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ULADECH CATÓLICA GUÍA DE PRÁCTICAS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL

UNIVERSIDAD CATÓLICA
LOS ÁNGELES DE CHIMBOTE

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD


ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL


AUTOR
MS QF DAVID RUIDÍAS ROMERO
TRUJILLO-2017

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MS QF DAVID RUIDÍAS ROMERO
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GUÍA DE PRÁCTICAS
DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL

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Modelo
Informe de práctica de laboratorio

Al término de la práctica de laboratorio, cada estudiante recopilará los resultados


obtenidos y elaborará un informe de acuerdo a la estructura siguiente:

1. Título del informe.

2. Introducción: en ella se consignará los fundamentos básicos, se señalará el


problema, la hipótesis y los objetivos.

3. Material y método: Se sustenta en lo utilizado en práctica

4. Resultados: Se prepara en base a los hallazgos de la práctica, diseñando


tablas y gráficas.

5. Discusión: Análisis, interpretación y comparación de los resultados tomando


como base la información de las clases o textos de referencia.

6. Resumen y conclusiones: Se hará una síntesis en pocas palabras de la


práctica realizada, desde la introducción hasta los resultados, luego se
anotará las conclusiones de forma precisa y concreta.

7. Referencias bibliográficas: se aplicará según las normas Vancouver.

Este informe debe de presentarse en la fecha indicada por el docente tutor de


la asignatura de Análisis Instrumental.

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Práctica 1
Normas de seguridad en el laboratorio

OBJETIVOS.
1) El estudiante conocerá el reglamento interno y aplicará en forma eficiente la
forma de actuar en caso de accidentes en el Laboratorio de Análisis
Instrumental, aplicando los principios de primeros auxilios.
2) El estudiante conocerá las principales causas de accidentes y la forma como
prevenirlos.

INTRODUCCIÓN.
Cuando se empieza el trabajo en el Laboratorio de Análisis Instrumental se debe
de entender que se encontrará frente a sustancias y procedimientos que podrían
afectar la seguridad del estudiante, del ambiente y del ecosistema en general si
dichos materiales o procesos se utilizan de forma incorrecta.
El estudiante del curso de Análisis Instrumental debe de reconocer la importancia
de la seguridad en el laboratorio y de esta forma estará dispuesto a cumplir con
todas las normas que son para su propia seguridad y la de sus compañeros y de
esta forma mostrará responsabilidad e interés para que todas las sesiones
terminen como una enseñanza positiva y apropiada en el proceso de enseñanza-
aprendizaje, y sobre todo en la formación de su carácter científico responsable,
crítico y de superación.
Este material es el resumen de varios manuales editados para una enseñanza
apropiada de las experiencias de Análisis Instrumental y se les exige a todos los
alumnos inscritos en esta asignatura lo lean detallada, concienzudamente y lo
pongan en práctica no como una imposición sino como un estilo de vida.

REGLAMENTO BÁSICO.
Muchas son las sugerencias y consejos que se han dado sobre la seguridad en
el laboratorio aquí enumeramos algunas de ellas:
a) Conocer bien las propiedades físicas, químicas y toxicológicas de las
sustancias que se van a utilizar.

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b) Nunca trabajar solo en el laboratorio.


c) Usar siempre bata o guardapolvos.
d) Usar lentes protectores y guantes cuando sea necesario.
e) Manipular el equipo caliente con guantes de asbesto o pinzas, para evitar
quemaduras.
f) Mantener libre de objetos innecesarios la zona de trabajo.
g) Nunca perder de vista los reactivos y el sistema con que se esté trabajando.
h) No comer, fumar o jugar dentro del laboratorio.
i) Utilizar todo el material de laboratorio limpio y seco.
j) Nunca pipetear los reactivos líquidos con la boca utilizar SIEMPRE las
bombillas para aspirar, las propipetas u otro equipo diseñado para ese uso.
k) Nunca devolver al envase original los remanentes de reactivos no utilizados.
l) Lavarse bien las manos al final de cada sesión de laboratorio.
m) Antes de usar un reactivo, verificar los datos anotados en la etiqueta y
consultar sus propiedades físicas, químicas y toxicológicas para manejarlo
adecuadamente.
n) Nunca probar el sabor u olor de ningún producto, a menos que sea
estrictamente necesario y seguro.
o) Para oler una sustancia, ésta no debe ponerse directamente debajo de la
nariz; por el contrario, se mueve la mano sobre ella para percibir su aroma
sin peligro.
p) Los productos químicos nunca se tocan directamente con las manos,
especialmente aquellos que, además de su toxicidad, pueden producir
quemaduras graves. Todo manejo se hará mediante espátulas.
q) Todo compuesto volátil o que desprenda humos o vapores tóxicos deberá
manejarse en las campanas o permanecer en un lugar ventilado.
r) Si se derrama ácido sobre la mesa, se debe recoger inmediatamente y lavar
la superficie con agua varias veces.
s) No debe mirarse dentro de un tubo o matraz que contenga una reacción o
sustancia que se esté calentando.
t) Las soluciones concentradas de álcalis o ácidos deben neutralizarse antes
de ser desechadas por el desagüe.
u) No se deben tirar por el desagüe líquidos inflamables, irritables o
lacrimógenos.

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v) Cuando utilice ácidos, hágalo en la campana de extracción y siempre


protegido con guantes y lentes de seguridad.
w) Para preparar una solución diluida de ácido se debe añadir, lentamente, con
agitación y con enfriamiento externo, el ácido al agua, nunca el agua sobre el
ácido ya que la reacción es muy exotérmica y puede proyectarse
violentamente.
x) Antes de poner a calentar líquidos, éstos deben estar bien mezclados (si son
miscibles; en caso contrario, al hervir el de menor punto de ebullición puede
proyectarse o explotar. Los de bajo punto de ebullición no se deben calentar
nunca en recipientes de cuello corto).
y) En una destilación no se deben obstruir los condensadores ni los tubos de
evacuación.

¿COMO SE INICIA UN INCENDIO EN EL LABORATORIO?


a) Hacer hervir un disolvente volátil o inflamable con un mechero y sin un
condensador.
b) Mantener un solvente volátil o inflamable cerca de alguna fuente de calor o
chispa.
c) Inclinar el mechero de alcohol en otro mechero para encenderlo.
d) Arrojar reactivos y los desechos de reacciones exotérmicas u
organometálicas en el desagüe.
e) Mezclar sustancias que al reaccionar generan vapores o gases inflamables.
f) No respetar las condiciones de almacenamiento de reactivos inestables,
volátiles o que pueden reaccionar violentamente con: temperatura, agua,
ácidos, bases, agentes oxidantes, reductores o compuestos de elementos
pesados.

¿COMO SE PREVIENE UN INCENDIO EN EL LABORATORIO?


a) Conocer bien la toxicidad de cada reactivo y las precauciones necesarias al
usarlo.
b) Evitar el uso de mecheros; en su lugar se usarán manta calefactora, parrillas
de calentamiento o canastillas.
c) Ser muy cuidadoso al utilizar disolventes inflamables y volátiles
d) Conocer la temperatura de ignición espontánea de las sustancias.

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e) Mantener el mandilón abotonado durante toda la sesión de laboratorio.

EXPLOSIONES.
Pueden ocurrir por las siguientes condiciones:
a) Una reacción exotérmica no controlable (que provoca explosión y fuego).
b) Una explosión de residuos de peróxidos al concentrar soluciones etéreas a
sequedad.
c) Una explosión por calentamiento, secado, destilación o golpe de compuestos
inestables.
d) Mezclar sustancias incompatibles que generan vapores o gases inflamables
o explosivos.
e) Para evitar explosiones, una regla esencial es conocer las condiciones de
almacenamiento y uso de cada sustancia.

PRIMEROS AUXILIOS.
a) En caso de incendio, aléjese rápidamente y permita que su asesor lo apague
con el extinguidor que debe haber en el laboratorio. Si esto ya no es posible,
salga rápidamente del laboratorio. Si el fuego afecta ya a algún compañero,
trate de quitarle las prendas que se estén consumiendo y retírelo de la zona
del siniestro.
b) En caso de explosión, salga inmediatamente del laboratorio y, si le es posible,
ayude a sus compañeros afectados. Avise al resto del personal de laboratorio
para que presten auxilio.
c) Si se salpica la piel con ácidos, lávese inmediatamente con agua abundante
y aplíquese una disolución de bicarbonato sódico.
d) Si una sustancia lo salpica sobre los ojos, enjuáguese inmediatamente con el
lavaojos o bien con agua abundante y después con una solución de bórax
(que debe existir en el botiquín del laboratorio). Si persisten las molestias,
consulte al médico.
e) Cuando se ingiere una base se neutraliza con jugo de naranja o de uva, o
con vinagre.
f) Cuando se haya ingerido una sustancia venenosa o tóxica y sea necesario
provocar vómito, utilice un emético. Algunos eméticos son:

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• Agua con mostaza: se agrega una cucharadita de té de mostaza a un vaso


de agua caliente. Se administra una cuarta parte del contenido.
• Agua salada: se disuelven dos cucharaditas de sal en agua caliente y se
toma la dilución a intervalos de un minuto hasta suministrar más o menos
cuatro vasos.
• Agua con jabón: se agita un pedazo de jabón en agua caliente.

