Enzimas desintoxicantes de mercurio dentro de las endosporas de un Bacillus pasteurii

resistente al mercurio de amplio espectro cepa DR2

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Universidad, 35 Ballygunge
Circular Road. Calcuta 700 019, India
EM recibido el 25 de febrero de 1994; revisado el 19 de septiembre de 1994.

Abstracto. Bacillus pasteurii DR2, una cepa bacteriana resistente a Hg de amplio espectro,
expuesta a esporulación retardada y menos volatilización de mercurio en presencia de
compuestos de mercurio.
Sin embargo, Bacillus subtilis sensible a Hg esporuló rápidamente en presencia de HgCl2
y volatilizado sin mercurio. Niveles de Hg2 + -reductasa y organomercurial liasa en las
endosporas de Bacillus pasteurii DR2 fueron más bajos que los de las células vegetativas.

1.Introducción
Varios cientos de millones de toneladas de compuestos de mercurio, lanzados anualmente
en el se cree que la biosfera (Summers y Silver 1978) está destoxificada por
microorganismos.
La desintoxicación tiene lugar a través de la acción secuencial de dos plásmidos
codificados enzimas inducibles, organomercurial liasa y Hg (ic) reductasa. La primera
enzima rompe el enlace covalente carbono-mercurio para liberar Hg2 + que se reducela
segunda enzima para Hg (o) (Summers y Silver 1978). Ambas enzimas requieren
Los compuestos sulfhidrilo y FAD estimulan sus actividades (Schottel 1978; Pahan et al
1990a). Recientemente, la presencia de cisteínas en el extremo C-terminal de Tn 501 Hg
(ic) reductase ha sido reportado (Moore et al 1992). Aunque la mayoría de los estudios
Se han hecho en bacterias gram-negativas las enzimas desintoxicantes de mercurio tienen
también se ha informado en varias cepas bacterianas grampositivas, incluido Bacilli
(Moore et al 1989; Wang et al 1989; Pahan y otros 1991; Schiering y otros 1991). Pero
muy poco se sabe sobre el estado de las enzimas desintoxicantes de mercurio en las
endosporas de cepas bacterianas resistentes a Hg.
En el presente estudio informamos la presencia de Hg (ic) reductasa y organomercurial
liasa dentro de la spores de una cepa bacteriana resistente a Hg de amplio espectro Bacillu
pasteurii DR2.

2. Materiales y métodos
Resistencia al mercurio de amplio espectro B. pasteurii DR2, (Pahan et al 1990a, b) y
el Bacillus subtilis GS1 sensible al mercurio, (Pahan et al 1991a) fueron aislados y *Autor
correspondiente. Identificado en nuestro laboratorio Todos los productos químicos y
reactivos utilizados fueron analíticos grado (E Merck, Alemania). NADPH (sal
tetrasódica) y compuestos de mercurio se compraron en Sigma Chemicals Co., Mo, EE.
UU. Cloruro de metilmercurio (MMC) se obtuvo de Wako Chemicals, Japón y metoxietil
mercúrico cloruro (MEMC) fue comprado localmente como un pesticida a base de
mercurio, Emisan-6 que contiene 6% (p / p) de mercurio (Excel Industries Limited,
Bombay).

