misma dispo-
sición.
n
~, 1O' células
n 10'células
ó l l
0 l
..
..
~ª~
lin fagos
111.
con fagos
o . .
.
l=ig. 15.1 Demostración del carácter no direccional de la mutación en bacte-
rias empleando el método de los catcos ("refJlica plating"). Aclaraciones en el
texto.
496 15. Genética bacteriana
~~~~~~~~~~~~~~~
~~~~
IlI[:~l!!!!!i!!t~j~::II
L-v--' L-v--' L...-y--1 L...-y--1 L...-y--1 ~ L...-y--1
Lys Val Hos HtS Leu Met 1 Ala
doble mutante
254 nm
t-- curva e&pectral de acción
1 para inactrvar la células
(elmnadón)
- curva de absorción
de los ácidos nucletCOS
313nm
H~CH3C
HH
0 O '$;N /
N
desoxirri·
bosas
N, O
/ H O
H dímeros de timina
~
AG =""'"'·~
~
A "'""'"" T~
G·'"""'"'G
T """"'"' A T A
T •"'c~"" A T A
C;cc;c;;cG e
G "'"""'" C G '""""'..
fotorreactivación reactivación en la oscuridad
~
1
mutación
1
~
}•división\ Fig. 15.5 Representación esquemática
~~
de la segregación de los núcleos en la
multiplicación de una bacteria multinu-
/2• d1vls16~ cleada. Hasta la tercera división no aparece
un clon genéticamente puro. La expresión
~~ de la mutación en el fenotipo puede requerir
/3• divisió~ más generaciones hasta que se dé una
"dilución" del material procedente de la célu-
~~ la materna.
Mutantes resistentes
Frente a inhibidores, antibióticos, Siembra en placa de un gran número de
tóxicos o bacteriófagos células (> 108) en medíos de cultivo que
contienen al agente letal. Los mutantes
resistentes, que no captan al ínhibídor o lo
destoxífican, sobreviven y forman colonias
-..utantes auxotróficos
Defectuosos en la síntesis de Utilización de la técnica de la penicilina
vitaminas, aminoácidos, para matar las células silvestres;
ácidos nucleicos u otros siembra de las células supervivientes sobre
constituyentes celulares medios de cultivo que contienen trazas
del metabolito que no pueden sintetizar
los mutantes auxótrofos. Los mutantes
se reconocen por desarrollar colonias
puntíformes. En ausencia del nutriente
no pueden crecer (Fíg.15.8)
Mutantes catabólicos
Defectuosos en un enzima de la Enriquecimiento por la técnica de la
degradación del sustrato. Deficiencia penicilina. Método directo de selección:
en la fuente de carbono o energía utilización de medíos indicadores (p. ej.
eosina-azul de metileno, X-gal, rojo neutro,
cristal violeta) en los que por ejemplo los
mutantes productores de ácidos provocan un
cambio en la coloración . Métodos indirectos
de selección: reconocimiento de colonias
puntuales (Fig. 15.8)
Mutantes dependientes de la
temperatura
Se modifica la respuesta frente a la Enriquecimiento por cultivo a temperaturas
temperatura de la formación o la que suponen una ventaja para el mutante
estructura de una proteína, de modo frente a la cepa silvestre.
que resiste temperaturas superiores Utilización de la técnica de la
(resistente a la temperatura) o que penicilina (sí es posible)
manifiesta una sensibilidad frente
al calor (sensible a la temperatura)
Mutantes en la regulación
Moctificados en la tasa de síntesis de Mutantes, cuya síntesis enzimática ya no está
uno o varios enzimas de una vía sometida corno en la cepa silvestre a la
metabólica inducción/represión (apartado 16.1.1y16.1 .2),
sino que forman los enzimas catabólicos o
biosintéticos de forma constitutiva, pueden
enriquecerse por:
- cultivo continuo con el sustrato corno factor
lírnitante
- crecimiento alternativo sobre dos sustratos
- crecimiento en presencia de un
antírnetabolíto, que inhibe el crecimiento
de las células silvestres
506 15. Genética bacteriana
Mezcla de celulas de topo sdves1re muertas. de celulas de bpo silv86tre vrvas y de unas pocas célu-
las vrvas "1><emutadas"
Crecim1en10 en un medio de cultivo (medlO completo) en el que 1anto crecen las célu-
las de tipo silvestre como los mulantes
Las células de tipo silvestre crecen en ambos medios, mientras que 108 mutantes auxotróf1cos sólo
crecen en el medio completo. Se inoculan los mutantes.
