La preparación de la muestra es uno de los pasos más cruciales, aunque

problemáticos, para la resolución de alta calidad de proteínas en 2-DE. La

mayoría de los problemas se pueden remontar a la coextracción de
componentes celulares no proteicos que pueden afectar las migraciones de
proteínas [18].
Los tejidos vegetales son ricos en compuestos que interfieren con 2-DE. Estos
compuestos interferentes, por ejemplo, polifenoles, terpenos y ácidos
orgánicos, se acumulan principalmente en vacuolas en diversas formas
solubles, y son más abundantes en tejidos verdes que en plántulas jóvenes o
material etiolado [3]. Por lo general, existen dos estrategias principales para
eliminar estos contaminantes: (i) eliminación antes de la extracción de
proteínas y (ii) eliminación después de la extracción de proteínas. La hoja de
olivo contiene altos niveles de compuestos que interfieren. La
homogeneización directa del tejido de la hoja de olivo en diversos tampones
de extracción, seguida de la precipitación del disolvente orgánico, siempre da
como resultado un sedimento pardusco difícil de procesar. Por lo tanto, en el
caso de la hoja de olivo, es necesario eliminar completamente los
contaminantes del tejido foliar antes de la extracción de la proteína.
La eliminación convencional de contaminantes no proteicos implica el uso de
disolventes orgánicos (por ejemplo, acetona, 10% de TCA en acetona) para
lavar los contaminantes del polvo tisular [6]. En gran medida, la eficacia de
eliminación depende de la finura del polvo de tejido. Según nuestra
experiencia, cuanto más fino sea el polvo, más exhaustivamente se eliminará
el contaminante. Por lo tanto, en lugar de triturar convencionalmente tejido
vegetal en N2 líquido una vez, molturamos adicionalmente el polvo de acetona
seco por segunda vez. Después de los dos lavados de acetona iniciales, el polvo
de tejido secado al aire resultante se vuelve bastante frágil y, por lo tanto, es
fácil de triturar hasta obtener un polvo más fino. Otra modificación notable de
nuestro protocolo es que, después de lavados con 10% de TCA / acetona,
utilizamos TCA acuoso al 10% para eliminar contaminantes solubles en agua,
que de otro modo se copurificaría con proteínas hasta el paso final y no podría
eliminarse mediante extracción con fenol posteriormente. En nuestras manos,
la molienda adicional y el lavado con TCA acuosa han demostrado ser muy
efectivos en la eliminación de contaminantes. Después de extensos lavados
con disolventes orgánicos, el polvo de hojas se puede extraer directamente en
tampón Laemmli [10] para SDS-PAGE, pero en esta etapa todavía contiene
contaminantes residuales que interferiría con 2-DE (Fig. 3e). Por lo tanto, la
extracción con fenol se lleva a cabo para minimizar aún más la presencia de
estos contaminantes en los extractos proteicos.

Extraemos proteínas del polvo seco de hoja de olivo con una mezcla de fenol
y tampón de SDS denso. Con un 30% de sacarosa, el tampón de extracción SDS
es más pesado que el fenol Trisbuffered, por lo que durante la fase de
separación, la fase de fenol se "empuja" hacia arriba, lo que facilita la
extracción de la fase de fenol. El fenol disuelve las proteínas (incluidas las
proteínas de membrana) y los lípidos que dejan sustancias solubles en agua
(hidratos de carbono, ácidos nucleicos, etc.) en la fase acuosa, por lo que las
proteínas en fase fenólica se purifican y concentran junto con la posterior
precipitación de metanol. Otra ventaja de la extracción de fenol es que
minimiza la degradación de proteínas que a menudo se encuentra durante la
preparación de la muestra, debido a la actividad proteolítica endógena [19].
Como se muestra en la Fig. 5, el anticuerpo antitirosinato \ beta - tubulina
detecta una banda principal en la transferencia de 1 - DE o cuatro puntos
principales en la transferencia de 2 - DE alrededor de 55 kDa, y no se detectan
productos degradados de la \ beta - tubulina, lo que indica que protocolo
puede inhibir eficazmente la degradación de proteínas in vitro. Después de la
extracción con fenol, preferimos precipitar proteínas con acetato de amonio
metanólico frío a? 20? C durante 30 minutos para acortar el protocolo, ya que
no se encuentran diferencias significativas en el rendimiento de proteínas y en
los perfiles electroforéticos entre 30 min, 2 h incubación a \ sim 20ºC (no
mostrado).
SDS es un excelente agente solubilizante, que permite la recuperación de
proteínas unidas a la membrana. Descubrimos que la extracción de fenol / SDS
es más poderosa que densa SDS buffer y solo fenol. Además, el
comportamiento de la separación de fases de la mezcla de fenol / SDS depende
en gran medida de la concentración de SDS. Bajo 5% SDS, el
la mezcla separa aproximadamente el mismo volumen de fase de fenol y fase
acuosa después de la centrifugación; de 5-7% SDS, el volumen de la fase de
fenol aumenta, y no se produce separación de fases por encima del 8% de SDS.
Además, las pérdidas de proteína pueden minimizarse durante las etapas de
lavado cuando el sobrenadante se pipetea a partir de microtubos en lugar de
decantar el sobrenadante en el caso de tubos de centrífuga grandes. Por lo
tanto, aunque hay un número de etapas de lavado involucradas en este
protocolo, el rendimiento de proteína final es relativamente alto (2.49 mg \
mu g \ cdot 1 hoja envejecida fresca). Desafortunadamente, la concentración
de proteína en hojas recién envejecidas no está posiblemente determinada
debido a la presencia de compuestos que interfieren.

