Modulación Genómica Inducida:

Salud y Enfermedades
Santiago Barbarelli
Universidad de Buenos Aires, Fac. de ing.
santiagobarbarelli@gmail.com

Resumen: No solo los genes influyen en la genética de un organismo, existen marcas químicas (marcas
epigenéticas) que sin alterar el genoma regulan su expresión. Estas marcas pueden ser temporales o de
largo plazo y juegan un papel fundamental en una gran variedad de procesos fisiológicos y patológicos. Se
cree que hay una relación entre el estilo de vida actual y la proliferación de enfermedades. La polución del
aire, el uso de ciertos plásticos en contenedores de alimentos, también tienen efectos epigenéticos
perjudiciales para la salud. En consecuencia a esto se busca como prevenir y tratar patologías con el mismo
enfoque epigenético. Dietas bajas en grasas y actividad física contribuyen a un estado físico saludable.

Introducción: contenido de lisina y arginina (Fig. 1).

Hoy en día hay un interés creciente en los procesos
epigenéticos debido a que se demostró que están
involucrados en la patogenia de enfermedades
autoinmunes y de distintos tipos de cáncer.
Dado esto, se buscan formas preventivas y
tratamientos siguiendo este enfoque. En esta revisión
se repasarán trabajos en los que se investigó la relación
de procesos de modulación genómica con
enfermedades y factores (ambientales, nutricionales,
etc..) beneficiosos o perjudiciales para nuestra salud.
El proceso de regulación de la expresión genética es
dinámico y depende de muchos factores, por ejemplo
de la organización de la cromatina, de la posición del
gen dentro del núcleo, y también de otros factores
temporales como puede ser la disponibilidad de
componentes de la maquinaria de transcripción en
sitios específicos del genoma, que además imponen un Figura 1: Nucleosoma compuesto por ocho histonas
carácter estocástico. (H2A, H2B, H3, H4, dos de cada una) enrolladas por
Los cambios epigenéticos tienen que ver con 147 pares de bases y H1 por fuera cerrando el
metilación en el ADN o modificaciones químicas en la conjunto.
cromatina. Lo que implica en el genoma patrones de
expresión o silenciamiento a largo plazo sin alterarse
la secuencia de nucleótidos del ADN.1 Metilación de ADN
La epigenética explica, entre otras cosas, por qué en un La metilación en el ADN ocurre cuando a la base
organismo complejo con un único genoma hay citosina, en su carbono 5, se le une de manera
diferentes tipos de células y la mayoría expresa solo un covalente un grupo metilo (-CH3), convirtiéndose en 5-
subconjunto de genes. Esto tiene que ver con la metilcitosina.
compactación de la cromatina, mediante el mecanismo Tiene la capacidad de alterar la estructura de cromatina
de la metilación por ejemplo, que hace que cierto y actividad transcripcional del genoma, dependiendo
sector del genoma sea inaccesible para la maquinaria de la ubicación y el contexto de la secuencia del
transcripción evitando la expresión de los genes metilado base.
situados en dicha zona. Cuando esto ocurre en regiones promotoras, impide la
Las unidades básicas de la cromatina son los unión de la maquinaria de transcripción silenciando de
nucleosomas, que en los seres humanos consisten en manera estable los genes, al menos durante el
cadenas de 147 pares de bases envueltas alrededor de desarrollo del organismo en cuestión.
ocho histonas (H2A, H2B, H3 y H4, dos de cada una) Este proceso desempeña un papel importante en la
y un último tipo de histona (H1) por fuera. definición de los tipos de células y se ve alterado en
Las histonas son proteinas de soporte y tienen un alto muchas enfermedades. En celulas humanas este
marcador se a encontrado ampliamente distribuido, y
contrariamente a lo esperado, se revelaron cuerpos
genéticos hipermetilados de genes activamente
transcriptos. En regiones de potenciadores (enhacers),
actuando diferencialmente, cumple un papel como
regulador de transcripción 6.
Se han encontrado familias de enzimas que pueden
metilar el ADN; estas enzimas son denominadas DNA
metiltransferasas (DNMT) y se clasifican según sea su
preferencia por un sustrato y la función resultante.