JO s habóa que investigar 100 millones de célu la., o bien entre su de'>·
cendencia, para encontrar al nuevo mutanle. A pe'>ar de que la frecuen-
cia de mutación puede ser ba'>lante superior de,pué<. de una mu1agénesis
con agentes mutágenos, el trabajo en la bú-.queda de mutanles por pérdi-
da de una caracterí!>tica es aún considerable. Por ello, se realiza primero
un enriquecimiento de mutantes. anterior a la selección di recta.
El enriquecimiento de mutantes auxótrofos se basa en el principio de
someler la suspen'>ión de células a unas condicione-, hajo las cuales no
puedan crecer lo'> mutantes buscados, pero !>i la'> células prototrofas que
pueden t.er en1onces eliminada<,. Esto puede com.eguirse medianle
agentes que ac1úen únicamente contra célula<, en crec1rn1ento y que no
influyan para nada sobre la., células "en repo...o" que no estén crecien-
do. Al eliminarse el agente letal y añadir lm fac1ore ... de crecimiento
necesarios podrán de..,arrollarsc las células auxó1rofa-.. Para el enrique-
cimiento de mutantes auxótrofos de Escllerichia coli se utiliLa la peni-
cilina o su derivado, la ampicilina. Ésta mata a la-. células silvestres en
crecimiento y permite que sobrevivan las célula' muHullcs en reposo
(véase Fig. 15.7).
508 15. Genética bacteriana
~~~~~~~~~~~~~~~~~~
~-
Fig. 15.8 Colonias silvestres (de tamaño normal) y colonias puntuales ("pin-
point" ) de un mutante auxotrófico defectivo de Escherichia coli. El medio de c1 •
tivo contiene glucosa en exceso (0,4%) y caldo nutnhvo ("nutrient broth") en muy ba¡a
concentración (0,005%); así se limita el crecimiento del mutante, que requiere una
sustancia que contiene el caldo nutritivo.
Med iante estos truco~. u otros análogos (p. ej. selección de mutantes
"pin-point", de colonia~ puntuales) (Fig. 15.8). pueden enriquecerse Y
ai-.larse distintos tipo'> de mutantes: mutantes con lesiones en el trai s-
porte o en la degradación de sustratos, lesione~ en e l metaboli\mo intcr-
mediano, .,ensible'> a la temperatura (.. letale-. condicionales") Acerca
de la técnica para el ai-;lamiento de célula., modificadas en la regulación
metabólica insistiremo., má., adelante. La tabla 15.2 da una vi<,1ón Je
conj unto de los métodos utili1ados para la selección y e l reconocinrn;n-
to de distintos tipos de mutantes, incluidos los tipos defectuosos en la
regulación.
15.1 Mutación y mutagénesis 509
exlraclo de h ogado
de rata
ij ·-
bactena
\
proteína de unión
rotura
-~
proteína RecA
RecA, sino por enzimas que son específicos para cada molécula de DNA
que haya de recombinarse. Si los dos DNA llevan una secuencia de reco-
nocimiento, se habla de una recombinación de sitio específico doble
("doublc site-specific"). Ejemplos de todo ello son la integración del fago
lambda (Fig. 15.11) y del plásmido de fertilidad F (Fig. 15.18) en el
genoma de Escherichia coli. Si solamente una de las dos moléculas de
DNA que han de recombinarse lleva la secuencia de reconocimiento. se
habla de una recombinación de sitio específico único ("single site-speci-
fic"). Ejemplos son los elementos genéticos transponibles (secuencias de
inserción, transposones, bacteriófago Mu) que se explicarán a continua-
ción.