2.1 Esporulación: determinación numérica de la proporción de esporas y células viables

Las cepas bacterianas se cultivaron en medios de cultivo de nutrientes y las células se
cosecharon en fase logarítmica tardía por centrifugación a 6.000 g durante 10 minutos a
4 ° C. Las células cosechadas eran se lavó tres veces con tampón de fosfato de sodio 50
mM (pH 7 · 4) y se suspendió en el mismo buffer Las células suspendidas se transfirieron
al medio de esporulación al mismo
Se añadió densidad celular y HgCl2 para mantener una concentración de 20 μΜ. Un
matraz de control del medio de esporulación contenía células bacterianas pero no HgCl2.
Todos los frascos fueron incubados a 30 ° C en un agitador rotatorio (200 rpm).
El medio de esporulación contenía 0 · 1% de glucosa, 0 · 5% de KH2PO4, 0 · 5% de
extracto de levadura, 0 · 1% (NH4) 2HPO4, 0 · 02% de MgSO4 7H2O, 0 · 1% de NaCl,
0 · 5 mg% de CaCl2, 0 · 7% de MnSO4, 1 mg% de ZnSO. 7H2O y 1 mg% de
FeSO4· 7H2O a pH 7 · 0.
El recuento total viable se determinó mediante el método de la placa de agar de la porción
adecuada de cultivo extraído asépticamente y diluido en serie a diferentes horas de
esporulación.
El recuento de esporas se realizó calentando el mismo volumen de cultivo a 80 ° C durante
15 minutos y chapado en superficie de agar nutriente después de la dilución en serie. Un
promedio de seis por separado recuentos se da en la figura 1.

2.2 Determinación de la concentración de HgCl2 a diferentes horas de esporulación

Se extrajo un ml de cultivo de forma aséptica a diferentes horas de esporulación en
Matraces volumétricos de 50 ml y después de la digestión ácida se determinó el contenido
de mercurio siguiendo la técnica de absorción atómica sin llama (Bradenberg y Bader
1967; Ray
et al 1989).

2.3 Ensayo de enzimas desintoxicantes de mercurio en esporas y células viables

La cepa bacteriana B. pasteurii DR2 se indujo tres veces con 20 μΜ HgCl2
(Summers y Silver 1972) y se cosecharon en la última fase del crecimiento del registro.
Cosechado las células se lavaron en tampón de fosfato de sodio 50 mM. Una parte de las
células lavadas se suspendió en el mismo tampón (Pahan et al 1990a) y se transfirió a la
esporulación medio con o sin 20 μΜ HgCl2. Examen microscópico de contraste de fase
delas células bacterianas en el matraz de control sin HgCI2 mostraron que casi el 100%
de loscélulas bacterianas esporuladas después de 24 h pero en el matraz tratado con
HgCI2 el mismo número de células esporuladas después de 42 h.
Las esporas se cosecharon a 6.000 g durante 10 minutos y se lavaron tres veces con 50
mM
Tampón de fosfato de sodio (pH 7 · 4) y sometido a tratamiento con lisozima para su
eliminación de los esporangios. Para el tratamiento con lisozima, una suspensión de
esporas de 2 mg de seco las esporas / ml se prepararon en el mismo tampón de fosfato y
se añadieron 1, 5 mg de lisozima por ml A continuación, la suspensión de esporas tratada
con lisozima se incubó a 30 ° C durante 15 minutos. Finalmente, las esporas se
centrifugaron a 6.000 g durante 10 minutos para la recolección y luego se lavó tres veces
con tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7 · 4).
Las células cosechadas y lavadas y las esporas se rompieron por separado mecánicamente
conarena de mar en un mortero con mano de mortero a 4 ° C y suspendido en el mismo
tampón. Suspensión se centrifugó a 13,000 g durante 30 min a 4 ° C. El sobrenadante
obtenido fue entonces dializado durante la noche contra el mismo tampón. Los dializados
así preparados fueron utilizados como fuente de Hg2 + -reductasa y organomercurial liasa
(Pahan et al 1990a).

Enzimas desintoxicantes de mercurio dentro de las endosporas

Figura 1. Patrón de esporulación de (A) Bacillus Pasteurii dDR2, y (B) Subunidades de
Bacillus GS 1 con (•) y sin MgCl2 (O) S. Conde de esporas. V. conteos viables.