Estas transfieren un grupo metilo desde S-
adenosilmetionina (SAM) al carbono cinco del anillo
de pirimidina de la citosina. De los cinco miembros de
este conjunto, DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b
y DNMT3L, sólo DNMT1, DNMT3a y DNMT3b
participan en la metilación de ADN.
DNMT1 es la metiltransferasa de mantenimiento,
copia patrones de metilación preexistentes en cadenas
de ADN nuevas durante la replicación.
DNMT3a, DNMT3b son metiltransferasas de novo,
responsables principalmente de agregar grupos metilos
a citosinas en regiones CpG (regiones con gran
concentración de pares citosina-guanina enlazados por
fosfatos) que no habían sido metiladas con anterioridad
y es posible que también tengan actividad demetilasa
de ADN.
Comprender el papel de la metilación del ADN en el
desarrollo del organismo y la enfermedad requiere
conocer la distribución de estas modificaciones en el
genoma.
Además existe otro tipo de enzima , TET (Ten-eleven
translocation methylcytosine dioxygenase), que
reconocen citosinas anteriormente metiladas y las
oxidan; esto provoca el cambio de 5-metilcitosina a 5-
hidroxmetilcitosina.
Metilación dinámica, metilación diferencial
Las regiones diferencialmente metiladas (DMRs) son
regiones genómicas con diferentes estados de
metilación en diferentes muestras. Estas pueden ser
muestras de tejidos (TSDMR), células, diferentes
individuos, u otros.
En estudios con distintos tejidos de ratones se estimó
que las TSDMR abarcan al menos el 6,7% del genoma
y generalmente son regiones cortas hipometiladas que
se localizan en zonas distales.
Además se encontró una clase de TSDMR
hipometilada (en zona potenciadora) inactiva en tejido
adulto, pero activa durante su desarrollo; esto sugiere
que la hipometilación no es suficiente para la actividad
potenciadora.
Dado que durante el desarrollo del organismo cada
metiloma se deriva de otro, y como cada metiloma se
copia fielmente durante el proceso de división celular
(por metilación de mantenimiento), este podría estar
reflejando las decisiones de desarrollo tomadas durante
la diferenciación celular 6.
Modificaciones en las histonas
Estas histonas tienen un dominio carboxilo terminal
(C-terminal ) y una cola aminoterminal (N-terminal),
se ha encontrado una variedad importante de
modificaciones en estas colas, por ejemplo metilación,
acetilación, ubiquitación, sumoilación y fosforilación 4.
Pueden actuar en combinación ejerciendo control en el
acceso de la maquinaria de transcripción a la zona.
Estos mecanismos modifican el estado de
compactación dela cromatina; una cromatina cerrada
implica silenciamiento (región heterocromática)
mientras que una relajada (región eucromática) implica
expresividad.
También en estos casos hay involucradas enzimas.
Lisinas hiperacetiladas causan regiones eucromáticas,
mientras que hipoacetilación causa regiones
heterocromáticas. El efecto de la metilación depende
de cuales sean los residuos proteicos metilados.
Silenciamiento mediado por ARN no codificante
Es una forma de regulación post-transcripcional.
Los microARN son secuaencias cortas de nucleótidos
que no codifican proteínas, pero que son
complementarias a ADN o ARN codificante. Cuando
se unen a secuencias complementarias impiden que
estas puedan ser traducidas a proteínas, se dice
entonces que ejercen una regulación inhibidora de la
expresión génica 9.
Las modificaciones epigenéticas son reversibles, y se
cree que sus efectos son heredables 1.
Además se vio que dependen de factores ambientales
internos o externos.
Un ejemplo de modificación por un factor externo es la
disminución en la metilación del ADN debido a la
exposición a las partículas provenientes de gases de
combustión 3. Aunque los efectos en la salud no fueron
determinados.
Actualmente se registra un aumento considerable en
casos con enfermedades no transmisibles como la
obesidad, la diabetes y el cáncer, clasificándolas como
epidemias 7 . Estudios realizados muestran que estas
patologías tienen un rasgo epigenético y se buscan
formas preventivas y tratamientos que actúen en los
marcadores sin alterar genes.