Los experimentos genéticos realizados indican que el fago lambda, al
pasar al estado de profago, se inserta en un determinado lugar del cromo-
soma del hospedador, y precisamente entre el operón galactosa y la región
biotina (Fig. 15 .1 1). La inserción se inicia por un anclaje.
Anteriormente se pensaba que este anclaje tenía lugar como consecuencia
de una elevada homología en las secuencias de bases en esta región, entre
las regiones attP y attB. No obstante, la homología en la secuencia de
bases es baja y sólo implica 15 pares de bases que son la región de reco-
nocimiento de una proteína codificada por el fago, que recibe el nombre
de i11tegrasa. La integrasa corta en esta zona al DNA de doble cadena del
fago y al del hospedador de un modo semejante a una nucleasa de restric-
ción (apartado 15.4). Se generan en cada DNA dos extremos cohesivos
514 15. Genética bacteriana
@ Q
~
~==
bio attB gal bio gal bio Á gal
J
por la transposasa
IS IS
U V W X
A) ::t:I =11~1:::::=.=::t:q:t=I=+=I
transposón
">--m-ez_c_i
a_d_e_o_N_A_(A_+_B_l__ ~
calentamiento y enfriamiento
V V W X
B) 1 1 1 1
Fig. 15.13 Cómo pueden reconocerse transposones por análisis de heterodú-
plex mediante microscopia electrónica. Para visualizar el transposón se calienta
el DNA de la bacteria silvestre By de la bacteria A que lleva el transposón, de forma
que se separan las cadenas ("funden"). En el lento enfriamiento subsiguiente de la
mezcla se establecen apareamientos complementarios entre bases de cadenas sen.
cillas de A con otras de B: se forma un heterodúplex de DNA. Si el transposón tiene
"inverted repeats" (secuencias de inserción IS complementarias e inversas) en sus
extremos, éstas también se aparean y forman un pedúnculo, sobre el que aparece
la parte central del transposón, de una sola cadena formando un lazo (estructura
"lollipop" o "chupa chup").
15.2.2 Transformación
Se denomina transformación a la transferencia de genes por DNA libre.
soluble, liberado por una bacteria dadora o que se ha extraído de ella, ha~ta
una bacteria aceptora. Es el tipo de transferencia de caracteres en bactenas
conocido desde más antiguo y de mayor valor histórico.
15.2 Transferencia de caracteres y recombinación genética 517
15.2.3 Transducción
Se denomina lransduccion a la transferencia de DNA a partir de una célu-
la dadora a otra aceptora mediante bacteriófago.... Por lo general 'e trans-
fiere únicamente un pequerfo fragmento del DNA del hospedador. Pueden
difcrenciar-..e dos tipos de transducción: una inespecífica (generali1ada)
en la que puede transferirse un fragmento cualquiera del DNA del hospe-
dador, y una transducción específica que permite tan sólo la transferen-
cia de unos fragmentos determinados de DNA. En la transducción ines-
pecífica se incorpora el DNA hospedador en lugar. o además, del genoma
del fago. mientras que en la transducción específica se sustituyen algunos
gene'> fágicos por genes del ho,pedador. En ambos casos se trata de fagos
tran,ductores que por lo general son defectuo-.os. p. ej. pierden frecuen-
temente la capacidad de lisar a la célula receptora. Las caracterí,ticas de
la transferencia por transducción se han demostrado en un gran número
de bacterias, entre ellas especies de Salmo11el/a, Escherichia, Shigel/a,
Bacil/u.1·, Pseudo111011as, Staphylococcus, Vibrio y Rhizobium. No obstan-
re, no todos los fagos son transductores ni todas las bacterias son trans-
ducibles.
