Estudio de Estabilidad para Formulacion Probiotica PDF

Estudio de estabilidad para la
selección de una formulación de un

producto probiótico
Yorguin Leonel Villarreal Solano Quim.
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de farmacia
Bogotá, Colombia
2013
Estudio de estabilidad para la
selección de una formulación de un
producto probiótico
Yorguin Leonel Villarreal Solano Quim.
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en Ciencias Farmacéuticas
Directora:
Ph.D, M Sc., Q.F. Yolima Baena
Codirector:
Ph. D. Microbiol., M Sc.Biol., Ldo. Quim. y Biol. Fernando Rodríguez
Línea de Investigación:
Farmacotécnia
Grupo de Investigación:
Grupo de investigación en sistemas de liberación controlada de moléculas
biológicamente activas y Grupo de investigación en Microbiología y Nutrición Animal del
Trópico
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de farmacia
Bogotá, Colombia
2013
Dedicatoria
A mis padres y a mi familia quienes siempre

me han apoyado en todo sentido para
alcanzar este gran logro y lo difícil que ha
sido manejar nuestra distancia debido a
nuestros fuertes lazos de cariño. Por último y
de hecho más importante, le dedico este
trabajo a DIOS por brindarme salud y fuerza
para este logro, comprendiendo que nada es
imposible, que solo uno mismo es quien pone
sus límites y quien puede superarlos sin
medida.
Agradecimientos
Le Quiero agradecer a Corpoica y la Universidad Nacional por darme la oportunidad de

desarrollar este trabajo. Principalmente al Dr. Fernando Rodríguez, a la Dra. Carolina
Gonzales, Dra. Claudia Mora, MSc. Erika Grijalba, Dra. Martha Gómez y especialmente a
la profesora Yolima Baena por su confianza, orientación y apoyo para realizar este
proyecto.
Quiero agradecer también al Ministerio de Agricultura y desarrollo rural por su confianza y

apoyo económico para la ejecución de este trabajo y también al Instituto Colombiano
Agropecuario por facilitarme los equipos necesarios.
Le agradezco también a mis compañeros de maestría Aldemar Gordillo, Jimena Zuluaga

y Luisa F. Carreño a quienes aprecio mucho por apoyarme en todos los momentos
difíciles de este gran camino.
Por último agradezco a mis grandes amigos Juan David Toloza, Sergio Manosalva, Diana
Zárate, Victor Púlido, Cristian Guzmán, Juan Camilo Ovalle, Lorena Dávila, Astrid
Malagon y Diana Sanabria quienes me acompañaron y colaboraron en todo el arduo
proceso.
VIII Estudio de estabilidad para la selección de una formulación de un producto
probiótico
Resumen IX
Resumen
Los terneros neonatos en sistemas ganaderos especializados tienen una mortalidad del
12% y una morbilidad del 60%, por alta incidencia de diarreas debido al deficiente
establecimiento de la flora microbiana intestinal. Como alternativa, Corpoica aisló y
seleccionó bacterias ruminales de bovinos criollos que redujeron en un 65% la incidencia
de diarreas en terneros. Con el propósito de obtener en el futuro un probiótico disponible
en el mercado, este trabajo pretendió seleccionar una formulación a base de las
bacterias (“principios activos” (API): Streptococcus bovis C2 y Butyrivibrio fibrisolvens
B9). Para ello se realizó un estudio de estabilidad a dos prototipos de formulación (T1 y
T2) con cada microorganismo y su mezcla, almacenados a (4+2) y (25+2) ºC durante 6
meses. A estas formulaciones se les evaluó su viabilidad, actividad glucolítica (A.G.),
actividad de agua (aw), pH, contaminantes y separación de fases. La formulación T1 a
4+2ºC se mantuvo dentro de los límites especificados (contenido de contaminantes,
actividad glucolítica), conservó la viabilidad de los “principios activos” > 1x107 ufc/mL, y la
concentración necesaria para ejercer la actividad probiótica; a diferencia de esto T2 y los
controles no cumplieron todos los parámetros. La formulación T1 a 25+2ºC de
almacenamiento, demostró mayor viabilidad que los demás tratamientos y los controles
C2 y C2B9 decayeron en un 100%. En general los parámetros de actividad glucolítica y
actividad de agua (aw) no demostraron diferencias significativas entre las formulaciones
(T1, T2) y las condiciones de almacenamiento. Al evaluar el parámetro de pH se observó
que fue menos estable en los tratamientos T2 y controles ya que se redujo
significativamente a 25+2°C, alcanzando valores cercanos o inferiores a 6. El parámetro
de estabilidad física de la emulsión (separación de fases) sólo se rompió a 25+2°C,
siendo más estable los tratamientos T2, sin embargo el uso de una matriz de decisiones
demostró que el tratamiento T1 a 4+2°C fue el más estable con los API y por lo tanto fue
seleccionado para pasar a la siguiente etapa de desarrollo del producto.
Palabras clave: probiótico, formulación, bacterias anaerobias, estabilidad,