Desarrollo: Nuevos enfoques nutricionales
Nutrigenómica
Los nutrientes y los componentes bioactivos de los
alimentos pueden influir en los fenómenos
epigenéticos, ya sea inhibiendo directamente las
enzimas que catalizan la metilación del ADN o las
modificaciones de las histonas, o alterando la
disponibilidad de los sustratos necesarios para esas
reacciones enzimáticas.
Un ejemplo de esto es la diferenciación fenotípica de
abejas reinas y abejas trabajadoras mediante la dieta.
En su etapa de larva las futuras reinas se alimentan de
jalea real, esto cambia los patrones de metilación del
ADN que hace que el genoma se despliegue de forma
diferente (splicing alternativo) 2.
La nutrigenética analiza la interacción entre nuestro
comportamiento dietético y cómo interactúa con
nuestro genoma en términos de genes reguladores que
son importantes en el control del metabolismo.
Distintas patologías están relacionadas con nuestro
estilo de vida sedentario, nuestra dieta basada en
alimentos procesados y la exposición a agentes
contaminantes.
Un ejemplo de esto es el uso de plásticos y pesticidas
con compuestos químicos estrogénicos, disruptores
endócrinos (sustancias que modifican el equilibrio de
las hormonas en el organismo).
Distintos plásticos contienen bisfenol A como el
policarbonato, PVC y resinas epoxi entre otros. El
policarbonato, entre muchas aplicaciones, se suele
aplicar en la fabricación de mamaderas y las resinas
epoxi para recubrimientos internos de embaces para
contención de alimentos; en estos destinos es donde
hay mayores riesgos para la salud. Además, en el uso,
cuando se calienta la mamadera el policarbonato se
degrada y desprende moléculas.
Es capas de producir efectos similares a los de las
hormonas; el bisfenol A se adhiere a receptores de
estrógenos activando genes que deberían permanecer
inactivos. Por ejemplo puede causar cambios en el
crecimiento de las glándulas mamarias, además se
sospecha que puede acelerar el paso a la pubertad en
niñas17.
La ingesta de fructosa, antes considerada como un
endulzante saludable, contribuye la obesidad y a
trastornos metabólicos 8.
La fructosa actúa como un inductor de variabilidad
genómica y epigenómica con la capacidad de
reorganizar redes de genes críticas para la regulación
metabólica central (en el hipotálamo) y los procesos
neuronales en el cerebro (en el hipocampo). Esto fue
mediante factores de transcripción, factores de
empalme y modificaciones epigenéticas.
Los cambios epigenómicos fueron modificaciones a
gran escala en los patrones de metilación de ADN,
expresión genética diferencial y alteraciones de
microARN.
Por el contrario el ácido graso omega-3 DHA revierte
el efecto y normaliza los procesos mediante los
mismos factores 5.
Otro efecto positivo con posibles orígenes epigenéticos
lo causa la dieta mediterránea. Se encontró una
interacción gen-dieta entre los genes FTO-rs9939609,
MC4R-rs17782313 (asociados con el riesgo de
obesidad) y la dieta mediterránea; cuando los
portadores de estos alelos tenían una adherencia baja a
esta dieta el riego de diabetes tipo 2 (DT2) era mayor,
cuando la adherencia era alta esta asociación
desapareció 10. Concluyendo en que esta dieta
contrarresta la predisposición genética.
Dado que se descubrieron cambios en la metilación del
ADN que podrían ser causa de DT2 11 , y que la
expresión de los genes FTO y MC4R es regulada por
metilación de ADN (entre otros factores) 12, entonces
esta dieta podría también regularlos mediante
mecanismos epigenéticos.
En otro trabajo se estudió el efecto la dieta alta en
grasas en el gen MC4R en ratones obesos y ratones
magros. Con una dieta estándar no hubo diferencias en
los estados de metilación del gen entre ambas cepas, y
con la dieta alta en grasas la metilación de los sitios
CpG cerca del inicio de transcripción disminuyó en los
dos casos. Sin embargo la expresión del gen aumentó
solo en los endogámicos, esto dice que otros factores
reguladores, dependientes de la cepa, estarían
regulando su expresión 12.