Transducción inespecífica. La transferencia de genes bacterianos por
fago.., la descubrieron LrorRBFRG y ZINDER en Sa/111011ella typhim11ri11m en
1951. En el experimento decisivo (Fig. 15.15) se infectó a la cepa dadora
B• con el fago atenuado P22. Una vez lisadas las células hospedadoras se
15.2.4 Conjugación
Se den?mina conjugació n a la transferenc ia de material genético por con-
rncto directo de un~ célula a otra. Debido a indicios morfológic os se supo
ma ya desde hace uempo que podía darse un aparcamien to también entre
bacterias. Experienci as con mutantes múltiples aportaron la demostraci ón
inequívoca de que entre las bacterias era posible una transferenc ia de
material genético a través del contacto directo de célula a célula. LEDrR-
Bt-RG y TATlM reali7aron en 1946 el experiment o de cruzamient o decisi-
vo con dos mutantes de E. co/i K 12. cada una de las cuales era auxótrofa
para dos aminoácido s distintos (Fig. 15.16). Una doble mutante era auxó-
medio de CUIWO
completo
Flg. 15.16 Recombinación por conjugación de dos mutantes por defectos dis-
Untos y recíprocos de la cepa K 12 de Escherlchia colf (según BRAUN, W.
Bacteria! Genetics. Saunders, Filadelfia, 1965).
522 15. Genética bacteriana
Flg. 15.17 Células de Escherichla coli unidas por pili F Los dos pili F de la célu-
la Hfr están marcados por fagos RNA MS-2 que son especihcos de dadores. Los
numerosos pili tipo 1 de la célula receptora (arriba) son cortos y no adsorben al fago.
Micrografía electrónica de un contraste negativo con ácido fosfotúngstico. La barra
tiene una longitud de 1 µm (de CURTISS, R.; CARO. L.G., ALLISON, O.P.. STALLIONS,
D.R.: J. Bacteriol. 100 (1969) 1091).
o
e
con¡ugac>Oll con F"
tratamiento con
anaran1ado do
acndina
6
Flg. 15.19 Mapa genético del cromosoma de Escher/chfa coli. Las cifras dan las
distancias relativas de los genes en lapsos de tiempo (minutos), en los que los genes
legan a la célula receptora en la con¡ugación (en caldo nutnllvo a 37º C). Las flechas
ro,as en et intenor del circulo marcan la secuencia en la que tos genes llegan a la
bactena receptora en ta con¡ugacíón con distmtas cepas Hfr La dirección de migra·
Ci6n del cromosoma es opuesta a ta de ta flecha . Las flechas ro¡as externas 1nd1can
la dirección en ta que se leen tos genes individuales de un operón durante la trans·
cnpción (p. ej. en el operón lac P, O, Z, Y, A}. Aclaraciones de los símbolos de los
= =
Qenes: azí resistencia a la acida; bío requerimiento de biotina; gal= utilización de
la galactosa; h1s = requerimiento de histidina con los genes de los enzimas impli·
=
C&dos en la síntesis de hishdina, 1/v requerimiento de 1soleucma y valina; /ac ope-
= =
rón ~ac con los genes P promotor. O operador, Z = fJ-galactosidasa, y = ga-
lactos1do-permeasa, A = t1ogalactósido transacetilasa; pro A = requenmientos de
Prol1na (bloqueo antes del glutamato semialdehido); rec A = capacidad de recomb1·
Ilación genética y reparación de danos por rad1ac1ones; thr "' requerimiento de treo·
l"llna; trp = requerimiento de tnptófano (vuelto a d1bu¡ar, segun BACHMANN, B.J .; Low.