biológico, caracterización, ruminal.
X Abstract
Abstract
The neonatal calves in specialized breeders systems have a mortality of 12% and a
morbidity of 60%, cause by a high incidence of diarrhea due to poor establishment of the
intestinal microbial flora. As alternative, Corpoica isolated and selected of creoles cattle
rumen´s bacteria that reduced by 65% the incidence of diarrhea in calves. With the
purpose of obtaining in the future a probiotic available in the market, this study searched
to select a formula based on the bacteria (Active pharmaceutical ingredients (API):
Streptococcus bovis C2 and Butyrivibrio fibrisolvens B9). For this reason a stability study
was conducted to two prototype formulations (T1 and T2) for each one of the
microorganisms and its mixture, stored at 4+2 and 25+2ºC for 6 months. The viability,
glycolytic activity (G.A.), water activity (aw), pH, contaminants and phase separation were
assessed in this study. At 4+2°C, T1 is maintained between all the specified limits
(pollutants, G.A.), retained viability > 1*107 cfu/mL with the API for the entire study, in
contrast to T2 and the control. At 25+2°C, T1 showed higher viability than the other
treatments and C2 controls and C2B9 declined 100%. In general, the glycolytic activity
and aw parameters showed no significant differences between formulations (T1, T2) and
storage conditions. pH was less stable in treatments T2 and controls, their pH were
significantly reduced at 25+2°C, reaching values similar or lower than 6. Finally, the
stability of the emulsion was broken only at 25+2°C, being more stable in T2. However a
decision matrix showed that treatment T1 at 4+2°C was most compatible with the API to
continue to the next stage of product development.
Keywords: Probiotic, anaerobia bacteria, stability, biological, prototypes,

characterization, rumen.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................. XIII
Lista de tablas ............................................................................................................. XVI
Lista de símbolos y abreviaturas .............................................................................. XVII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Objetivo ..................................................................................................................... 3
1.1 Objetivos específicos ....................................................................................... 3
2. Generalidades .......................................................................................................... 5
2.1 Estudios de estabilidad .................................................................................... 5
2.1.1 Etapas del desarrollo de un producto que involucran estudios de
estabilidad ........................................................................................................... 5
2.2 Consideraciones acerca del estudio de estabilidad para el desarrollo de una
formulación probiótica ................................................................................................ 7
2.2.1 Cálculos de velocidad de degradación .................................................. 7
2.2.2 Variables respuesta a considerar en el estudio de estabilidad .............. 8
2.2.2.2 Actividad biológica (Propiedades bioquímicas: Actividad enzimática) . 11
2.2.2.3 Estabilidad de emulsiones ................................................................... 13
2.3 Importancia de los probióticos ....................................................................... 16
2.3.1 Microorganismos ruminales................................................................. 18
2.4 Marco Actual en el desarrollo de bioproductos .............................................. 19
3. Metodología ............................................................................................................ 23
3.1 Materiales y reactivos .................................................................................... 23
3.1.1 Equipos ............................................................................................... 23
3.1.2 Reactivos ............................................................................................ 24
3.2 Cultivo y caracterización microbiológica y fisicoquímica de las bacterias. ...... 24
3.2.1 Morfología y pureza bacteriana. .......................................................... 25
3.2.2 Viabilidad bacteriana. .......................................................................... 25
3.2.3 Caracterización fisicoquímica del “principio activo” ............................. 28
3.2.3.1 pH ....................................................................................................... 28
3.2.3.2 Actividad de agua................................................................................ 29
XII Contenido
3.3 Estudio de estabilidad de dos prototipos de probiótico ...................................29