Entonces para guiar a la medicina personalizada es
necesario conocer el perfil genético de un individuo,
dado que este puede ser tal que su dieta afecte los
mecanismos biológicos, que a su vez, influye en su
riesgo de desarrollar ciertas enfermedades. Basándose
en esto se pueden ajustar los patrones dietéticos de la
mejor manera.
También hay estudios, con ratones de modelo para
obesidad juvenil, sobre el efecto del ejercicio físico en
distintas etapas de desarrollo (niñez y edad adulta
temprana) y con dos tipos de dietas diferentes
(estándar y alta en grasas). En todos los casos los
ratones con actividad física (etapa temprana y etapa
adulta) obtuvieron mas peso corporal y menos masa de
grasa que los ratones sin ejercicio; además
independientemente de la edad de inicio en actividades
físicas hubo una reducción de triglicéridos y de niveles
de insulina 13.
Además se vio que el ejercicio de baja intensidad
aumenta la expresión de proteínas del músculo
esquelético. En pacientes con diabetes tipo 2 trae
beneficios por dos vías: primero aumenta la acción de
la insulina y segundo por aumento en la expresión de
proteínas (UCP3 y PPARδ) implicadas en la función
mitocondrial y en el metabolismo lipídico, mostrando
mejorías en estudios clínicos 14.
Por otro lado el ejercicio físico agudo, por medio de la
contracción muscular, remodela los patrones de
metilación del ADN de ciertos genes relacionados con
el metabolismo energético (PGC-1α, PDK4 y PPAR-δ
) hipometilando sus regiones promotoras. Al aumentar
la expresión de estos genes aumenta en cantidad la
maquinaria de transformación energética que
descompone grasa y azúcar obteniendo energía.
Genes metilados diferencialmente en la diabetes del
tipo 2 (PGC-1α, TFAM, PPAR-δ, PDK4, citrato sintasa
[CS]) aumentaron sus transcritos después del ejercicio.
Aunque los cambios fueron transitorios se sugiere que
una actividad regular podría hacerlos duraderos 15.
Epigenética en el cáncer
El epigenoma canceroso se caracteriza por
hipermetilación de ADN específica del promotor de
genes supresores de tumores, hipometilación global del
ADN (Genes específicos de tejidos, oncogenes,
regiones repetitivas entre otros) y alteración del estado
de metilación y acetilación de histonas
que pueden conducir a inestabilidad cromosómica,
silenciamiento génico aberrante y expresión anormal
de microARN global que promueve la activación de
oncogenes y silenciamiento de genes supresores de
tumores. Como que las alteraciones epigenéticas están
implicadas en casi todos los pasos de la tumorogénesis,
el epigenoma del cáncer se considera como un objetivo
de prevención y terapia.
La terapia epigenética dirigida al cáncer se basa en el
uso de fármacos epigenéticos que se han desarrollado
para la inhibición específica de epi-enzimas, por
ejemplo, inhibidores de la ADN metiltransferasa
(DNMTi) e inhibidores de la histona deacetilasa
(HDACi).
Se vio una acción citostática (inhibir el crecimiento
desordenado de células) en pruebas con dosis bajas de
sulforafano (SFN) contra células de cáncer de mama
fenotípicamente distintas MCF-7 (ER+ , PR+/-, HER2-),
MDA-MB -231 (ER-, PR-, HER2-) y SK-BR-3 (ER-,
PR-, HER2+). Además se encontró que la detención
del ciclo celular y senescencia inducida por el
tratamiento, el estrés nitro-oxidativo y la
genotoxicidad se acompañaban de hipometilación
global del ADN , niveles disminuidos de DNMT1 y
DNMT3B (enzimas metiltransferasas de
mantenimiento y de novo respectivamente), reservas
disminuidas de m6A (una metilación de ARN) y
cambios en el perfil de microARN 16.
También hubo una disminución de la señalización de
AKT que pueden contribuir a la acción citostática.
Métodos
Actualmente en el análisis de los patrones de
metilación del genoma se usan diferentes técnicas;
cada método tiene características únicas que ponen en
duda cual es el método óptimo para cada interrogante
biológica en particular. Se están produciendo mapas
de metilación del ADN, y su integración forma una
base para proyectos emergentes de epigenoma
internacional. Por lo tanto, es fundamental determinar
la precisión de cada método y si conviene alguno en
particular.
