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LABORATORIO DE MET. ANALISIS
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INFORME N° 07
DETERMINACION DE PROTEINAS
POR EL METODO “KJELDAHL”

i. INTRODUCCION:
El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla
compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o
lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para
determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza
empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína
pero dicho método se utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido
a que es dificultoso y poco práctico

En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado

en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la
determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y
otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico
en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte mediante
esta digestión en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una
base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido
bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl (o
H2SO4) estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en la muestra.
El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína
cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no
proteicos.

El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó

permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión),
sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo
se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utili|
zando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso
añadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico
utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción.
En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado
CuSO4.5H2O como catalizador.

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ii. OBJETIVOS:

 Conocer la cantidad de nitrógeno total y proteína total de una muestra alimenticia

 Conocer la practica por el método kjeldahl
 Comprender los fundamentos del método Kjeldahl para la determinación del
contenido en proteína de un alimento.
 Conocer el procedimiento experimental del análisis de proteínas por el método
de Kjeldahl, recogiendo el nitrógeno sobre ácido bórico y valorándolo con una
disolución de ácido clorhídrico o sulfúrico.
 Calcular el porcentaje de proteína de un alimento a partir del contenido de
nitrógeno obtenido por el método Kjeldahl.

III. REVISION BIBLIOGRAFICA

3.1.-PROTEINAS:
Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente
distribuidos en el organismo y esenciales para la vida. Actúan como
elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de
enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc.
La proteína más abundante en plasma es la albúmina. Una de sus funciones
más importantes es la de permitir el transporte de ácidos grasos, hormonas
esteroides, bilirrubina, catecolaminas, que en forma libre son insolubles en
medio acuoso.

La concentración de albúmina en plasma influye notablemente en el

mantenimiento de la presión coloidosmótica, lo que estaría relacionado con
su relativamente bajo peso molecular y su gran carga neta.
En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones
prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en
otras como mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y
hemoconcentraciones de diversos orígenes, se observan hiperproteinemias.

En general, ambas situaciones se ven acompañadas también por

hipoalbuminemias. Los aumentos anormales de albúmina son ocasionales y
se relacionan casi siempre con deshidratación que produce el consecuente
aumento en el contenido proteico del plasma Wilforth (1885 ).

3.1.1.-FUNCIONES:

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las

moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas).
Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la
presencia o la actividad de este tipo de moléculas. Bastan algunos
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ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las

funciones que desempeñan. Son proteínas:
 Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en
organismos vivientes;
 Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares;
 La hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en
la sangre;
 Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra
infecciones o agentes patógenos;
 Los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces
de desencadenar una respuesta determinada;
 La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del
músculo durante la contracción;
 El colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de
sostén.

3.1.2.- CLASIFICACION:
 - Catálisis: Está formado por enzimas proteicas que se encargan de
realizar reacciones químicas de una manera más rápida y eficiente.
Procesos que resultan de suma importancia para el organismo. Por
ejemplo la pepsina, esta enzima se encuentra en el sistema digestivo y
se encargan de degradar los alimentos.
 - Reguladoras: Las hormonas son un tipo de proteínas las cuales
ayudan a que exista un equilibrio entre las funciones que realiza el
cuerpo. Tal es el caso de la insulina que se encarga de regular
la glucosa que se encuentra en la sangre.
 - Estructural: Este tipo de proteínas tienen la función de
dar resistencia y elasticidad que permite formar tejidos así como la de
dar soporte a otras estructuras. Este es el caso de la tubulina que se
encuentra en el citoesqueleto.
 - Defensiva: Son las encargadas de defender al organismo.
Glicoproteínas que se encargan de producir inmunoglobulinas que
defienden al organismo contra cuerpos extraños, o la queratina que
protege la piel, así como el fibrinógeno y protrombina que forman
coágulos.
 - Transporte: La función de estas proteínas es llevar sustancias a
través de todo el organismo donde son requeridas. Proteínas como la
hemoglobina que lleva el oxígeno por medio de la sangre.
 - Receptoras: Este tipo de proteínas se encuentran en la membrana
celular y llevan a cabo la función de recibir señales y para que la célula
así pueda realizar su función. El acetilcolina que recibe señales para
producir la contracción muscular.