3.3.1 Formulación de los prototipos de probióticos y diseño del estudio de
estabilidad..........................................................................................................30
3.3.2 Pruebas microbiológicas ......................................................................32
3.3.3 Pruebas bioquímicas (actividad glucolítica) .........................................33
3.3.4 Pruebas fisicoquímicas (Estabilidad de la emulsión) ............................34
3.3.4.1 pH ........................................................................................................34
3.3.4.2 Aspecto macroscópico de la emulsión .................................................34
3.3.4.3 Actividad de agua ................................................................................35
3.4 Análisis estadístico y criterios de selección de la formulación ........................35
4. Resultados y discusión ..........................................................................................36

4.1 Caracterización de la fermentación de los “principios activos”. .......................36
4.1.1 Streptococcus bovis C2 .......................................................................36
4.1.2 Butyrivibrio fibrisolvens B9 ...................................................................38
4.2 Estudio de estabilidad de dos prototipos de probiótico ...................................40
4.2.1 Cuantificación del “principio activo” (Viabilidad) ...................................40
4.2.2 Contenido de contaminantes ...............................................................54
4.2.3 Determinación de la actividad glucolítica .............................................57
4.2.4 Pruebas fisicoquímicas (Estabilidad de la emulsión) ............................60
4.2.4.1 pH ........................................................................................................60
4.2.4.2 Aspecto macroscópico de la emulsión .................................................63
4.2.4.3 Actividad de agua ................................................................................65
4.3 Tratamiento de resultados y criterios de selección de la formulación .............68
5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................69

5.1 Conclusiones ..................................................................................................69
5.2 Recomendaciones..........................................................................................69
A. Anexo: Análisis estadístico de la producción de los “principios activos”

(ANOVA) .........................................................................................................................73
B. Anexo: Resultados del estudio de viabilidad del “principio activo”. ..................78
C. Anexo: Resultados del estudio de contaminantes aerobios mesófilos del

“principio activo”. ..........................................................................................................81
D. Anexo: Resultados y regresión del estudio de determinación de la actividad

glucolítica……………….……………………………………………………………………….85
E. Anexo: Resultados y regresión del estudio de determinación de pH. ................91
F. Anexo: Resultados del aspecto macroscópico de la emulsión (separación de

fases)………………………………………………………… ...………………………………..97
G. Anexo: Resultados y regresión del estudio de la actividad de agua de los

