PRÁCTICA N° 11: CROMATOGRAFIA EN COLUMNA.

SEPARACION DE UNA MEZCLA AZUL

VICTORIA / NARANJA DE METILO

INTRODUCCIÓN

La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla
debido a la influencia de dos efectos contrapuestos: a) Retención. Efecto producido sobre los
componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado
a un soporte sólido; b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por
una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.

El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria,

impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla a separar se deposita sobre la
fase estacionaría, mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la
mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas
fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo
distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente
retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario
los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como
consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas
discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Existen distintos tipos de cromatografía en columna:

Cromatografía de intercambio iónico: se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios
de polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria.

Cromatografía de exclusión: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para

separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas.

Cromatografía de afinidad: se fundamenta en la especificidad de algunas macromoléculas

biológicas. Éstas se unen específicamente a la fase estacionaria y para separar dicha
macromolécula, bastará con variar el pH una vez que la columna este limpia y sólo se encuentre de
interés.

Cromatografía de adsorción: se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de

los compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se
determinan casi exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que
la fase móvil.

Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra

vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas
(cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía
de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. La
cromatografía de gases (GC) y de alta resolución (HPLC) son técnicas de partición ampliamente
empleadas.

Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de interacciones

hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en
la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la
interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iníciales de
unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un
grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando
inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área
hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de agua
disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema.

El proceso de cromatografía en columna consta de tres pasos:

a) Preparación de la columna: Empaquetamiento de la fase estacionaria en la columna. Se prepara

una suspensión del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase móvil) y se vierte en el interior
de la columna.

b) Siembra de la muestra: La muestra se deposita (“siembra”) en la superficie superior del adsorbente

contenido en la columna con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es líquida se puede sembrar
directamente, si es sólida se siembra una solución concentrada de la misma en un disolvente
adecuado (de baja polaridad).

c) Desarrollo/Elución de la columna: Una vez sembrada la muestra se permite el paso de la fase

móvil a través de la fase estacionaria y se van recogiendo fracciones consecutivas del eluyente, que
serán examinadas posteriormente para determinar su composición.

El naranja de metilo es un colorante azoico (los azo-derivados contienen el agrupamiento –N=N-,

son compuestos intensamente coloreados y muchos se emplean como colorantes) que se utiliza
como indicador ácido-base y es amarillo en medio básico y rojo en medio ácido. El violeta cristal es
un colorante derivado del trifenilmetano. Ambos compuestos son muy polares y sus estructuras son:

+ -
HN (CH 3)2 Cl

C
(CH3)2 N N N

NH
NH (CH 3)2
- +
SO3 Na

Azul Victoria Naranja de Metilo

MATERIALES Y REACTIVOS

 Montaje para cromatografía de  1 Pipeta de Pasteur

columna  1 Vidrio de reloj
 5 Tubos de ensayo  Algodón
 1 Embudo de caña  Arena
 1 Beaker  80 mL de Agua destilada
 1 Erlenmeyer  70mL de Etanol 98%
 5gr de Alúmina  2 mL de Solución preparada de azul
 1 Varilla de vidrio victoria y naranja de metilo (1/1).

PROCEDIMIENTO
Se sujeta la columna, en posición vertical, a un soporte utilizando dos pinzas: una cerca de la llave
y otra en la parte superior y se introduce un pequeño copo de algodón en su extremo inferior. Se
coloca un Erlenmeyer debajo de la columna y un embudo en la parte superior.

Llene la columna con etanol hasta el fondo del embudo. Prepare una mezcla de 4,0gr de alúmina y
8 mL de etanol en un vaso pequeño. Agite la mezcla suavemente para eliminar burbujas de aire y
vierta rápidamente al embudo. Raspe el sólido que queda en el embudo. Luego de añadir la alúmina
a la columna, abra la llave y permita que el disolvente se escurra lentamente a un matraz Erlenmeyer.
Use el etanol que baje para enjuagar el vaso con la alúmina. Según se añade la alúmina, dele golpes
suaves a la columna, con la parte de goma de su agitador de vidrio, para que el empaque se
acomode, sin dejar espacio vacios. Coloque una capa fina de arena sobre este empaque.

Ajuste la altura para que, debajo, pueda alinear una serie de 4 tubos de ensayo colocado en la
gradilla. Estos servirán para recoger sus fracciones. Rotúlelos N°1, N°2, N°3 y N°4.

Permita que empiece un goteo moderado de solvente y recoja este en el tubo de ensayo N°1.
Durante este proceso, siga añadiendo disolvente, según sea necesario, para evitar que nunca se
seque la superficie superior de la columna.

Dejar que casi se acabe el disolvente y añada 3 gotas de la mezcla de tintes al tope de la columna.
Añada etanol y comience a recoger en el tubo N°1 hasta que vea que empieza a salir líquido con
color. En ese punto, cambie le tubo y empiece a recoger la primera fracción con color en el tubo de
ensayo N°2. Añada etanol, según sea necesario para evitar que se seque la columna y siga
recogiendo esta fracción hasta que vea que las gotas salen incoloras. ( para notar esto mejor,
coloque un papel blanco detrás de las gotas que van cayendo).

Cambie entonces al tubo de ensayo N°3 y empiece a añadir agua hasta que el líquido eluido tenga
color nuevamente. Cambie ahora al tubo de ensayo N°4 y recoja la fracción del último tinte, siempre
añadiendo agua para que se eluya este.

RESULTADOS

Mida y reporte el volumen de cada fracción y analice la separación obtenida