3.2.-METODO KJELDAHL
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El método Kjeldahl mide el contenido en nitrógeno de una muestra. El

contenido en proteína se puede calcular seguidamente, presuponiendo una
proporción entre la proteína y el nitrógeno para el alimento específico que está
siendo analizando, tal y como explicaremos más adelante. Este método puede
ser dividido, básicamente en 3 etapas: digestión o mineralización, destilación y
valoración. El procedimiento a seguir es diferente en función de si en la etapa
de destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre una disolución de ácido
bórico o sobre un exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico patrón. Ello
condicionará la forma de realizar la siguiente etapa de valoración, así como los
reactivos empleados. En este artículo docente se explica el primer
procedimiento, cuando el nitrógeno se atrapa sobre ácido bórico

3.2.1.- ETAPAS:

(a) ETAPA DE DIGESTIÓN:

Un tratamiento con ácido sulfúrico concentrado, en presencia de un catalizador y
ebullición convierte el nitrógeno orgánico en ión amonio, según la ecuación 1.
catalizadores/ calor
n - C -NH2 + H2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 (ec. 1)

(b) ETAPA DE DESTILACION:

se alcaliniza la muestra digerida y el nitrógeno se desprende en forma de
amoniaco (ecuación 2). El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso
desconocido de ácido bórico (ecuación 3).

(NH2)SO4 + 2 NaOH ----------------→ 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (ec. 2)

NH3 + H3BO3 --------------------------→ NH4 + H2BO3 - (ec. 3)

2.3.- FACTOR
Este factor de conversión está tabulado para cada grupo de alimentos. En la
tabla 1 se recogen los factores para algunos alimentos.

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medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los
nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables
de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos
vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el
medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan
desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya
preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El
objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación,
multiplicación. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de
cultivo diferentes.
Un medio de cultivo es cualquier sustancia cuyo interior o sobre la cual
pueden desarrollarse los microorganismos en el laboratorio.
El desarrollo o cosecha de microorganismos obtenidos en el medio se
denomina cultivo, cuando los microorganismos de un cultivo son de la misma
especie, se dice que es un cultivo puro; cuando dos o más especies de
microorganismos se desarrollan en un medio, se le conoce con un cultivo
mixto; si un cultivo contiene accidentalmente más de una especie de
microorganismos, se habla de un cultivo contaminado. (Coloma, 2003)

2.3.- Composición de un Medio de cultivo

 Sustancias nutritivas apropiadas (proteínas, carbohidratos, sales

minerales, agua, etc.)
 Tener un pH conveniente; generalmente de 6.8 a 7.6
 Estar previamente esterilizados.
 Estar protegidos de contaminación. (Coloma, 2003)
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2.4.- Finalidad de los medios de cultivo

 Aislamiento de gérmenes
 Identificación
 Conservación de bacterias
 Clasificación
 Obtención de toxinas
 Recolección o cosecha para preparación de vacunas. (Coloma, 2003)

2.5.- Arobios mesofilos:

Son atodos aquiellas bacterias mesofilas capaces de crecer en agar
nutritivo se investigación por el método de recunetro en placa con simbreas
en profundidad que se basa en recuento en placas. Los arobios mesofilos
se encuentra en alimentos congelados y en los conservadores en
refrigeración.
 Los resultados de estos alimentos permiten:
 Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección
 Determina el origen de la contaminación durante los procesos de
elaboración de los alimentos
 Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte
 Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos
2.6.- Coliformes
La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies
bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e
importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los
alimentos. Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el
intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es
decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza,
especialmente en suelos, semillas y vegetales. Los coliformes se introducen
en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales.
Por tal motivo suele deducirse la mayoría de los coliformes que se
encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, aún existen
muchos coliformes de vida libre.
2.6.1.-Los coliformes como indicadores
Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de
contaminación fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo
humano en razón de que, en los medios acuáticos, los coliformes son más
resistentes que las bacterias patógenas intestinales y porque su origen es
principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es
bacteriológicamente segura. Asimismo, su número en el agua es
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directamente proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más

coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga
de heces.