tratamientos evaluados. ................................................................................................98
H. Anexo: Ejemplo estadístico aplicado para la regresión lineal de los datos del
estudio de estabilidad (viabilidad). .............................................................................104
Bibliografía ...................................................................................................................122
Lista de figuras XIII
Lista de figuras
Pág.
Figura 2-1: Tipos de respiración anaeróbica y aerobica, los pares redox aparecen en
orden, desde potenciales de reducción (E0´) electronegativos hasta los E0´ más
electropositivos............................................................................................................... 10
Figura 2-2: Formación de colonias distinguibles por el método de Roll tube. En dirección
de inferior a superior en la imagen derecha, se observan los grados de dilución 107 a 109
, respectivamente. .......................................................................................................... 11
Figura 2-3: Metabolismo enzimático sobre celulosas y hemicelulosas. .......................... 12
Figura 2-4: Tracto digestivo de un rumiante ................................................................... 18
Figura 3-1: Tres lotes para caracterización del cultivo. ................................................... 25
Figura 3-2: Apariencia del medio de cultivo después ser llevado a calentamiento y
gasificación con CO2...................................................................................................... 27
Figura 3-3: “Rolling” de tubos ágrafes con medio de cultivo agar nutritivo para el
crecimiento de bacterias anaerobias. ............................................................................. 27
Figura 3-4: Incubación de los tubos de medio de cultivo agar inoculados....................... 28
Figura 3-5: Potenciómetro SCHOTT Instruments Lab 850 para la determinación de pH en
los tratamientos evaluados. ............................................................................................ 29
Figura 3-6: Equipo para la determinación de actividad de agua Thermoconstanter
Novanisa®...................................................................................................................... 29
Figura 3-7: Proceso de mezcla de las formulaciones bajo constante gasificación. ......... 30
Figura 3-8: Muestras para almacenamiento de las formulaciones propuestas. ............... 31
Figura 3-9: Cajas petri inoculadas con la formulación..................................................... 33
Figura 3-10: Cultivos inoculados con los diferentes tratamientos a los 24 horas de
incubación. ..................................................................................................................... 34
Figura 4-1: Cocos y diplococos de Streptococcus bovis C2 visualizados bajo microscopía
de contraste de fases (magnificación x 1000). ................................................................ 36
Figura 4-2: Bacilos cortos y largos de Butyrivibrio fibrisolvens B9 visualizados bajo
microscopía de contraste de fases (magnificación x 1000). ............................................ 38
Figura 4-3: Viabilidad de prototipos de formulación y medios de cultivo de probióticos
almacenados a una temperatura de 25°C (parte superior de la figura) y 4ºC (parte inferior
de la figura), respectivamente durante seis meses. Los tratamientos T1 y T2
corresponden a las cepas formuladas. Los tratamientos B9, C2 y C2B9, corresponden al
caldo de fermentación sin formular (controles). .............................................................. 41
XIV Lista de Figuras
Figura 4-4: Gráficas de modelos de cinética de degradación (orden cero, orden uno y
orden dos) para el tratamiento B9 a condiciones de almacenamiento a 25+2°C (A.
izquierda) y 4+2°C (B. derecha). ..................................................................................... 43
orden dos) para el tratamiento B9T1 a condiciones de almacenamiento a 25+2°C (A.
orden dos) para el tratamiento C2T1 a condiciones de almacenamiento a 25+2°C (A.
orden dos) para el tratamiento C2B9 a condiciones de almacenamiento a 25+2°C (A.
orden dos) para el tratamiento C2B9T1 a condiciones de almacenamiento a 25+2°C (A.
Figura 4-12: Gráficas de Arrhenius de todos los tratamientos. A) Tratamientos B9, B9T1 y
B9T2; B) Tratamientos C2, C2T1 y C2T2; C) Tratamientos C2B9, C2B9T1 y C2B9T2. .. 52
Figura 4-13: Microscopía de una colonia de contaminantes aerobios mesófilos (bacilos de
gran tamaño, no motiles) encontrados en el tratamiento C2T1. ...................................... 55
Figura 4-14: Contaminación de uno de los tratamientos C2T2 a seis meses de