SEÑALES DE PELIGRO MÁS COMUNES.

RESUMEN Y CONCLUSIONES.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
1. FIESER, LOUIS. Organic Experiments. Septima edición. Editorial D.C. Heath
and Company. United States America. 1992.
2. GALAGOVSKY KURMAN, LYDIA. “Química Orgánica: Fundamentos teórico
– prácticos para el laboratorio”. Quinta Edición. Editorial Universitaria de
Buenos Aires. Argentina. 2002.
3. GARCIA SANCHEZ, MIGUEL ANGEL. “Manual de Prácticas de Química
Orgánica I”. Editorial Universidad Autonoma Metropolitana. Unidad
Iztapalapa. Mexico. 2002.

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Práctica 2
Evaluación estadística de datos
experimentales

OBJETIVOS.
1. Determinar la media aritmética y la desviación estándar de los datos
experimentales.
2. Aceptar o Rechazar datos dudosos de una muestra experimental por medio
de la prueba Q.
3. Valorar por medio de la prueba de Kolmogorov-Smirnov si los datos
experimentales proceden de una población normal.
4. Evaluar a través de la prueba F y t de student si los datos experimentales de
dos grupos son significativamente diferentes.

FUNDAMENTO.
Es importante saber si una medición puede aceptarse con confianza o si debe
rechazarse como errónea. Una observación de seguridad desconocida tiene
escaso valor, excepto como una aproximación. Esto no significa que todas las
observaciones deben ser precisas, más bien, debe conocerse el "nivel de
confianza" en que puede tenerse cada resultado en particular.
El valor de una medición estará en función de su precisión, así como de su
exactitud. Una definición común de precisión, denominada medida de precisión,
es la desviación estándar (s), definida por la expresión:

∑ ( X i - M)2
S= (1)
n-1
donde n-1 puede denominarse "grados de libertad"; siendo n el número de
mediciones.
La desviación estándar se acepta generalmente como el índice más digno de
confianza del error casual; basándose en la probabilidad se puede calificar a una
medición individual como M ± S, en donde M es el valor medio, con la confianza
de que sólo el 30% de las veces el error en la medición excederá esos límites.

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También puede alcanzarse un nivel de 95% de seguridad si una observación se


califica como M ± 2S con estos límites, puede anticiparse un error grande sólo el
5% de las veces o sea, una medición en cada 20.
Después de obtener cuatro o cinco resultados repetidos, no es muy probable que
la repetición subsecuente de una medición cambie apreciablemente la S
calculada; sobre todo la medida de precisión no se hará más pequeña. Lo que si
mejora es el valor medio; se convierte en una mejor aproximación del valor
verdadero mientras mayor sea el número de observaciones.
La seguridad de una media puede calcularse tomándola como parte de un grupo
de medias determinadas en forma similar. Estadísticamente, la desviación
estándar de la media de n observaciones demuestra que decrece en relación
con la raíz cuadrada de n:
s
sx =
n
Existe una buena razón para limitar el número de repeticiones de un análisis a
sólo tres o cuatro en los trabajos minuciosos. La media de cuatro
determinaciones tiene una desviación estándar que es la mitad de la de una sola
medición. Cinco observaciones adicionales que hagan un total de nueve,
reducen la desviación estándar de la media a sólo un tercio del valor de una
medición única.
La normalidad de los datos muestrales se puede evaluar mediante la prueba de
Kolmogorov-Smirnov.
Las desviaciones estándar se pueden comparar mediante la prueba F, para
luego aplicar una prueba de significación de diferencia de medias utilizando la
prueba t. El analista debe medir la confianza de su resultado medio (M). Esta
medida, llamada límite de confianza de la media, se calcula con ayuda de la
distribución de Student, t (Student, seudónimo de W.S. Gosset, químico y
estadístico británico). Si se desea conocer los límites dentro de los cuales estará
un porcentaje elegido de medias adicionales de n observaciones; estos límites
de confianza vienen dados por M ± tsx. El valor se toma de las tablas de
probabilidad (P), probabilidad de que se excedan los límites calculados.
Si la capacidad de reproducción de datos es pobre, deben refinarse las técnicas
y buscarse siempre los errores sistemáticos o las variables sin control. Las
repeticiones, por si solas, no disminuirán dichas influencias.

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RECHAZO DE DATOS DUDOSOS.


Cuando una observación de un conjunto parece ser muy discordante, se debe
decidir su aceptación o rechazo; considerando que se puede alterar la
información al rechazar un dato que corresponde realmente al conjunto o al
aceptar uno que no corresponde. Dean y Dixon han sugerido el siguiente
procedimiento:

1) Examinar cuidadosamente el dato que conduce al resultado discordante.


2) Aplicar la prueba de rechazo Q en caso de no encontrar error alguno. Si el
rechazo procede; los valores restantes se utilizan en el cálculo de la media.
3) Si el rechazo no procede, el dato debe retenerse.

La prueba Q se efectúa por sustracción del resultado dudoso de su vecino más


cercano y dividiendo esta diferencia por el margen (diferencia entre valores
extremos), el resultado es el valor de Q; si éste es mayor que el valor dado por
la tabla de Relaciones de rechazo Q, el dato dudoso se rechaza con la
probabilidad porcentual tabular de estar haciendo lo correcto.

TABLA. Relaciones de rechazo Q

n Q 0.90 Q 0.95

3 0.94 ------
4 0.76 0.831
5 0.64 0.717
6 0.56 0.621
7 0.51 0.570
8 0.47 0.524
9 0.44 0.492
10 0.41 0.464

También puede aplicarse el criterio de Chauvenet cuando n > 5

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EQUIPOS Y REACTIVOS.

Potenciómetro o pH-Metro WTW pH 7310. Es satisfactorio cualquier pH-


Metro comercial cuya sensibilidad llegue mínimo hasta un orden de 0.01
unidades de pH; equipado con electrodos de vidrio y de calomel.
Agitador magnético y barra magnética.
5 mL de soluciones buffers o tampón de pH 4, 7 y 10.
Vasos de precipitación de 50 mL.
Frasco lavador o piseta.
1L de agua potable de grifo de lugar de precedencia por grupo de práctica.
0.5 L de agua destilada por grupo de práctica.

PROCEDIMIENTO.
1. Calibrar el pH-Metro con las soluciones buffers o tampón de pH conocido.
2. Colocar aprox. 50mL de agua potable en el vaso de precipitación de 50 mL.
3. Sumergir el electrodo del pH-Metro teniendo en cuenta que la barra
magnética no lo roce al girar y agitar moderadamente, en tales condiciones
cuando la señal de variabilidad en el DISPLAY desaparezca registrar el pH.
Debe haber suficiente agua potable en todo tiempo en el recipiente en el que
se está realizando la medida de pH, para cubrir la porción sensible de los
electrodos.

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4. Registrar diez medidas de pH del agua potable proporcionada por el grupo


de práctica, colocando en el vaso de precipitación de 50 mL porciones
diferentes de aproximadamente 50 mL.

UTILIZACIÓN DE DATOS
1) Calcular la media y desviación estándar para cada muestra.
2) Aplicar la prueba Q para los datos dudosos.
3) Aplicar la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov.
4) Aplicar la prueba F y la prueba t a las desviaciones estándar y medias
muestrales.
5) Interpretar los resultados.

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Práctica 3
Calibración de un espectrofotómetro por el
método de estándar externo

OBJETIVOS.
1. Calibrar la respuesta de un espectrofotómetro utilizando el método de
estándar externo.
2. Representar gráficamente el promedio las absorbancias versus la
concentración de las soluciones estándar.
3. Obtener la ecuación de la recta, pendiente, intercepto y coeficiente de
determinación.
4. Calcular la media o promedio, la desviación estándar y el coeficiente de
variación de las absorbancias de la solución ensayo.
5. Calcular la concentración de la solución ensayo con la ecuación de la recta.
6. Calcular la exactitud a través del error absoluto y error relativo.

FUNDAMENTO.
A menudo se obtienen representaciones gráficas (curva patrón o curva analítica)
que son lineales en un amplio intervalo de concentración (intervalo útil) lo cual
es deseable, ya que están menos sujetas a error que las curvas no lineales. Sin
embargo, no es raro encontrar representaciones gráficas no lineales, las cuales
requieren un elevado número de datos de calibrado para establecer con
precisión la relación entre la respuesta del instrumento y la concentración. Se
obtiene la ecuación de la curva de calibración por el método de mínimos
cuadrados que permite calcular directamente la concentración de las muestras.