Ka .. TROTTER, A.L.: Bactenol. Aev 40 (1976) 116). La nueva versión (8' ) del mapa
Genético en B.J. 8ACHMANN : Microbio!. Aev. 54 [1990) 130-197
526 15. Genética bacteriana
del tiempo de una mezcla de este tipo. Una agitación intensa permite
separar violentamente a los dos conjugantes; se interrumpe el aparea-
miento. A continuación se sembraron las muestras sobre placas de agar
y se aislaron los recombinantes. Después se comprobó en las cepas
recombinantes cuáles eran los genes de la célula dadora que habían lle-
gado a la aceptora. El análisis dio como resultado que cada gen era
transferido a la célula receptora al cabo de un tiempo muy bien deter-
minado a partir del inicio del apareamiento (Fig. 15.18). La sucesión
temporal de la transferencia de genes coincidía totalmente con la suce-
sión de los genes en el cromosoma bacteriano, tal como se había deter-
minado por análisis genéticos. Cepas Hfr aisladas independientemente a
partir de la misma cepa f + se diferencian en dos características básicas.
Cada cepa Hfr transfiere el cromosoma con un inicio (punto de partida)
distinto al del otro, y con una orientación específica de los genes en la
célula aceptora. Esto significa que una cepa Hfr determinada está com-
puesta por una población homogénea, en la que todas las células trans-
fieren el cromosoma a partir del mismo punto de inicio y en el mismo
sentido.
En la transferencia del DNA, el DNA bacteriano se replica a partir del
punto de inserción del factor F, y la cadena de nueva síntesis se introdu-
ce con el extremo 5' por delante en la célula receptora (Fig. 15.18). En
este proceso de transferencia Ja recombinación de los DNA del dador
y del receptor tienen lugar en la célula receptora (es la recombinación
homóloga).
Mapa genético. Según el método anteriormente indicado del apareamien-
to interrumpido, en el que se determina la transferencia de los genes del
dador al aceptor a lo largo del tiempo, puede establecerse un mapa de la
ordenación de los genes en el cromosoma bacteriano (Fig. 15.19). La
transferencia de todo el cromosoma de Escherichia coli a 37°C dura apro-
ximadamente 100 minutos.
La velocidad de la transferencia es constante durante todo el proceso. Por
tanto, el tiempo de penetración de los genes en la célula aceptora es una
medida de la distancia entre los genes. Diferencias de menos de un minu-
to no pueden determinarse en este proceso cinético. Un mapado más pre-
ciso puede realizarse mediante análisis de acoplamiento por transduccio-
nes fágicas.
El mapa genético de la figura 15.19 de E. coli está muy simplificad?·
Actualmente se conoce la localización de más de 1400 genes. La suces1on
de los genes en el cromosoma bacteriano se ha establecido para Sa/mo-
11e!la typhimurium, Streptomyces coelicolor, Bacil/us subtilis, Pseudo-
monas aeruginosa y otras bacterias.
15.3 Plásmidos 527
15.3 Plásmidos
Muchas bacterias pueden tener elementos de DNA extracromosómicos.
Se denomina plásmido a esta doble cadena de DNA circular y cerrada,
pequeña en comparación con el cromosoma bacteriano. Son prescindibles
en las condiciones normales de crecimiento de las bacterias; células "cura-
das" del plásmido por tratamientos con radiaciones UV, mitomicina C o
colorantes de acridina, crecen bien sobre los medios de cultivo habituales.
los plásmidos se reconocen por las características especiales que confie-
ren a la célula hospedadora. Algunos plásmidos confieren a la célula hos-
pedadora Ja capacidad de conjugarse con otras células como se ha expli-
cado en el ejemplo del factor F de E. coli (apartado 15.2). Así consiguen
528 15. Genétíca bacteriana
EcoAI
entre lo'> poros del gel depende del peso molecular y de la e-.tructura de la
molécula. Debido a <>u configuración comp~1cta. los plásmido'> pequeños
rmgran más rápidamente que el DNA lineal, mientras que lo.., plásmidos
grandes lo hacen má.., lentamente. Mediante patrones estándar de peso
molecular conocido apropiado'>, y a través de la velocidad de migración.
puede calcularse el tamaño de un plásmido determinado. El handco d1·t
DNA en el gel se puede vi.,uali1ar por tincion con bromuro de ct1d10 \
ob.,en ación de la íluore-.cenc1a emitida en la lu1 ultravioleta. Una técnKa
má., compleja para la dcmo-.tración de plá..,rmdos es la de la micro-.cop1a
electrónica. pero que por otra parte permite medir la longitud de molécu-
las ah.ladas, y con ello una determinación muy precisa del tamaño.