almacenamiento a 25°C (Izquierda), en comparación con el tratamiento C2T2 que no
sufrió contaminación a 5 meses de almacenamiento a 4°C (derecha). ........................... 57
Figura 4-15: Resultados de la actividad glucolítica de los tratamientos evaluados a través
del tiempo de estudio bajo condiciones de almacenamiento de 25+2°C (parte superior de
la figura) y 4+2°C (parte inferior de la figura), respectivamente. ...................................... 58
Figura 4-16: Resultados del pH de los tratamientos evaluados a través del tiempo de
estudio, bajo condiciones de almacenamiento de 25°C (parte superior figura) y 4°C (parte
inferior figura) respectivamente. ...................................................................................... 60
Figura 4-17: Resultados de la separación de fases de los tratamientos evaluados a través
del tiempo de estudio bajo condiciones de almacenamiento de 25+2°C. ........................ 63
Figura 4-18: Prototipos de formulación del tratamiento C2B9T2 al cabo de 6 meses de
almacenamiento a 4+2°C. ............................................................................................... 64
Figura 4-19: Separación de fases en uno de los tratamientos almacenados a 25+2°C a
los 180 días de almacenamiento. .................................................................................... 65
Lista de tablas XV
Figura 4-20: Actividad de agua aw de los tratamientos evaluados a través del tiempo de
estudio, bajo condiciones de almacenamiento de 25°C y 4°C, respectivamente. ........... 66
XVI Lista de Figuras
Lista de tablas
Pág.
Tabla 2-1: Actividad de agua mínima para el crecimiento de diferentes microorganismos.
....................................................................................................................................... 16
Tabla 2-2: Productos probióticos para el ganado regulados en colombia. ....................... 21
Tabla 3-1: Composición de los tratamientos evaluados en la prueba de estabilidad en
almacenamiento. B9, Butyrivibrio fibrisolvens; C2, Streptococcus bovis; T1, Formulación
1; T2, Formulación 2. ...................................................................................................... 30
Tabla 3-2: Matriz de selección del mejor prototipo. Se calificará de 1 a 3, en el cual 3
representa el mejor resultado y 1 el resultado más bajo. ................................................ 35
Tabla 4-1: Valores de pH, viabilidad y actividad de agua (aw) obtenidos a partir de 3 lotes
de S. bovis C2................................................................................................................. 37
Tabla 4-2: Valores obtenidos de determinación de pH, viabilidad y actividad de agua (aw)
de 3 lotes de la misma bacteria para su caracterización. ................................................ 39
Tabla 4-3: Constantes de degradación de los tratamientos almacenados a 25+2°C y
4+2°C, determinado por el método de regresión, aplicando la Ecuación (4.2). ............... 51
Tabla 4-4: Energías de activación determinadas para cada uno de los tratamientos con
base en las temperaturas de almacenamiento de 25+2°C y 4+2°C. ............................... 53
Tabla 4-5: Resultados de las “vidas útiles tentativas” de los “principios activos” en los
tratamientos almacenados a 25+2°C y 4+2°C. ................................................................ 54
Tabla 4-6: Contenido de contaminantes en los tratamientos evaluados bajo condiciones
de almacenamiento a 25°C. ............................................................................................ 55
de almacenamiento a 4°C. .............................................................................................. 56
Tabla 4-8: Resultados de la velocidad de cambio de la actividad glucolítica durante el
almacenamiento de los tratamientos, obtenidos por el método estadístico de regresión
(α=0.05). ......................................................................................................................... 59
Tabla 4-9: Resultados del porcentaje de variación del pH y velocidad de cambio de pH
durante el almacenamiento de los tratamientos a 6 meses. ............................................ 61
Tabla 4-10: Resultados de porcentaje de variación de aw y su velocidad de cambio de aw
durante el almacenamiento de los tratamientos, empleando el análisis de regresión
(α=0.05). ......................................................................................................................... 67
Tabla 4-11: Matriz de decisiones para la selección del mejor prototipo del “principio
activo” mezcla (C2B9). .................................................................................................... 68
Lista de símbolos y abreviaturas XVII
Lista de símbolos y abreviaturas
Símbolos con letras latinas