Los principales métodos que utilizan la conversión de
bisulfito son MethylC-seq y RRBS ( reducción de la
secuencia de bisulfito de representación) y los que
utilizan el enriquecimiento de ADN metilado MeDIP-
seq (secuenciación de inmunoprecipitación de ADN
metilado) y MBD-seq (secuenciación de dominios
vinculantes).
También se usa una metodología que combina MeDIP-
seq para detectar CpGs metilados, con MRE-seq
(secuenciación de enzimas de restricción sensibles a la
metilación) para detectar CpGs no metilados. A
diferencia de los métodos de enriquecimiento solo, el
método combinado puede identificar con precisión las
regiones de metilación intermedia que, junto con el
perfil de SNP (polimorfismos de nucleótidos
singulares, son las variaciones genéticas mas
frecuentes, sustituciones de bases individuales que se
dan con una frecuencia mayor a 1% en una población)
partiendo de los datos de secuenciación, permite la
identificación de estados epigenéticos específicos de
alelo en todo el genoma.
MethylC-seq permite la identificación en todo el
genoma de los estados de metilación del ADN citosina
en la resolución de una sola base. Implica la
secuenciación de ADN tratado con bisulfito de sodio.
Este método consiste en extraer el ADN a secuenciar y
fragmentarlo con el fin de facilitar la posterior
desnaturalización por calor, y obtener así dos hebras.
Posteriormente se incuba la muestra en presencia de
bisulfito, este actúa desaminando las citosinas del
ADN convirtiendolas uracilo pero es incapaz de actuar
sobre las citosinas que se encuentren metiladas. Una
vez realizada la incubación se realiza una
amplificación de la región que se quiere mapear por
PCR y se secuencia de forma normal. Para el mapeo de
las metilaciones, se compara la secuencia obtenida con
la de una secuencia control que no ha sido sometida a
la acción del bisulfito; aquellas citosinas que
estuviesen metiladas aparecerán tras la PCR y la
secuenciación como citosinas, mientras que en la
muestra tratada donde el bisulfito las transformó en un
uracilo, finalmente serán observadas como una timina
(Fig. 2).
Figura 2: Método de secuenciacion por bisulfito.
Las limitaciones de este proceso son las siguientes:
Discrimina solamente a citosinas metiladas (5-
metilcitosinas) pero no a las citosinas hidroximetiladas
(5-hidroximetilcitosinas).
Se dan falsos positivos cuando citosinas no metiladas
no se convierten a uracilo, esto pasa cuando en el
proceso de desnaturalización no se separan las hebras
en cadenas simples.
El bisulfito de sodio degrada el ADN, esto es
proporcional al tiempo de incubación y a la
concentración de bisulfito; además de dañarlo corta las
cadenas dificultando la creación de iniciadores para
una posterior replicación.
Para realizar estudios sobre todo el genoma de una
manera más eficiente y menos costosa se usa la
metodología RRBS cuyos pasos son los siguientes:
Reducción de la porción del genoma analizada a través
de una digestión con la enzima de restricción MspI
consiguiendo fragmentos con CpG en cada expremo
(Fig. 3).
Reparación final para completar el terminal 3' de los
extremos de las hebras y se adición una adenosina (A-
Tailing).
Ligación de oligonucleótidos adaptadores de secuencia
metilada a los tramos de ADN, estos tienen todas las
citosinas reemplazadas por 5-metilcitosina para
conservarlas durante el proceso de conversión.
Selección del tamaño de los fragmentos (por
electroforesis en gel) para ser purificados con gel de
excisión.
Conversión por bisulfito, seguido de amplificación por
PCR.
Purificación de PCR.
Secuenciación; puede ser de Senger, o enfoques mas
modernos como el de illumina.
Alineación y análisis de secuencia; se realiza con un
software especializado
De esta manera se enriquece el área del genoma con
alto contenido de zonas CpG y se reduce la cantidad de
nucleótidos necesarios para secuenciar al 1% de
genoma. Reduciendo costos.