Plásmidos conjugativos. En el capítulo anterior hemos presentado ya el
factor de fertilidad (F) de E. coli. Es un modelo de plásmido autotrans-
mi.,ible o plásmido conjugativo. Todos los plásmidos conjugati\os
conocidos hasta ahora lh'>ponen de funcione-. de transferencra, lo'> 1 a-
mado., genes Ira, que permiten la transmi.,rbilidad de los plásm1dos c1 n-
jugativos por contacto celular. Los gene-. Ira codifican para la forma-
ción de pili sexuale., que sirven para el establecimiento del contacto
entre las células conjugantes. Además, codifican para proteínas necesa-
ria:-. en la estabilización de la pareja de células aparcadas, la transferen-
dador
helicasa 1
Fig. 15.21 Modelo de transferencia del DNA del dador al receptor durante la
conjugación. Tras la rotura de una cadena en el onT se transporta la cadena sen·
cilla con el extremo 5' por delante a través de un poro que une al dador y al receP-
tor. En el dador la doble cadena se desovilla por acción de la helicasa J y se com-
pleta como doble cadena por síntesis continua. En el receptor se da una síntesis dis·
continua (según W. ScHUMANN, 1990).
15.3 Plásmidos 531
1
1
! .:
&cMrichia coli AY 13 Eco Al 5' • G - A - A ~ T - T - C - 3'
1.
3' C • T - Tl A - A - G • 5'
: t
1
1
Hllal 5'- G • é 1G
.
i !
C - 3'
3· • c -G f c - G • 5'
~ '
1
basa en el organismo productor. a partir del cual se ha aislado (de ahí que
se escriban en cur<,iva).
Mapas de r estricción. La-, moléculas de DNA cortadas en fragmentos de
tamaños diver'º' con las endonucleasas de restricción pueden separar...e
fácilmente mediante una electroforesis en geles de agarosa. tal como <.e
ha descrito en el apartado 15.3 (véa.,e Fig. 15.22). La velocidad de migra.
ción de los fragmentos de DNA depende de su longitud: cuanto más
pequeño sea el fragmento. má<.. rápidamente migrará a través del gel: los
fragmentos grandes penetran lentamente en el gel. El tamaño de los frar
mentos de DNA puede determinarse por comparación con bandas d
fragmentos de DNA de tamaño conocido. La ordenación de los puntos d..
corte de los cn11mas puede establecen.e por digestiones sucesivas dt:I
DNA y colocación de los extremos de los fragmentos superpuestos. Par
poder obtener estos mapas de restricción únicamente resultan adecuadas
aquellas e11do1111clea.ws que cortan en pocos puntos de la cadena y dan
fragmentos relativamente grandes. Los enzimas de restricción que per
miten cortar moléculas grandes de DNA en pequeños fragmentos estan
ganando importancia en la determinación de las secuencias de nucleóti·
dos (véase apartado 15.5).
A B EcoAI
& carnl 2 3 4 5 6
"
o
l
pSUP 202 35
(8 kb)
t
dJTP ddlTP :;JTP dddTP
• • • •
tas cadenas sontehzadas se separan
electrolorebcamente en un gel de
pohacnlamoda y las bandas se VlSual12an
mediante deposición sobre una
película de rayos X.
-
-- T
-- - ~ ~ T
A
o
-- e1
- - ~i
- -- ~1
- - - ~I A ..