Símbolo Término Unidad Definición
U/mL
A.G. Actividad glucolítica
aw Actividad de agua HR/100
ufc Unidades formadoras de colonia ufc
HR Humedad relativa
1E+11 =>
E+ Notacion científica
1 x 1011
Ea Energía de activación Cal
Símbolos con letras griegas

Símbolo Término Unidad SI Definición
Α Error alfa o error tipo I
Presión parcial de la solución
Presión de vapor del agua
Abreviaturas
Abreviatura Término
ICH International conference on harmonisation

of technical requirements for registration of
pharmaceuticals for human use
Corporación Colombiana de investigación
Corpoica
agropecuaria
FDA Food and drug administration
B9 Butyrivibrio fibrisolvens
C2 Streptococcus bovis
XVIII
Introducción
En el campo de la producción lechera se ha buscado desarrollar nuevos productos que
mejoren la calidad del estado del ganado y por lo tanto la cantidad y calidad de la leche
producida. Con el fin de satisfacer la demanda de leche (6.500 millones de litros anuales)
se han diseñado diferentes tipos de productos probióticos, sin embargo en la actualidad
hay un déficit permanente de oferta por muertes prematuras del ganado potencialmente
lechero.
En el caso de Colombia los sistemas de producción lechera se basan en el buen estado

de salud del ganado, principalmente de animales jóvenes; sin embargo estos son
propensos a adquirir enfermedades que provocan una alta tasa de mortalidad en sus
primeros meses. Una de estas enfermedades es la diarrea neonatal, con mayor índice de
mortalidad (cercana a un 20%), que ocasiona que los terneros no alcancen la edad
adulta para ser productores lecheros y por consiguiente se dé una disminución en la
productividad de la ganadería lechera [1,2].
Con el fin de contribuir a la solución de este problema, Corpoica en conjunto con la

Universidad Nacional, dentro de uno de los proyectos de investigación, está
desarrollando productos probióticos tipo emulsión, los cuales beneficiarán el estado de
salud de los terneros, basado en la actividad enzimática de algunas bacterias ruminales
anaerobias (Butyrivibrio fibrisolvens B9, Streptococcus bovis C2) [3].
El desarrollo de un producto de esta naturaleza, se debe llevar a cabo en una serie de

etapas, de manera similar al desarrollo de un producto farmacéutico, lo que incluye: la
pre-formulación, la formulación, el escalamiento, la validación y mantenimiento de
procesos [4]. En este orden de ideas, la investigación hasta ahora desarrollada se
encuentra en la fase de formulación, en la previamente se seleccionaron dos emulsiones
que serían las más estables con los “principios activos”: Butyrivibrio fibrisolvens B9,
Streptococcus bovis C2. Para escoger la más adecuada, se propuso realizar un estudio
de estabilidad a dos temperaturas: 4+2°C y 25+2°C, al cual se le evaluaron sus
propiedades físicas, químicas y microbiológicas (enzimáticas, viabilidad y cuantificación
de posibles bacterias contaminantes), y así se obtuvo un indicio de la degradación que
pudo sufrir el “principio activo” o las inestabilidades del producto formulado al exponerse
a diferentes temperaturas, no solo como una mezcla de los dos “principios activos” sino
también el comportamiento de cada uno en dichas formulaciones.
2 Introducción
De acuerdo al planteamiento realizado en el presente proyecto se discutieron los tópicos

correspondientes a los estudios de estabilidad realizados basados en las normas
“International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use” (ICH), las particularidades de la estabilidad de
emulsiones y de los productos probióticos, así como las factores que predominaron para
la selección del mejor prototipo de formulación de un probiótico con respecto a su
estabilidad en el tiempo (6 meses).
Objetivo 3
1. Objetivo
Estudiar la estabilidad de dos prototipos de formulación probiótica para el tratamiento de
diarrea en terneros desde los puntos de vista químico, físico, microbiológico y de
actividad biológica.
1.1 Objetivos específicos
 Caracterizar fisicoquímicamente y microbiológicamente los “principios activos”