2.7.- S. aureus
conocido como estafilococo áureo, es una bacteria anaerobia
facultativa, grampositiva, productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y
noesporulada que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo,
estimándose que una de cada tres personas se hallan colonizadas, aunque
no infectadas, por ella.1
Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde
infecciones cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales
como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo
vital, como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis,
endocarditis o neumonía. Además, también puede afectar al aparato
gastrointestinal, ya sea por presencia física de Staphylococcus aureus o por
la ingesta de la enterotoxina estafilocócica secretada por la bacteria.
En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el principal
causante de las infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida
por el hecho de que esta especie habita tanto en las mucosas como en la
piel de los seres humanos, lo que permite que a través de las heridas
quirúrgicas pueda penetrar en el torrente sanguíneo del paciente por medio
del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto
contaminado o incluso con otro paciente.
2.8.- Escherichia coli
Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los
intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se le puede
encontrar en multitud de ambientes, dado que es un organismo ubicuo. Fue
descrita por primera vez en 1885 por Theodore von
Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominóBacterium coli.
Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en
honor a su descubridor.
Esta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto
del proceso digestivo, además de producir las vitaminas By K. Es un bacilo
que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo),
es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo),
no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa. Es una
bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biología
molecular.
2.9.- Salmonella
es un género de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae,
formado por bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos,
con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula (excepto la especie S.
typhi[cita requerida]) ni esporas. Son bacterias móviles que producen ácido
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sulfhídrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima especializada,

pero no lactosa, y no producen ureasa ni tienen metabolismo fermentativo.Es
un agente productor de zoonosis de distribución universal. Se transmite por
contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, en el
procesado de alimentos o en el hogar; también por vía sexual.
Algunas salmonelas son comunes en la piel de tortugas y de muchos
reptiles, lo cual puede ser de cuidado cuando se manipulan este tipo de
mascotas a la vez con alimentos.

IV. MATERIALES Y METODOS

3.1 EQUIPOS:
 EL AUTOCLAVE
 CONTADOR DE COLONIAS
 BALANZA
 ESTUFA
3.2 MATERIALES:

 CUADERNO DE APUNTES
 CAMARA FOTOGRAFICA
 PLUMONES / MARCADORES
3.3 INSTRUMENTOS
 PLACAS PETRI
 TUBOS DE ENSAYO
 PROBETAS

 MECHERO
 PLASTICO
 MUESTRAS (comida solida)
3.4 REACTIVOS:
 AGAR MC CONKEY

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 AGAR BAIR PARKER

 AGAR SS
 AGAR PLATE COUNT.
 AGAR NUTRITIVO
3.5 METODOLOGIA:
 Escuchar con atención al docente en sus respectivas explicaciones.
 Tomar apuntes relativos.
 Tomar imágenes a los respetivos materiales y equipos.
3.6.- PROCEDIMIENTO:
El procedimiento se hizo en CINCO métodos con el caldo
NUTRITIVO:
i. AGAR MC CONKEY
ii. AGAR BAIR PARKER
iii. AGAR SS
iv. AGAR PLATE COUNT.
v. SOLUCION SALINA PEPTONADA

3.6.1 PASOS:
a) Pesar las sustancias
b) Disolverlas en la cantidad d agua destilada
c) Filtrar si es necesario , enfriar moderadamente
d) Esterilizar en autoclave por 15 min a 121° c
e) Repartir en tubos de prueba
f) Distribuir a cada placa
g) Almacenar en la incubadora.

SOLUCION SALINA( agua peptonada)

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Para licuar la comida

Solida de todas las
muestras.