Figura 3: Sítios de corte de la enzima
MspI, corta ADN metilado y no metilado.
Los métodos basados en la conversión por bisulfito
tienen la ventaja de una resolución a nivel del
nucleido, pero la conversión de citosina no metilada en
uracilo puede ser inestable además de la dificultad del
uso en micromatrices de ADN para detectar sitios
convertidos.
En los siguientes métodos se pueden usan procesos de
detección de alto rendimiento.
En MeDIP-seq y MBD-seq se aplica el
enriquecimiento de regiones metiladas seguido de
secuenciación. MeDIP-seq usa un anticuerpo anti-
metilcitosina para inmunoprecipitar fragmentos de
ADN monocatenarios metilados. MBD-seq utiliza el
dominio de unión metil-CpG de la proteína MBD2
para enriquecer fragmentos de ADN de doble cadena
metilados.
Los pasos de MeDIP son los siguientes:
Extracción y purificación.
Sonicación (aplicación de ultrasonido), este proceso
corta el ADN en fragmentos cortos (entre 300 y 1000
pb), es rápido simple y evita el sesgo dado con
enzimas de restricción.
Desnaturalización (separación de las hebras de ADN).
Aplicación del anticuerpo anti-metilcitocina.
Inmuniprecipitación.
Secuencición.
Análisis.
La desventaja de esto en contraste con la secueciación
de bisulfito es que la resolución (depende del tamaño
de los fragmentos de ADN) es baja. Sin embargo se
estima que para la mayoría de las aplicaciones puede
es suficiente.
Las modificaciones epigenéticas en las histonas se
detectan principalmente por anticuerpos específicos de
modificación (que reconocen proteínas específicas) en
inmunoprecipitaciones de cromatina (chIP) junto con
tecnologías de matriz de genes.
Se realiza entrecruzamiento con formaldehído del
ADN a las proteínas unidas a este en células para que
se fijen las interacciones proteína-proteína y las
interacciones proteína-ADN seguido de la
inmunoprecipitación de los complejos proteína-ADN
con anticuerpos específicos a partir de extractos
sonicados para fragmentar la cromatina. Las
secuencias específicas de ADN inmunoprecipitadas
son entonces amplificadas por PCR para luego ser
analizada en chips de ADN.
Conclusiones:
Los mecanismos que controlan la expresividad de los
genes son tan importantes como los genes mismos, no
nos define únicamente nuestro genoma, este no es
independientemente del entorno nutricional asi como
tampoco de otros factores.
Los procesos de modulación son complejos, actúan
tanto en el ADN como en las histonas, presentan
patrones, son dinámicos, actúan diferencialmente en el
organismo definiendo distintas células y distintos
tejidos, y dependen de muchos y variados factores. especificando células madre), salud, envejecimiento y
Que factores como la mala alimentación, el en progresión de enfermedades. Para esto se necesitan
sedentarismo y agentes químicos hagan uso de ellos mejorar y abaratar los métodos adquisición y análisis
modulando el genoma, y que en distintas patologías de secuencias de ADN, patrones de metilación de
(como la diabetes, transtornos metabólicos y cáncer) ADN, y de modificaciones en las histonas.
hayan desbalances en la expresión genómica sumado a Con esto se podrán desarrollar mapas epigenéticos que
que parece haber una correlación entre estilo de vida llevarán a un mayor entendimiento y a mejores
actual y la proliferación de estas enfermedades; sugiere terapias preventivas y curativas. Además se podría
que estos factores del entorno, junto con lograr una detección temprana de enfermedades y, ya
predisposición genética sean los causantes de estas que el estado de las marcas epigenéticas es reversible,
epidemias. intervenir directamente en ellas.
Es necesario estudiar en profundidad estos procesos y
tomar acciones en salud publica para bajar esta
tendencia epidemiológica.
Una buena recomendación como acción preventiva es
realizar actividad física regularmente y comer
saludablemente.
Para lograr una mayor comprensión del
funcionamiento biológico es necesario poder contrastar
el estado epigenético del organismo con los múltiples
factores que lo alteran, tanto en el desarrollo (p.ej.

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