Para calibrar por el método de estándar externo se introducen en el instrumento


varios patrones que contienen concentraciones exactamente conocidas del
analito y se registra la señal instrumental. Normalmente esta señal se corrige con
la correspondiente señal obtenida con el blanco. En condiciones ideales el
blanco contiene todos los componentes de la muestra original excepto el analito.

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Los datos obtenidos se representan para obtener una gráfica de la señal


corregida del instrumento frente a la concentración de analito.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.


Espectrofotómetro de absorción UV/Visible Unico 2100.
Balanza analítica de precisión de diezmilésima de gramo.
Cubetas de vidrio para el visible.
Espátula de metal muy fina.
Papel metálico de aluminio.
Frasco lavador.
Papel Tissú o pañuelos desechables.
Matraces volumétricos de 10 y 25 mL.
Colorante Verde Menta.
Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.
1. Solución STOCK: transferir 10 mg de colorante Verde Menta a un matraz
volumétrico de 25 mL, disolver y llevar a volumen con agua destilada.
2. Solución PATRÓN: medir 5 mL de solución STOCK y transferir
cuantitativamente a matraz volumétrico de 25 mL llevando a volumen con
agua destilada, mezclar por agitación (15 segundos).
3. Solución MUESTRA: medir 4 mL de solución STOCK y transferir
cuantitativamente a matraz volumétrico de 25 mL llevando a volumen con
agua destilada, mezclar por agitación (15 segundos)
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4. Soluciones ESTÁNDAR: medir 1, 2 y 4 mL de la solución PATRÓN y transferir


cuantitativamente a matraces volumétricos de 10 mL y aforar con agua
destilada, mezclar por agitación (15 segundos).
5. Solución ENSAYO: medir 2,5 mL de la solución de MUESTRA y transferir
cuantitativamente a matraz volumétrico de 10 mL y aforar con agua destilada,
mezclar por agitación (15 segundos).
6. Registrar la absorbancia por triplicado a λmáx de ESTÁNDARES y ENSAYO.

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Representar gráficamente el promedio los datos de absorbancia versus la
concentración de las soluciones estándar.
2. Obtener la ecuación de la recta, la pendiente (m), el intercepto (b) y el
coeficiente de determinación (R2).

3. Calcular la media o promedio = ; la desviación estándar =

∑ ( )
; y el coeficiente de variación = ×100% de las

absorbancias de la solución ensayo.


4. Calcular la concentración de la solución ensayo con la ecuación de la recta.
5. Calcular la exactitud a través del error absoluto = − y el error relativo

= ×100% , donde = !"# $ %&$ !"$; = '#($& ' &!#! &$

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Práctica 4
Calibración de un espectrofotómetro por el
método de adición estándar

OBJETIVOS.

1. Calibrar la respuesta de un espectrofotómetro utilizando el método de adición


estándar.
2. Representar gráficamente los datos de S (absorbancias) versus el volumen
de solución patrón añadido.
3. Obtener la ecuación de la recta, pendiente, intercepto, coeficiente de
determinación.
4. Calcular la concentración de la solución muestra y la desviación estándar
empleando las ecuaciones del presente instructivo de práctica.

FUNDAMENTO.

En este método varias alícuotas idénticas Vx de la disolución problema con una


concentración Cx se transfieren a matraces aforados de volumen Vt. A cada uno
de ellos, se le añade un volumen variable (Vs, mL) de una disolución patrón del
analito que tiene una concentración conocida Cs. Se añaden entonces los
reactivos adecuados y cada disolución se diluye hasta un volumen determinado.
Se realizan las medidas instrumentales en cada una de esas disoluciones dando
una señal S en el instrumento. Si la respuesta del instrumento es proporcional a
la concentración, como debe ser para que el método de la adición estándar sea
aplicable, se puede escribir que:

KVS C S KV X C X
S= + (1)
Vt Vt

Donde k es una constante de proporcionalidad. La representación de S, en


función de Vs, es una línea recta de la forma:

S = mVS + b (2)

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Donde la pendiente m y la ordenada en el origen b viene dadas por

KC S KV X C X
m= (3) y b= (4)
Vt Vt

Para determinar m y b puede utilizarse un tratamiento por mínimos cuadrados;


Cx se puede obtener a partir de la relación entre estas dos cantidades y lo valores
conocidos de Cs, Vx y Vs. Así,

b VX C X bC S
= o CX = (5)
m CS mV X

Se puede obtener el valor de la desviación estándar en Cx, suponiendo que las


incertidumbres en Cs, Vs y Vt son despreciables con respecto a las de m y b.
Entonces, la varianza relativa del resultado (Sc/Cx)2 se toma como la suma de
las varianzas relativas de m y b. Esto es,

2 2 2
 SC  S  S 
  =  m  +  b  (6)
 CX   m  b 

donde Sm, es la desviación estándar de la pendiente y Sb es la desviación


estándar de la ordenada en el origen. La raíz cuadrada de esta ecuación da:

2 2
 Sm   Sb 
SC = C X   +  (8)
 m  b 

También se puede dibujar manualmente una gráfica de los datos, y la parte recta
de la misma se extrapola hasta interceptar el eje de las X. La diferencia entre el
volumen añadido de patrón en el origen (cero) y el valor del volumen en el punto
de intersección de la línea recta con el eje de las X (Vx)0, es el volumen de patrón
que equivale a la cantidad de analito en la muestra.

Además, la intersección con el eje de las x corresponde a la señal cero del


instrumento, así que se puede considerar:

 KVS C S   KV X C X 
S =   +   = 0 (9)
 Vt   Vt 

Resolviendo esta ecuación (9) para Cx, se obtiene:

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(VS )0 C S
CX = − (10)
VX

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.

Espectrofotómetro de absorción UV/Visible Unico 2100


Balanza analítica de precisión de diezmilésima de gramo.
Cubetas de vidrio para el visible.
Espátula de metal muy fina.
Matraces volumétricos de 10 y 25 mL.
Pipetas de 1, 5 y 10 mL.
Frasco lavador o piseta.
papel metálico de aluminio.
Papel Tissú o pañuelos desechables.
Colorante Verde Menta.
Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.

1. Solución STOCK: transferir 10 mg de colorante verde menta a un matraz


volumétrico de 25 mL, disolver llevando a volumen con agua destilada y
agitar.
2. Preparar una solución PATRÓN de concentración 40 µg/mL. Para lo cual
medir 2,5 mL de solución STOCK y transferir cuantitativamente a matraz
volumétrico de 25 mL llevando a volumen con agua destilada y agitar.

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3. Preparar una solución MUESTRA de concentración 80 µg/mL. Para lo cual


medir 5 mL de solución STOCK y transferir cuantitativamente a matraz
volumétrico de 25 mL llevando a volumen con agua destilada y agitar.
4. Pipetear 5 alícuotas de 1 mL de la solución MUESTRA en matraces aforados
de 10 mL. A cada uno adicionar exactamente 0, 1, 2, 4, y 8 mL de la solución
PATRÓN de 40 µg/mL llevando a volumen con agua destilada y agitar.
5. Registrar la absorbancia (a λmáx) de cada una de estas soluciones.

UTILIZACIÓN DE DATOS.

1. Representar los datos de S (absorbancia) versus el volumen de solución


PATRÓN añadido (mL).
2. Obtener la ecuación de la recta, la pendiente (m), el intercepto (b) y el
coeficiente de determinación (R2).
3. Calcular la concentración de la solución MUESTRA (Cx) mediante la ecuación
5 y la alternativa gráfica.
4. Calcular la desviación estándar de la concentración de la solución MUESTRA
(Sc) mediante la ecuación 8.

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Práctica 5
Verificación de las características de un
espectrofotómetro

OBJETIVOS.
1. Examinar las características de operación de un espectrofotómetro de
absorción ultravioleta visible.
2. Determinar automáticamente por medio de un espectrofotómetro la
concentración de un analito en solución.
3. Comprobar los colores del espectro visible a las longitudes de onda
seleccionadas.