3. Resultados
B. pasteurii DR2 que era una cepa resistente al mercurio mostró una esporulación máxima
dentro de las 24 h, pero la esporulación se retrasó significativamente por HgCl2 (figura I
A). Sin embargo, la esporulación por una cepa GS1 sensible a Hg de B. subtilis se vio
favorecida en presenciade HgCl2 (figura 1B).
Figura 2. Eliminación de mercurio de HgCl2 presente en los medios de esporulación en
diferentes veces.

Volatilización de mercurio a partir de la esporulación que contiene HgCl2 medio por

cepas de Bacillus resistentes al mercurio y sensibles en diferentes intervalos de tiempo
durante la esporulación se ha mostrado en la figura 2. Curiosamente, B. pasteurii se ha
volatilizado
70% Hg del medio de esporulación después de 18 h, que aumentó a 97% Hg después de
36 h. Hubo muy poca volatilización (3%) de Hg por B. subtilis sensible a Hg. GS1
después de 36 hy la tasa de volatilización fue casi similar a la del frasco de control sin
células bacterianas.
Medimos las actividades de Hg2 + -reductasas y organo-mercurial lyases en células
vegetativas antes de la esporulación y en las esporas (tabla 1). Actividades de Hg2 + -
reductasas y organomercurial liasas degradan diferentes mercuriales fueron encontrado
dentro de las endosporas, pero el nivel de estas enzimas en las esporas era muy bajo en
comparación con el presente en las células inducidas por Hg sin endosporas. Específico
actividades de estas enzimas en esporas en presencia o ausencia de HgCl2 fueron casi
similar (tabla 1).

4. Discusión
La esporulación, la propiedad intrínseca de Bacilli y Clostridia se ve favorecida por el
estrés condiciones Es evidente por nuestros datos que Bacilli se comprometió con la
esporulación más eficiente para abordar las condiciones de estrés nutricional y ambiental.
Hg-sensible

Tabla 1. Nivel de enzimas desintoxicantes de mercurio en las esporas de B. pasteurii DR2

Un Una unidad de Hg2 + -reductasa se define como la cantidad de proteína enzimática

que oxidó 1 μmol de NADPH por minuto en presencia de HgCl2. segundo
Una unidad de organomercurial liasa se define como la cantidad de proteína enzimática
que oxida 1 nmol de NADPH por minuto en presencia de un organomercurial.

B. subtilis GS1 fue posiblemente más susceptible a la toxicidad por mercurio.

Esporulación retrasada de B. pasteurii DR2 en presencia de HgCl2 podría ser el
resultado de la inducción y expresión del operón mer por HgCl2 (Silver y Misra 1988) y
supresión de genes de esporulación que incluyen genes para un factor σ de polimerasa
de ARN y un supuesto D-carboxipeptidasa (Predich et al 1992; Wu et al 1992).
Probablemente estos genes son expresado que conduce finalmente a la esporulación
cuando la concentración de HgCI2 en el el medio esporulante disminuye.
Bajos niveles de estas enzimas dentro de 'esporas en comparación con los niveles de las
enzimas en las células bacterianas inducidas por HgC12 indican que a pesar de los
genes que codifican la las enzimas desintoxicantes de mercurio en las células
vegetativas también están presentes en las esporas, sus niveles son bajos en las esporas
en comparación con las formas vegetativas debido a la gran estado metabólico reducido
de las esporas Hay informes de que la desintoxicación de mercurio enzimas, tanto Hg2
+ -reductasas como organomercurial liasas son inducidas por mercurio compuestos en la
fase logarítmica tardía del crecimiento de estas cepas bacterianas (veranos) .
El presente trabajo indica claramente que la formación de esporas las bacterias
resistentes al mercurio pueden servir como un mejor secuestrante de mercurio en los
ambientes tóxicos. Aquí vale la pena mencionar que este estudio es el primer informe
demostrando la existencia de catalizadores desintoxicantes de mercurio de la naturaleza
Hg2 + -reductasa y organomercurial liasa (Moore et al 1990) en bacterias endosporas.
Es posible que todos los demás Bacilli resistentes a Hg se comporten de manera similar.