A 1
-
- e
- - o
e Fig. 15.23 Secuenciación del ONA
o-
fragmentos
ONA exógeno
l lllll li ill l !l iii!llliii i il ~
t" t ~ ~
rotura por
endonuc/easa ~
de restricción
;_;__;_;__..;..;...____ uníón de extremos
complementarios
{Oi~J[O~i ]--[O O
clon de células hi¡as
oºo] -trans---torma"-ción [O
célula receptora
l
Fig. 15.24 Representación simplificada del método de obtención de un DNA
híbrido o "DNA-quimera" por inserción de un fragmento de DNA eucariótico en
un plásmido bacteriano. El DNA exógeno y el plásmido se rompen in vitro median-
te la misma endonuc/easa de restricción. Así se forman fragmentos con extremos
cohesivos (cadenas sencillas sobresalientes con bases complementarias). Por mez-
cla de las dos moléculas de DNA y tratamiento con ligasa se forman plásmidos con
DNA eucariótico insertado. Estos DNA-quime ra pueden introducirse en bacterias por
transformación. Se multiplican por cultivos en masa de la bacteria. De este clon
puede obtenerse DNA exógeno.
nie ría genética q ue poseen una fu nc ión de replicación (p. ej. de l plás-
mido p BR322), genes de resistencia a a ntibióticos (p. ej. el gen de resis-
te nc ia a la tetraciclina) y los extremos cohesivos del fago lambda (el lla-
mado sitio cos, "cos sile"). Estos últimos son el p unto de reconoci-
miento para el e m paquetamiento del extracto de lambda. Sus activida-
des en.limáticas cortan de una cadena larga de copias de DNA, los lla-
mados concatémeros, fragmentos de 45 kb de tamaño ílanqueados por
puntos cos, y los empaquetan en cabezas fágicas vacías; de este modo
se favorece selectivamente la clonación de fragmentos grandes de ONA
(Fig. 15.25).
A ••·::::::::::::::::·. B e
' , .. ' Tet
• ' fago'- • •
: : 48,502 kb : :
cos~
4,362 kb
[ on / /
cerrado
D -::;:::::: ~
DNA exógeno
- digestión parcial
por endonucteasa
DNA exógeno parcíalmente cortado
.;:::::::::::::
ligación ! ==:::=:::::
º~(&_:-
cos
::" éc~oQ
[(ü
.infe;~;ide ~¿,J¡?} ~c:~~~~~:n
selección de
~
los clones Ter
/('
empaqueta·
míento de '-
o
Fig. 15.25 Cósmidos como vectores de clonación. A Los puntos cos (cohesive
siles) son los extremos monocatenarios, complementarios, del cromosoma de lamb-
da. B Como plásmido de clonación sirve pBR322, que lleva genes de resistencia
frente a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet). C El cósmido derivado de pBR322 tiene
integradas las zonas cos. O Para la clonación se corta y liga el DNA exógeno y el
cósmido. Mediante una incubación con el extracto de empaquetamiento de A. única·
mente se cortarán en las zonas cos aquellos cósmidos híbridos que contengan un
fragmento grande de DNA exógeno, entre 35 y 45 kb. Éstos se empaquetarán en
cabezas de fago. Con el fago se infecta a E. coli y se seleccionan los clones Tet'.
Más explicaciones en el texto.
rios para los trabajos de ingeniería genética (que en Alemania tienen que
estar registrados) como el empleo de cepas de especial seguridad, que no
puedan sobrevivir en los hábitats naturales. Además, todos los microorga-
nismos que llevan DNA recombinante hay que matarlos antes de su eli-
minación, para impedir su diseminación. La liberación de microorganis-
mos manipulados genéticamente a los ambientes naturales requiere de un
permiso especial.
Para manipular organismos patógenos existen desde hace tiempo medidas
muy estrictas de seguridad. Después de 20 años de experiencia con expe-
rimentos de ingeniería genética puede aftnnarsc que Jos portadores de áci-
dos nucleicos rccombinantes in vitro no tienen un potencial de riesgo
mayor que las características de los organismos receptores, del vector de
clonación y del DNA del dador. Desde junio de 1990 se ha completado en
Alemania el autocontrol voluntario en el trabajo con nuevas combinacio-
nes de DNA mediante la ley de "Regulación de la Ingeniería Genética".