FUNDAMENTO.
El espectrofotómetro de absorción UV/Visible UNICO modelo 2100 UV está
equipado con un microprocesador que controla el rango UV/Visible, cubriendo el
rango de longitud de onda de 200 a 1000 nm, con un ancho de banda espectral
de 5 nm.
El monocromador es un diseño de Czerny Turner de haz simple que incorpora
una red de difracción holográfica de 1200 líneas/mm y un arreglo de supresión
automática en la respuesta de segundo orden. Las fuentes de radiación
electromagnética lo constituyen una lámpara Halógena de Tungsteno y otra de
Deuterio.
Los botones o teclas de comando son del tipo almohadilla, se encuentran en el
panel frontal derecho, de arriba hacia abajo: a) MODE, permite seleccionar el
tipo de función Transmitancia, Absorbancia, Concentración y Factor; b) 0ABS /
100%T, se usa para ajustar el cero de absorbancia o el cien por ciento de
Transmitancia con la solución blanco; c) PRINT, para utilizar la unidad de
impresión, d) WAVELENGTH / ▲ y ▼, para realizar aumento o disminución de
la longitud de onda a la que el investigador quiere trabajar, f) W, enciende o
apaga la lámpara Halógena de Tungsteno cuando está en el Mode de
Transmitancia o Absorbancia, g) D2, enciende o apaga la lámpara de Deuterio

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cuando está en el mode de Transmitancia o Absorbancia , h) INC / DEC,


aumento o disminución en la pantalla de la concentración cuando se encuentra
en Mode Concentración o el número de factor cuando está en el Mode de Factor
y el Mode de Transmitancia y Absorbancia apaga y enciende las lámparas
Halógena de Tungsteno (W) y de Deuterio (D2) y i) ENT, primero hay que
presionar el Mode Concentración y nos da los resultados para impresión.
El dispositivo de lectura es un indicador digital: a) Data display screen, presenta
la lectura directa en modo de Transmitancia, Absorbancia, Concentración y
Factor; b) Mode Indicador, muestra el modo de operación seleccionado
Transmitancia, Absorbancia, Concentración y Factor; c) Power indicator, se
ilumina cuando el instrumento está en funcionamiento.
La cámara para la muestra cuenta con un portacubetas para cuatro cubetas de
10 x 10 mm y una cubierta, puerta o tapa hermética.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.


Espectrofotómetro de absorción UV/Visible Unico 2100
Balanza analítica de precisión de diezmilésima de gramo.
Cubeta de vidrio para el visible.

Espátula de metal muy fina.


Matraz volumétrico de 25 mL.
Pipeta de 5 mL.
Frasco lavador o piseta.
Papel metálico de aluminio.
Papel Bond de 8 X 8 cm.
Papel Tissú o pañuelos desechables.
Colorante Verde Menta.

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Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.
VERIFICACIÓN DE CARACTERÍSTICAS Y DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN.
1. Conmutar el switch VOLTAJE SELECTOR a la posición correcta de
alimentación, conectar el cable de alimentación a la fuente de energía eléctri-
ca.
2. Cerrar la cámara de muestra, pero antes verificar que se encuentre vacía y
en la posición correcta y encender: Power on el instrumento; dejar calentar
15-30 minutos.
3. Seleccionar la longitud de onda requerida para el análisis con el botón o tecla
de control de longitud de onda: WAVELENGTH/▲ y ▼
4. Seleccionar Transmitancia usando la tecla MODE.
5. Cerrar la cámara de muestra. Fijar el 100 %T por presión de la tecla
0ABS/100%T.
6. Medir aprox. 3 mL de AGUA DESTILADA y depositar en la cubeta. Colocar
ésta en el portacubetas y cerrar la cámara de muestra. Fijar el 100 %T por
presión de la tecla 0ABS/100%T. Si se ha seleccionado la opción
Absorbancia con la tecla MODE, en la pantalla debe aparecer CERO al
presionar la tecla 0ABS/100%T.
7. Solución STOCK: transferir 10 mg de colorante verde menta a un matraz
volumétrico de 25 mL, llevar a volumen con agua destilada mezclar por
agitación (15 segundos).
8. Solución PATRÓN: medir 3 mL de solución STOCK y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 25 mL llevando a volumen con
agua destilada, mezclar por agitación (15 segundos).
9. Solución MUESTRA: medir 1,5 mL de solución STOCK y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 25 mL llevando a volumen con
agua destilada, mezclar por agitación (15 segundos).
10. Retirar la cubeta del portacubetas, reemplazar el AGUA por la solución
PATRÓN y observar en el display los valores de Transmitancia %T y
Absorbancia (ABS) utilizando la tecla MODE.
11. Para medir la concentración seleccionar Concentración con la tecla MODE.
Fijar el valor de concentración de la solución PATRÓN (μg/mL) mediante las

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teclas de incremento o decremento (INC/DEC); una vez que la pantalla


muestra el valor correspondiente presionar el botón o tecla ENT.
12. Disponer la solución MUESTRA para observar en el display el valor de
concentración determinado automáticamente.
COMPROBACIÓN DE LOS COLORES DEL ESPECTRO VISIBLE
1. Verificar que la cámara de muestra se encuentre vacía y en la posición
correcta.
2. Seleccionar 400 nm, cerrar la cámara de muestra y fijar el 100 %T por presión
de la tecla 0ABS/100%T.
3. Apagar la luz y cerrar las cortinas o persianas de las ventanas y puertas para
que el ambiente de trabajo esté lo más oscuro posible.
4. Colocar un papel bond de color blanco en el trayecto de la luz, entre la
ventana de salida del monocromador y el detector, para que refleje la longitud
de onda seleccionada.
5. Retirar el papel bond de color blanco y seleccionar 425 nm, cerrar la cámara
de muestra y fijar el 100 %T por presión de la tecla 0ABS/100%T.
6. Colocar nuevamente el papel bond de color blanco en el trayecto de la luz,
entre la ventana de salida del monocromador y el detector, para que refleje
la longitud de onda seleccionada.
7. Repetir este procedimiento para cada 25 nm de incremento hasta el límite
superior del espectro visible.

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Elaborar un esquema o flujograma de los pasos a seguir para calcular la
concentración de la muestra en el espectrofotómetro UV/Visible UNICO 2100
UV.
2. Realizar los cálculos, comparar e informar sobre la concentración de las
soluciones PATRÓN y MUESTRA, con la concentración obtenida
automáticamente por el espectrofotómetro UV/Visible UNICO 2100 UV.
3. Determinar el error relativo de la concentración obtenida automáticamente
por el espectrofotómetro UV/Visible UNICO 2100 UV.
4. Elaborar un cuadro de doble entrada entre la longitud de onda y el color del
espectro visible observado.

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Práctica 6
Determinación de la longitud de onda analítica

OBJETIVOS.
1. Adquirir un conjunto de datos mediante un espectrofotómetro UV-Visible.
2. Elaborar los espectros de absorción de soluciones patrón.
3. Determinar la longitud de onda de máxima absorbancia de una sustancia
absorbente presente en solución.

FUNDAMENTO.
Cada molécula absorbe sus propias frecuencias características de radiación
electromagnética. Este proceso transfiere energía a la molécula y disminuye la
intensidad de la radiación electromagnética incidente. La absorción indica
cuantitativamente la forma en que el grado de atenuación depende de la
concentración de las moléculas absorbentes y de la longitud de onda del trayecto
en el que ocurre la absorción. Cuando la luz atraviesa un medio que contiene un
analito absorbente, disminuye su intensidad como consecuencia de la excitación
del analito.
La absorbancia de una solución se relaciona con la transmitancia de manera
logarítmica reduciéndose la transmitancia a medida que aumenta la absorbancia.
Una sustancia disuelta absorbe preferentemente determinadas porciones del
sector ultravioleta y/o visible del espectro electromagnético. Con fines analíticos
es conveniente conocer la denominada longitud de onda de máxima
absorbancia.
Esta longitud de máxima absorbancia también se conoce como Lambda máximo:
λmáx, correspondiente a la frecuencia fotónica que mayor efecto produce en el
estado energético de la especie material absorbente, así se tendrá la mayor
respuesta cuando el analito se encuentre a muy bajas concentraciones en
solución. Obteniendo la absorbancia de una solución del analito a concentración
adecuada en todo el rango del espectro electromagnético de interés (ultravioleta,
visible); graficando el espectro de absorción (absorbancia vs longitud de onda),
es posible determinar la longitud de onda de máxima absorbancia del analito.

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EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.


Espectrofotómetro de absorción UV/Visible Unico 2100
Balanza analítica de precisión de diezmilésima de gramo.
Cubetas de vidrio para el visible.
Espátula de metal muy fina.
Matraces volumétricos con tapa de 10 y 25 mL.
Pipeta de 1 mL.
Vaso de precipitación de 250 mL.
Frasco lavador o piseta.
Papel metálico de aluminio.
Papel Tissú o pañuelos desechables.
Colorante Verde Menta.
Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.
1. Encender el espectrofotómetro y dejar que realice los pasos de prueba
interna.
2. Verificar que el espectrofotómetro se inicie con un 100 %T a 546 nm y dejar
calentar de 15 a 30 minutos antes de hacer las lecturas.
3. Solución STOCK: transferir 10 mg de colorante Verde Menta a un matraz
volumétrico de 25 mL, llevar a volumen con agua destilada mezclar por
agitación (15 segundos).
4. Soluciones PATRÓN:
1. Solución PATRÓN 1: medir 0,25 mL de solución STOCK y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL llevando a volumen

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con agua destilada, mezclar por agitación (15 segundos).