Por el protocolo descrito aquí, siempre obtuvimos resultados similares en

diferentes lotes de extracción de proteína de hoja de olivo, siendo el
polipéptido de 55 kDa (Rubisco) el componente más abundante en geles 1-DE
y 2-DE. La extracción de fenol / SDS muestra una alta coincidencia punto a
punto entre diferentes geles 2-DE de proteínas de hoja de olivo a partir de dos
extracciones independientes (Fig. 2a y Fig. 3b). Es necesario tener en cuenta
que los cambios en las intensidades puntuales entre la Fig. 2a y la Fig. 3b
probablemente resulten del crecimiento diferente de la hoja porque las hojas
utilizadas se recolectaron a mediados de enero y mediados de abril,
respectivamente. Además, el protocolo nos permite presentar muchos más
números de bandas polipeptídicas bien resueltas en gel 1-DE que las
informadas previamente por Garcia et al. [4]. También notamos que el
destacado polipéptido Rubisco no siempre está disponible en sus extractos
foliares [4], aunque esta discrepancia podría deberse a los diferentes métodos
de extracción y a los diferentes genotipos utilizados.
En el presente estudio, preferimos ejecutar mini-2-DE, con IEF de primera
dimensión usando Immobiline DryStrip de 7 cm resuelto en el sistema
Multiphor II y SDS-PAGE de segunda dimensión usando minigel en un mini-
Protean de Bio-Rad II aparato. Las ventajas de esta combinación incluyen (i)
rápida (3 h IEF, 1 h SDS-PAGE), (ii) conveniente para la aplicación aguas abajo
(p. Ej., Gel de tinción y transferencia), (iii) patrones comparables de geles y
transferencias con 1-DE debido al mismo tamaño, (iv) menos cargas de
proteínas pero sin pérdida significativa de resolución, y finalmente (v) bajo
costo en comparación con 2-DE que usa Immobiline DryStrips de 11 o 18 cm.

La tubulina existe en todas las células como un heterodímero de dos

polipéptidos similares pero no idénticos (aproximadamente 55 kDa),
designados como? y?, y funciona como el principal componente de
microtúbulos. Tanto? - como? -tubulinas consisten en varios isotipos y se
someten a modificaciones postraduccionales, que incluyen acetilación,
tirosinación, destyrosinación, poliglicilación y poliglutamilación [20]. Por lo
tanto, elegimos? -tubulina como un indicador para evaluar las
inmunotransferencias de los extractos de hoja de olivo preparados por nuestro
protocolo. Como en el tabaco [21] y el maíz (papel en preparación), en el tejido
de hoja de olivo la \ beta - tubulina se modifica altamente
postraduccionalmente con tirosinación y al menos cuatro isotipos de
tirosinato \ beta - tubulina con pI similares pueden resolverse en transferencia
2 - D (Fig. 5b).
En resumen, mediante el protocolo descrito aquí, conseguimos aislar
proteínas de alta calidad de hojas viejas y jóvenes (datos no mostrados) de los
olivos. Los geles e inmunoblots 1-DE y 2-DE resultantes tienen una alta calidad,
sin manchas ni estrías. El presente estudio muestra por primera vez los
patrones de proteína 1-DE y 2-DE bien resueltos de hoja de olivo. El mayor
inconveniente del protocolo es su tiempo relativamente largo (3 h). Se espera
que nuestro protocolo también se pueda aplicar a otros tejidos de plantas
recalcitrantes, a pesar de que las diferentes plantas pueden variar
considerablemente en las cantidades y tipos de compuestos interferentes que
producen.