Fig. N° 01, solución salina.

COMPOSICION:
 Peptona de caceina.
 Cloruro de sodio PREPARACION:
 Hidrogeno, fosfato y potasio. 25.5g-------------100ml
 X -------------45 ml

X = 1,15 g

Fig. N° 02, caldo nutritivo.

COMPOSICION:
 Peptona de caceina y carne
PREPARACION:
 Cloruro de sodio
 Lactosa
50--------------100 ml
 Mescla sales biliares X -------------- 75 ml
 Rojo neutro
 Violeta cristal X=3, 75g.
 Agar agr

Fig N° 03, agar mc conkey.

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COMPOSICION:
 Peptona de caceina
 Extracto de carne PREPARACION:
 Estracto de levadura 58g--------------950 ml
 Pirubate sódico X -----------75 ml
 Glicina X = 4,58 g.
 Cloruro litio
 Agar agar

Fig. N° 04, Agar bair Parker.

COMPOSICION:
 Peptona PREPARACION:
 Lactosa 60 g ----------- 100ml
 Bilis bobina secada X ------------75 ml
 Citrato sódico
 Tiosulfato sódico X= 4, 5g.
 Citato de amonio
 Verde brillante Fig. N° 05, Agar ss.
 Rojo neutro

COMPOSICION: PREPARACION:
 Peptona de fabrina 22,5g ---------1000ml
 Estracto de levadura X ------------75 ml
 Glucosa
 Agar agar X =1,68g.

Fig. N° 06, Agar plate count.

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COMPOSICION: PREPARACION:
 Pluripeptona 31,5g ------1000 ml
 Extracto de carne X ------ 75 ml
 Cloruro de sodio
 Agar - agar X = 2,325g.

Fig N° 07, Agar nutritivo.

IV.- RESULATADOS Y DISCUSION:

4.1 RESULTADOS: En este resultado de determinación de proteínas por el
método de kjeldahl se da lo siguiente con el producto harina de cañihua.

DATOS:
V=ml Hcl = 6.8 Hcl

N Hcl = 0.05479 N

Meq N = 0.014

Peso muestra= 0.2 g

%NITROGENO = ml. Hcl * N * meq N * 100

gr. De Muestra

%NITROGENO = 6.8ml Hcl * 0.05479 N * 0.014 meqN * 100

0.2g

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% NITROGENO = 2.60 %

HALLAMOS EL PORCENTAJE DE PROTEINAS DE LA

SIGUIENTE MANERA:

% PROTEINA = % n * FACTOR

% PROTEINAS = 2.60 * 6.25

%PROTEINAS = 16.30 %

4.2.- CONCLUCIONES:
o Podemos decir que hay la presencia de Aerobios mesofilos, coliformes y no hay
presencia de Salmonella sp, S. aureus y E. coli (en este caso se hizo una
resiembra ya que podría estar presente pero los resultados fueron negativos
para todos los casos).
o En los alimentos que analizamos de los restaurantes es óptimo para consumo
humano, porque presenta 17x ufc/ml, mientras que la norma permite , en
cuando a coliformes también porque presenta 3 gérmenes por g o ml (según
método del NMP) la norma permite 10; en cuanto a S. aureus, E. coli y
Salmonella no hay presencia de estos en la muestra; por lo tanto la muestra
analizada es aceptable para el consumo humano.

V.- BIBLIOGRAFIA Y BEWGRAFI

 COLOMA, A. 2003. Microbiología Agroindustrial. Editorial Universitaria UNA – Puno.
 Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock Biología de los Microorganismos.
10ª edición. Prentice-Hall. Madrid, 2003.
 Díaz, R., Gamazo, C, y López-Goñi, I. Manual práctico de Microbiología. 2ª edición.
Masson, S.A.. Barcelona, 1999.
 MSc. Victor Choquehuanca, Guia de Prácticas de Microbiologia Agroindustrial II
(Pag. 47.)
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 MINSA, Norma Sanitaria de Criterios Microbiologicos.

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