2. Solución PATRÓN 2: medir 0,5 mL de solución STOCK y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL llevando a volumen
con agua destilada, mezclar por agitación (15 segundos).
3. Solución PATRÓN 3: medir 1 mL de solución STOCK y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL llevando a volumen
con agua destilada, mezclar por agitación (15 segundos).
5. Pasado los 15 a 30 minutos de calentamiento del espectrofotómetro cambiar
a ABSORBANCIA con la tecla MODE, en la pantalla debe aparecer CERO.
6. Medir aprox. 3 mL de agua destilada, depositar en una de las cuatro cubetas
de vidrio que disponemos en el laboratorio y de inmediato medir aprox. 3 mL
de cada una de las soluciones PATRÓN 1, 2 y 3, depositando por separado
en cada una de las tres cubetas restantes respectivamente.
7. Colocar éstas cuatro cubetas en el portacubetas en orden creciente, esto es:
primero la cubeta que contiene el agua destilada o BLANCO y luego las
cubetas que contienen las soluciones PATRÓN 1, 2 y 3.
8. Cerrar la cámara de muestra. Llevar a CERO de absorbancia con la tecla 100
%T con la cubeta que contiene agua destilada o BLANCO y seleccionar con
el portacubetas las soluciones PATRÓN 1, 2 y 3, registrar sus absorbancias
de cada una de ellas respectivamente.
9. Para cada una de las soluciones PATRÓN, obtener datos de absorbancia
(ABS) cada 10 nm en el rango de 569 a 689 nm, esto es: 569, 579, 589, 599,
609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689 nm. Calibrar a CERO de
absorbancia con la tecla 100 %T con la cubeta que contiene agua destilada
o BLANCO el instrumento cada vez que se cambia la longitud de onda.

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Organizar los datos obtenidos longitud de onda (nm) y absorbancia (ABS) en
un cuadro de doble entrada.
2. Graficar los datos absorbancia vs longitud de onda de las soluciones
PATRÓN 1, 2 y 3: Espectros de absorción.
3. Determinar la longitud de onda de máxima absorbancia (λmáx) para el
colorante Verde Menta.

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Práctica 7
Determinación del error fotométrico en la
concentración

OBJETIVOS.
1. Determinar el error fotométrico en la concentración y graficarlo versus la
transmitancia.
2. Determinar la desviación estándar relativa de la concentración y graficarlo
versus la absorbancia.
3. Determinar el rango de concentraciones donde la medición está afectada del
menor error relativo en la concentración originado por la incertidumbre en la
transmitancia.

FUNDAMENTO.
A partir de la expresión de la Ley de Beer se puede conseguir una expresión
para la dependencia de la incertidumbre relativa para la concentración respecto
de la incertidumbre relativa o ruido en la transmitancia proveniente de los tres
pasos de medida. A = εbc = - log T (1)
Despejando para la concentración:
log T log e ln T 0,4343
C=− =− =− ln T ( 2)
εb εb εb
Para una especie absorbente y longitud de trayectoria dadas, ε y b son
constantes y todo el error en la concentración determinada, puede atribuirse a la
incertidumbre dT en la transmitancia medida T; entonces, derivando respecto al
cambio de la transmitancia y reordenando términos:
dC 0 ,4343 dT
=− ( 3)
C log T T
Donde (dC/C), IRC incertidumbre relativa en la concentración y (dT/T), IRT
incertidumbre relativa en la transmitancia. En otro orden:
dC/C 0 , 4343
= - = ERC ( 4 )
dT T log T

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Que es la expresión para el error relativo en la concentración originado por la


incertidumbre en la transmitancia (ERC).
Considerando que la mejor medida y más útil del ruido dT es la desviación
estándar ST, que para una serie de medidas repetidas está dada por:

∑ ( T i - T) 2

S T = dT = (5)
N -1
Donde Ti, valores individuales de T; N, número de medidas repetidas; T,
promedio para las N medidas para cada una de las soluciones ensayo.
Con el mismo criterio, mejor medida y más útil del ruido dC es la desviación
estándar SC; en base a la ecuación (3), la desviación estándar relativa en
términos de concentración (Sc/C) es:
Sc 0.4343 S T
= - (6 )
c log T T

Esta expresión muestra que la incertidumbre de una medida fotométrica de la


concentración varía en forma compleja con la magnitud de la transmitancia.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.


Espectrofotómetro de absorción UV/Visible Unico 2100
Balanza analítica de precisión de diezmilésima de gramo.

Cubetas de vidrio para el visible.


Espátula de metal muy fina.
Matraces volumétricos con tapa de 10 y 100 mL.
Pipetas de 1, 2 y 5 mL.

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Vaso de precipitación de 250 mL.


Frasco lavador o piseta.
Papel metálico de aluminio.
Papel Tissú o pañuelos desechables.
Colorante Verde Menta.
Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.
Preparar 100 mL de solución STOCK de 100 ug/mL de colorante Verde Menta;
a partir de esta solución, preparar con el mismo disolvente en matraces
volumétricos de 10 mL, soluciones de menor a mayor concentración, observando
el siguiente criterio: “La menos concentrada debe tener una transmitancia
aproximada de 0,900 y la más concentrada una transmitancia aproximada de
0,046 en la longitud de onda analítica”.

REGISTRO DE LA RESPUESTA FOTOMÉTRICA.


Encender el espectrofotómetro y dejar que se acondicione de 15 a 30 minutos,
seleccionar la longitud de onda analítica (λmax); colocar en el portacubetas la
cubeta con agua destilada y realizar el ajuste a 100 %T; registrar la lectura X %T
colocando la cubeta con la solución más diluida a la más concentrada. Repetir
éste paso con cada una de las soluciones preparadas. Hacer tres lecturas para
cada solución (tres porciones diferentes).

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Calcular para cada una de las soluciones el ERC, utilizar la ecuación (4) y
graficar los resultados vs la transmitancia respectiva.
2. Calcular para cada una de las soluciones; la desviación estándar de la
transmitancia (ST) con la ecuación (5) y la desviación estándar relativa de la
concentración (Sc/c), con la ecuación (6). Graficar estos últimos valores vs la
absorbancia respectiva.
3. Hacer las interpretaciones correspondientes de cada gráfica.
4. Determinar el rango de concentración donde la medición de la concentración
está afectada del menor error fotométrico.

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Práctica 8
Ley de Beer en el análisis cuantitativo

OBJETIVOS.
1. Demostrar la utilidad de la Ley de Beer en el análisis cuantitativo.
2. Elaborar la curva de calibración en la región visible del espectro E.M.
3. Determinar la concentración por medio de la ecuación de la recta.

FUNDAMENTO.
La absorción depende a) del medio, es decir, de su composición cuali-
cuantitativa y b) de la longitud de la trayectoria óptica en el medio. Esta
dependencia está expresada mediante la Ley de Beer.
Es importante tomar en cuenta las suposiciones que se hacen al obtener esta
ley, ellas son:
1) La radiación incidente es monocromática,
2) Los centros absorbentes (moléculas y iones) actúan independientemente
unos de otros, sin tomar en cuenta su número o tipo, y
3) La absorción está limitada a un volumen de corte seccional uniforme.
La siguiente expresión define la absorbancia A y es la presentación matemática
más simple de la ley de Beer:

log P 0 = A = ε b C
P
Donde: ε, absortividad molar; b, longitud de trayectoria óptica y C, concentración
del absorbente en moles/litro.
La proporcionalidad de la absorbancia respecto a la concentración está en
relación con la segunda suposición y a concentraciones > 0,01M -primer límite
real a la validez de la ley de Beer- la distancia media entre las especies
absorbentes puede permitir distorsión en la capacidad de absorción de radiación
EM; manifestándose como una desviación de la linealidad de la ley de Beer. Este
efecto similar puede ocasionar la concentración alta de electrolitos, aunque las
especies absorbentes se encuentren a concentración baja. Estas interacciones
moleculares generalmente carecen de importancia a concentraciones menores
que 0,01M.

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El índice de refracción de la solución cambia a medida que varía la concentración


y constituye el segundo límite real a la validez de la ley de Beer pues modifica el
valor de ε; por lo que a concentraciones mayores a 0,01M ε debe ser
reemplazada por εn / (n2 + 2)2, en la expresión de la ley de Beer.
Existen otras fuentes de desviación de la ley de Beer: a) Desviaciones
instrumentales, ocurren como consecuencia de la forma en que se hacen las
mediciones y b) desviaciones químicas, como resultado de cambios químicos en
la concentración.
Se debe concluir que para evitar las fuentes de error reales el límite superior de
concentración debe estar entre 10-5 a 10-2 y para eliminar errores no detectables
se deben trazar curvas de calibración trabajando en condiciones similares las
soluciones estándar, así como las ensayo. Estas son gráficas de A vs C y se
pueden denominar apropiadamente curvas de calibración.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.

Espectrofotómetro de absorción UV/Visible Unico 2100


Balanza analítica de exactitud 0.0001 g.
Centrífuga para tubos de ensayo de 5 mL.
Cubetas de vidrio para el visible.
Espátula de metal muy fina.
Matraces volumétricos con tapa de 10 y 25 mL.
Pipeta de 1 mL de exactitud 0.01 mL.
Pipeta de 2 mL de exactitud 0.01 mL.
Propipeta de goma o plástico.
Vasos de precipitación de 50 y 250 mL.

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Jeringa hipodérmica de 5 mL con aguja N° 21


Jeringa de tuberculina de 1 mL con aguja N° 25
Tubos y gradilla para tubos de ensayo de 5mL.
Pipetas de vidrio o plástico Pasteur.
Frasco lavador o piseta.
Papel metálico de aluminio.
Papel Tissú o pañuelos desechables y papel toalla.
Ketamina 50 mg/mL inyectable.
Nitrito de sodio.
Ácido sulfanílico.
Ácido Fosfórico.
N-1-naftil etilendiamina.
Hidróxido de Sodio 1M.
Sulfato de Zinc al 30%.
Zinc en polvo.
EDTA Tetrasódico al 40%.
Rattus norvegicus macho.
Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.
1. Encender el espectrofotómetro y dejar que realice los pasos de prueba
interna.
2. Verificar que el espectrofotómetro se inicie con un 100 %T a 546 nm y dejar
calentar de 15 a 30 minutos antes de hacer las lecturas.
3. Reactivo de GRIESS A: pesar 100 mg de Ácido sulfanílico y transferir a un
matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL de Ácido fosfórico
concentrado y llevar a volumen con agua destilada mezclando por agitación
10 segundos.
4. Reactivo de GRIESS B: pesar 10 mg de N-1-naftil etilendiamina y transferir a
un matraz volumétrico de 10 mL, llevar a volumen con agua destilada
mezclando por agitación 10 segundos.
5. Solución STOCK: pesar 25 mg de Nitrito de sodio y transferir a un matraz
volumétrico de 25 mL, llevar a volumen con agua destilada y mezclar por
agitación 10 segundos.

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6. Solución PATRÓN: medir 0,25 mL de Solución STOCK de Nitrito de sodio y


transferir a un matraz volumétrico de 25 mL, llevar a volumen con agua
destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
7. Solución MUESTRA: medir 0,5 mL de Solución STOCK de Nitrito de sodio y
transferir a un matraz volumétrico de 25 mL, llevar a volumen con agua
destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
8. Solución MUESTRA BIOLÓGICA: extraer 4 mL de sangre de Rattus
norvegicus por punción cardiaca con jeringa de 5 mL con solución
anticoagulante y verter en un tubo de ensayo de 5 mL: tubo problema, en otro
tubo de ensayo de 5 mL adicionar 4 mL agua destilada: tubo Blanco,
centrifugar los dos tubos problema y blanco 5 minutos a 4500 rpm, a 1.6 mL
del sobrenadante o plasma del tubo problema adicionar 1.2 mL de agua
destilada, 0.2 mL de NaOH 1M y 0.2 mL de ZnSO4 30%, y a 1.6 mL del
sobrenadante del tubo blanco adicionar lo mismo, agitar 3 veces por 1minuto
y centrifugar 5 minutos a 4500 rpm. Medir en un tubo de ensayo de 5mL, 1.5
mL de plasma desproteinizado del tubo problema y agregar una alícuota de
zinc en polvo, hacer lo mismo con el tubo blanco, dejar en reposo por 30
minutos agitando cada 10 minutos, centrifugar 5 minutos a 4500 rpm.
9. Solución BLANCO: medir 0,5 mL de Reactivo de GRIESS A y transferir a un
matraz volumétrico de 10 mL, agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
10. Soluciones ESTÁNDAR:
1. Solución ESTÁNDAR 1: medir 0,05 mL de solución PATRÓN y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL
Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
2. Solución ESTÁNDAR 2: medir 0,1 mL de solución PATRÓN y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL
Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
3. Solución ESTÁNDAR 3: medir 0,2 mL de solución PATRÓN y transferir

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cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL


Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
4. Solución ESTÁNDAR 4: medir 0,4 mL de solución PATRÓN y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL
Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
5. Solución ESTÁNDAR 5: medir 0,8 mL de solución PATRÓN y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL
Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
6. Solución ESTÁNDAR 6: medir 1,2 mL de solución PATRÓN y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL
Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
7. Solución ESTÁNDAR 7: medir 1,6 mL de solución PATRÓN y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL
Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar
0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos,
llevar a volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
11. Solución ENSAYO: medir 0,4 mL de solución MUESTRA y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 10 mL, adicionar 0,5 mL
Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar reposar 5 minutos, adicionar 0,5
mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y dejar reposar 10 minutos, llevar a
volumen con agua destilada y mezclar por agitación 10 segundos.
12. Solución ENSAYO BIOLÓGICA: a 1.5 mL de plasma reducido de la
MUESTRA BIOLÓGICA del tubo problema y a 1.5 mL del sobrenadante del
tubo blanco, adicionar 0,5 mL Reactivo de GRIESS A agitar bien y dejar
reposar 5 minutos, adicionar 0,5 mL de Reactivo de GRIESS B agitar bien y
dejar reposar 5 minutos, centrifugar los dos tubos 5 minutos a 4500 rpm.

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13. Registrar las absorbancias por triplicado a λmáx = 546 nm de ESTÁNDARES


y ENSAYOS.

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Graficar el promedio de los datos de absorbancia versus la concentración de
las soluciones estándar.
2. Elaborar la curva de calibración y establecer la ecuación de la recta
experimental para la Ley de Beer.
3. Determinar la concentración de las soluciones ENSAYO con la ecuación de
la recta.

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Práctica 9
Titulación potenciométrica de un ácido débil

OBJETIVOS.
1. Obtener la gráfica del pH de la solución versus el volumen gastado de
solución titulante.
2. Realizar la gráfica de la primera derivada versus el volumen gastado de
solución titulante.
3. Determinar de forma gráfica el punto final en una valoración potenciométrica
utilizando datos de pH y volúmenes de la solución valorante normalizada.

FUNDAMENTO.
Una de las aplicaciones analíticas de la potenciometría es la medición del
potencial de una pila en el curso de una valoración, empleando la variación de
potencial para localizar el punto final. En el caso de una valoración ácido-base
se sigue la variación del pH; éste es definido en términos de la f.e.m. de la celda
E, como sigue:
(E - E 0 ) F
pH = pH 0 +
2.3026 RT
donde: pH0 y E0 son, respectivamente, el pH y la f.e.m. de una solución modelo
amortiguadora, F es el Faraday y R y T conservan su significado acostumbrado.
En la región del punto de equivalencia hay cambios de un céntuplo o mayores
en la concentración de las especies químicas involucradas, por lo que la
f.e.m. cambiará bruscamente permitiendo establecer con precisión el punto
final.
En el caso de titulaciones de ácidos y bases en medio acuoso para que los
análisis sean precisos deben ser satisfechos dos requisitos:
1. El ácido o base debe ser apreciablemente más fuerte que el agua como un
ácido o una base, respectivamente, y
2. La concentración del ácido o la base debe ser suficientemente mayor que la
del hidrógeno o (esencialmente) los iones hidroxilo del agua.
Un ácido débil reacciona en forma incompleta con una base fuerte y en el punto

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de equivalencia habrá alguna cantidad de base no neutralizada. Como resultado,


el pH en este punto es superior a 7 y la región característica del punto final es
corta. Es conveniente el uso de reactivos con una concentración de 0.1N,
siempre y cuando el volumen descargado pueda leerse con la precisión desea-
da. Excepto en los casos en que la reacción es relativamente incompleta, puede
lograrse un punto más definido de esta manera.
Si en la curva de valoración el punto final coincide con el de inflexión, también
debe coincidir con el máximo de la primera derivada, dpH/dV que es
prácticamente ΔpH/ΔV. El punto de inflexión puede encontrarse casi siempre con
facilidad, representando gráficamente la primera derivada de pH en función del
volumen (V) del titulante.

EQUIPOS Y REACTIVOS.

Potenciómetro o pH-Metro WTW pH 7310.


Es satisfactorio cualquier pH-Metro comercial cuya sensibilidad llegue hasta
un orden de 0.01 unidades de pH; equipado con electrodos de vidrio y de
calomel.
Agitador magnético y barra magnética.
Soluciones buffers o tampón de pH 4 y 7.
NaOH 0.1N estandarizado.

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Ácido ascórbico.
Fenolftaleína al 1%.

PROCEDIMIENTO.
1. Calibrar el pH-Metro con las soluciones buffers o tampón de pH conocido.
2. Disolver 150 mg de ácido ascórbico, pesados exactamente en 20 mL de agua
destilada recién hervida y fría en un vaso de precipitación de 50 mL, agregar
dos gotas de fenolftaleína al 1%, introducir la barra magnética y llevar todo
sobre el agitador magnético.
3. Sumergir el electrodo teniendo en cuenta que la barra magnética no lo roce
al girar y agitar moderadamente, en tales condiciones cuando la señal de
variabilidad en el DISPLAY desaparezca registrar el pH. Debe haber
suficiente solución, en todo tiempo, en el recipiente en el que se está
realizando la titulación, para cubrir la porción sensible de los electrodos.
4. Cargar la bureta con 25 mL de NaOH 0.1N estandarizado, empezar la
titulación y registrar el pH cada vez que se agrega la base. Inicialmente,
pueden agregarse grandes proporciones de solución titulante (posiblemente
5 mL); pero cerca del punto de equivalencia, las cantidades deben reducirse
a 0.1 o 0.05 mL y tener un volumen idéntico si va a hacerse una gráfica
ΔpH/ΔV, a fin de obtener la máxima precisión al obtener varios puntos en esa
región; mientras más grande sea la pendiente en el punto final, más
pequeños deben ser los incrementos.
5. Después de cada adición, debe permitirse un tiempo breve para obtener la
mezcla y la respuesta. La magnitud del período dependerá fuertemente de
factores tales como la velocidad de agitación, el volumen de la solución, la
ubicación del electrodo indicador y la naturaleza del punto de contacto.
Posiblemente 30 segundos sea un margen apropiado para lograr el equilibrio
en la mayoría de las titulaciones manuales. Una regla razonable es, esperar
hasta que la lectura de pH no cambie más de 0.02 de unidad de pH por
minuto.

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Elaborar un cuadro con los datos obtenidos en la experiencia realizada,
donde se consigne: N°, mL de NaOH, pH, ∆mL, ∆pH, ∆pH/∆mL y T°C.

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2. Graficar el pH de la solución vs el volumen de la solución titulante.


3. Graficar por lo menos 5 datos de ΔpH/ΔV antes y después del valor máximo
en la región de equivalencia vs el correspondiente volumen de la solución
titulante.
4. Localizar el punto final mediante la gráfica del ítem anterior.

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Práctica 10
Titulación potenciométrica de una base débil

OBJETIVOS.
1. Obtener la gráfica del pH de la solución versus el volumen gastado de
solución titulante.
2. Realizar la gráfica de la primera derivada versus el volumen gastado de
solución titulante.
3. Determinar de forma gráfica el punto final en una valoración potenciométrica
utilizando datos de pH y volúmenes de la solución valorante normalizada.

FUNDAMENTO.
Una de las aplicaciones analíticas de la potenciometría es la medición del
potencial de una pila en el curso de una valoración, empleando la variación de
potencial para localizar el punto final. En el caso de una valoración ácido-base
se sigue la variación del pH; éste es definido en términos de la f.e.m. de la celda
E, como sigue:
(E - E 0 ) F
pH = pH 0 +
2.3026 RT
donde: pH0 y E0 son, respectivamente, el pH y la f.e.m. de una solución modelo
amortiguadora, F es el Faraday y R y T conservan su significado acostumbrado.
En la región del punto de equivalencia hay cambios de un céntuplo o mayores
en la concentración de las especies químicas involucradas, por lo que la
f.e.m. cambiará bruscamente permitiendo establecer con precisión el punto
final.
En el caso de titulaciones de ácidos y bases en medio acuoso para que los
análisis sean precisos deben ser satisfechos dos requisitos:
1. El ácido o base debe ser apreciablemente más fuerte que el agua como un
ácido o una base, respectivamente, y
2. La concentración del ácido o la base debe ser suficientemente mayor que la
del hidrógeno o (esencialmente) los iones hidroxilo del agua.
Una base débil reacciona en forma incompleta con un ácido fuerte y en el punto

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de equivalencia habrá alguna cantidad de ácido no neutralizado. Como


resultado, el pH en este punto es inferior a 7 y la región característica del punto
final es corta. Es conveniente el uso de reactivos con una concentración de 0.1N,
siempre y cuando el volumen descargado pueda leerse con la precisión desea-
da. Excepto en los casos en que la reacción es relativamente incompleta, puede
lograrse un punto más definido de esta manera.
Si en la curva de valoración el punto final coincide con el de inflexión, también
debe coincidir con el máximo de la primera derivada, dpH/dV que es
prácticamente ΔpH/ΔV. El punto de inflexión puede encontrarse casi siempre con
facilidad, representando gráficamente la primera derivada de pH en función del
volumen (V) del titulante.

EQUIPOS Y REACTIVOS.

Potenciómetro o pH-Metro WTW pH 7310.


Es satisfactorio cualquier pH-Metro comercial cuya sensibilidad llegue hasta
un orden de 0.01 unidades de pH; equipado con electrodos de vidrio y de
calomel.
Agitador magnético y barra magnética
Soluciones buffers o tampón de pH 4, 7 y 10.
H2SO4 0.1N estandarizado.

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Bicarbonato de sodio NaHCO3.


Indicador anaranjado de metilo

PROCEDIMIENTO.
1. Calibrar el pH-Metro con las soluciones buffers o tampón de pH conocido.
2. Disolver 75 mg de bicarbonato de sodio, pesados exactamente en 20 mL de
agua destilada en un vaso de precipitación de 50 mL, agregar dos gotas de
indicador anaranjado de metilo, introducir la barra magnética y llevar todo
sobre el agitador magnético.
3. Sumergir el electrodo teniendo en cuenta que la barra magnética no lo roce
al girar y agitar moderadamente, en tales condiciones cuando la señal de
variabilidad en el DISPLAY desaparezca registrar el pH. Debe haber
suficiente solución, en todo tiempo, en el recipiente en el que se está
realizando la titulación, para cubrir la porción sensible de los electrodos.
4. Cargar la bureta con 25 mL de H2SO4 0.1N estandarizado, empezar la
titulación y registrar el pH cada vez que se agrega el ácido. Inicialmente,
pueden agregarse grandes proporciones de solución titulante (posiblemente
5 mL); pero cerca del punto de equivalencia, las cantidades deben reducirse
a 0.1 o 0.05 mL y tener un volumen idéntico si va a hacerse una gráfica
ΔpH/ΔV, a fin de obtener la máxima precisión al obtener varios puntos en esa
región; mientras más grande sea la pendiente en el punto final, más
pequeños deben ser los incrementos.
5. Después de cada adición, debe permitirse un tiempo breve para obtener la
mezcla y la respuesta. La magnitud del período dependerá fuertemente de
factores tales como la velocidad de agitación, el volumen de la solución, la
ubicación del electrodo indicador y la naturaleza del punto de contacto.
Posiblemente 30 segundos sea un margen apropiado para lograr el equilibrio
en la mayoría de las titulaciones manuales. Una regla razonable es, esperar
hasta que la lectura de pH no cambie más de 0.02 de unidad de pH por
minuto.

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Elaborar un cuadro con los datos obtenidos en la experiencia realizada,
donde se consigne: N°, mL de H2SO4, pH, ∆mL, ∆pH, ∆pH/∆mL y T°C.

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2. Graficar el pH de la solución vs el volumen de la solución titulante.


3. Graficar por lo menos 5 datos de ΔpH/ΔV antes y después del valor máximo
en la región de equivalencia vs el correspondiente volumen de la solución
titulante.
4. Localizar el punto final mediante la gráfica del ítem anterior.

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Práctica 11
Cromatografía en columna CC

OBJETIVOS.
1. Introducir en las sofisticadas técnicas de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) y cromatografía de gases (GC).
2. Utilizar las técnicas de separación de cromatografía líquida en capa fina y
columna.
3. Separar de los componentes de un extracto fluido preparado en el laboratorio.

FUNDAMENTO TEÓRICO.
La cromatografía en columna es la técnica de separación e identificación de
sustancias químicas, por la diferente retención que experimentan los
componentes de una mezcla, al ser más o menos adsorbidos por los
componentes de una fase fija situada en una columna, cuando son arrastrados
por un fluido (fase móvil). Si la fase móvil es líquida hablamos de cromatografía
líquida y si es gas será cromatografía de gases. El adsorbente, suele ser gel de
sílice o alúmina, pero pueden ser otros. Intervienen los fenómenos de adsorción
y disolución, por consiguiente, es fundamental tener en cuenta la polaridad, tanto
de las sustancias a arrastrar como del disolvente, si queremos tener una buena
separación.
El disolvente al descender arrastra las sustancias a distinta velocidad según la
mayor o menor retención que experimenten, y salen de la columna a distinto
tiempo. La técnica, en forma generalizada, comprende:
Preparación del disolvente.
Preparación de la columna.
Desarrollo del cromatograma.
Estudio del tiempo de retención.
Revelado de las sustancias separadas, si no son visibles.
El tiempo de retención es un parámetro útil porque es constante cuando se
reproduce el experimento en todas las condiciones, se pone en tablas y sirve

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para identificar compuestos; es fundamental en Cromatografía Líquida de Alta


Resolución (HPLC) y en Cromatografía de Gases (GC).

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.


Balanza electrónica de precisión 0.1 g.
Bureta de 25 mL como columna.
Embudo mediano de vástago largo.
Matraz Erlenmeyer de 125 mL.
Vaso de precipitado de 100 y 250 mL.
Luna de reloj pequeña.
Soporte universal y pinzas.
Probeta de 100 mL.
Pipeta de 5 mL y propipeta.
Frasco lavador de 500 mL.
Agitador de vidrio.
Capilares sin heparina.
Cromatoplaca de 4 X 10
Torunda de algodón.
Silica gel 60, 230-400 mesh
Extracto fluido de corteza y tallo.
Hexano, Tolueno, Diclorometano, Cloroformo, Eter dietílico, Acetato de etilo,
Acetona, Butanol, Etanol, Metanol, Ácido acético glacial, Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.
Preparación de la columna
Se toma una bureta como columna, se sujeta en el soporte con las pinzas. Se
engrasa la llave y se mantiene en posición de cerrado. Se introduce hasta el
fondo un pequeño trozo de algodón ayudándose con la varilla de vidrio, se
agregan 3 ml del eluyente más apropiado encontrado en la cromatografía en
capa fina y se presiona suavemente el algodón para que quede bien colocado y
sin burbujas, se prepara una suspensión de 7,5 g de Sílica Gel 60, 230-400 mesh
en 25 mL del eluyente apropiado y se agita durante 5 minutos para eliminar las
burbujas. A través del embudo se vierte la suspensión en la columna golpeando
ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme. Se abre la llave

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para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la Gel


de Sílice. Se podría haber empaquetado en seco, pero teniendo cuidado de que
no queden espacios vacíos, y luego pasarle el eluyente.
Preparación del eluyente (disolvente de arrastre)
El eluyente empleado es butanol/ácido acético/agua (4:1:5), se preparan unos
100 mL y se lava la columna con el disolvente.
Preparación de la mezcla a separar
De lo obtenido en la cromatografía en capa fina el extracto fluido de corteza y
tallo puede ser puro o diluido con eluyente.
Desarrollo o elución
Cuando el eluyente haya descendido 0,5 cm de la parte superior del relleno, se
añaden dos gotas de la mezcla a eluir. Se pone una pequeña bolita de algodón
en la parte superior de la columna y a continuación se añade eluyente,
manteniendo el nivel varios centímetros por encima del relleno. Al desarrollarse
la cromatografía, se separan las fracciones, que se recogen en distintos
matraces o viales, contando el tiempo que tarda cada componente en salir
(tiempo de retención). Si algún componente no sale puede arrastrarse,
añadiendo al eluyente ácido acético diluido.

UTILIZACIÓN DE DATOS.
1. Dibujar o fotografiar claramente en la columna cromatográfica las
separaciones coloreadas de los componentes del extracto fluido de corteza y
tallo.
2. Realizar esquemas de las distancias recorridas cada intervalo de tiempo (20-
25 minutos) de los componentes separados del extracto fluido de corteza y
tallo.
3. Identificar el tiempo de retención de cada fracción separada.
4. Separar, rotular e identificar en viales los componentes de cada fracción para
su posterior caracterización.

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Práctica 12
Determinación de Acetaminofeno en tabletas
por HPLC

OBJETIVOS.
1. Identificar un ingrediente farmacéuticamente activo: Acetaminofeno en
tabletas, mediante cromatografía liquida de alta performancia o HPLC.
2. Determinar el contenido de un ingrediente farmacéuticamente activo:
Acetaminofeno en tabletas, por cromatografía líquida de alta performancia o
HPLC.

FUNDAMENTO.
La cromatografía en columna brinda la posibilidad de identificar y cuantificar los
componentes de una mezcla si previamente se ha establecido los requisitos para
una óptima resolución o separación; esto implica entre otras operaciones pre y
pos cromatográficas, establecer la fase móvil y flujo adecuado.

La identificación se basa en el tiempo de retención (tR) del componente, para lo


cual se debe contar con el compuesto estándar. Una vez obtenidos los
cromatogramas para el estándar y la muestra respectivamente, si el parámetro
de comparación (tR) coincide para ambos; se concluye que se trata del mismo
compuesto.

La cuantificación se sustenta en las áreas bajo la curva del componente, para lo


cual se debe contar con el compuesto estándar. Una vez obtenidos los
cromatogramas para estándar y muestra respectivamente, se relaciona las áreas
bajo la curva y se obtiene la concentración de la muestra.

Según la USP 37 NF 32: “las tabletas Acetaminofeno contienen no menos de


90.0 % y no más de 110.0 % de la cantidad declarada de Acetaminofeno”.

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EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS.

1 cromatógrafo líquido de alta performancia HPLC Chromaster Hitachi.


1 bomba de vacío con embudo para filtración cromatográfica.
1 columna cromatográfica C18 de 4.6 mm X 12.5 cm L1.
10 mg Estándar secundario de Acetaminofeno.
0.5 blíster de diez tabletas de Acetaminofeno.
4 matraces volumétrico o fiolas de 10 mL.

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2 pipetas de 0.1 mL o 1 micropipeta de 0.1mL con 2 puntas.


2 pipetas de 1mL o 1 micropipeta de 1 mL con 2 puntas.
1 filtros de 0.45 um.
2 filtros de jeringa de 0.45 um.
2 jeringas hipodérmicas de 5 mL.
2 viales de 2 mL para cromatografía.
1 balanza analítica mínimo de 4 dígitos decimales.
2 frascos de 1L para fase móvil
1 sonicador y 1 mortero con pilón.
1 probeta de 250 mL.

PROCEDIMIENTO.
1. Fase Móvil: Preparar una cantidad adecuada de una mezcla desgasificada
de metanol en agua ultrapura (1:3).

2. Preparación estándar: Disolver una cantidad exactamente pesada de


Estándar secundario de Acetaminofeno en la fase móvil para obtener una
concentración conocida de aproximadamente 0.01 mg por mL.

3. Preparación de muestra: Pesar y pulverizar no menos de 5 tabletas.


Transferir una porción de polvo exactamente pesado, equivalente a
aproximadamente 10 mg de Acetaminofeno y colocarlo en un matraz
volumétrico de 10 mL, adicionar aproximadamente 5 mL de Fase móvil, llevar
a sonicador por 5 min, diluir a volumen con la fase móvil, y mezclar. Transferir
0.1 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 10 mL, diluir con fase
móvil a volumen y mezclar. Filtrar una porción de esta solución a través de
un filtro de jeringa de 0.45 um, en jeringa hipodérmica de 5 mL descartando
los primeros 3 mL del filtrado. Colocar los 2 mL del filtrado limpio dentro del
vial de 2 mL y tapar, esta es nuestra Preparación de muestra.

4. Sistema cromatográfico: El Cromatógrafo líquido es equipado con un detector


a 243 nm y una columna de 4.6 mm x 12.5 cm, que contiene parking L1. El
rango de flujo es aproximadamente de 1 mL por minuto. La eficiencia de la
columna no es menor de 1000 platos teóricos; el factor de asimetría no es

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mayor de 2; y la desviación estándar relativa para inyecciones repetidas no


es mayor de 2 %.

5. Procedimiento: Inyectar separadamente volúmenes iguales


(aproximadamente 10 uL) de la Preparación estándar y de la Preparación de
muestra dentro del cromatógrafo, registrar los cromatogramas, y medir las
respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en mg, de
Acetaminofén (C8H9NO2) en la porción de tabletas tomada, usando por
fórmula:

1000 C ( ru / rs )

6. En la cual C es la concentración, en mg por mL, de Estándar secundario de


Acetaminofeno en la Preparación estándar, y ru y rs son las respuestas de los
picos obtenidos a partir de la Preparación de muestra y la Preparación
estándar, respectivamente.

UTILIZACIÓN DE DATOS
1. Identificar el tR para el acetaminofén en el cromatograma del Estándar y la
Muestra. Asimismo, comparar los tiempos de retención si se corresponden
entre sí.
2. Determinar el contenido en porcentaje de acetaminofeno en las tabletas
analizadas.

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