(Butyrivibrio fibrisolvens B9 y Streptococcus bovis C2).
 Evaluar las propiedades fisicoquímicas, microbiológicas y bioquímicas del

probiótico durante 6 meses en almacenamiento para dos prototipos de
formulación a dos temperaturas diferentes.
 Seleccionar la formulación que presente mayor estabilidad, basado en los

estudios realizados.
2. Generalidades
2.1 Estudios de estabilidad
Cuando se desea elaborar un producto farmacéutico su desarrollo se debe regir por una
serie de etapas, como son: la preformulación, la formulación, el escalamiento, la
validación y el mantenimiento de los procesos productivos. Para el caso de los productos
veterinarios, las exigencias para su aprobación, a nivel internacional, están dadas por el
Center of Veterinary Medicine (CVM) y la Food and Drug Administration (FDA) [5], las
que a su vez son muy similares a los lineamientos de la Organización Mundial de la
Salud (OMS) [6] y el International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) [7]. Por otra
parte, para el caso exclusivo de Colombia, existen unas pautas como guía (Resolución
03827 de 2003 del ICA) para realizar adecuadamente un estudio de estabilidad [8].
Cuando se habla de un estudio de estabilidad de un producto se hace referencia a

evaluar su comportamiento a través del tiempo (por ejemplo, sus propiedades
fisicoquímicas, microbiológicas, toxicológicas y de funcionalidad [9]) y en unas
condiciones establecidas, en el que las propiedades evaluadas cumplan unas
especificaciones predefinidas. Sin embargo, no solo se habla de estudios de estabilidad
cuando se trata de un producto terminado, sino también en las diferentes etapas
asociadas al desarrollo del producto [10].
2.1.1 Etapas del desarrollo de un producto que involucran

estudios de estabilidad
Para desarrollar un producto tipo probiótico, para uso veterinario, se debe cumplir con
una serie de etapas para poder tener un producto en el mercado y asociadas a cada una
de ellas es necesario realizar estudios de estabilidad, como se presenta a continuación
[10,11]:
6 Generalidades
 Preformulación: En esta fase se determinan de manera experimental o por

búsqueda bibliográfica las propiedades fisicoquímicas del principio activo y de los
posibles excipientes a emplear, habiendo definido previamente la forma
farmacéutica a desarrollar. Los estudios de estabilidad que se requieren en esta
etapa son los de reactividad del principio activo y de compatibilidad, entre los
posibles excipientes y él. Las condiciones en la que se realizan estos estudios
son de estrés, en las que pueden tenerse valores extremos de temperatura, pH,
etc [4,10].
 Formulación: Comprende el establecimiento de una fórmula cualicuantitativa en la

que el principio activo se combina con los excipientes seleccionados, siguiendo
un procedimiento propuesto a escala laboratorio. La definición de esta fórmula
involucra el empleo del Diseño Estadístico Experimental como herramienta de
selección entre aquellas posibles formulaciones planteadas [4]. Los estudios de
estabilidad en esta fase se realizan bajo condiciones de estrés y tienen por
objetivo seleccionar aquella formulación que cumpla con las especificaciones
preestablecidas a este nivel. Asimismo, estos estudios permiten seleccionar el
envase del producto y establecer las condiciones de manufactura para el
desarrollo del proceso [7,10].
 Escalamiento: En esta etapa se evalúa la incidencia del cambio de escala del

proceso sobre el producto que se está desarrollando. Se escala el proceso
pasando por diferentes tamaños de lotes piloto, de acuerdo a las necesidades,
hasta llegar a la escala industrial. Paralelo a este desarrollo se realizan estudios
de estabilidad, bajo condiciones de estrés, que permiten definir las variables
operacionales más apropiadas en cada etapa del proceso [4,5,10,12].
Nota: De acuerdo a la resolución 03827 de 22 de diciembre de 2003 del ICA, es
posible realizar la solicitud de registro sanitario con mínimo dos lotes a escala
piloto industrial, realizando los estudios de estabilidad acelerados que le confieren
un tiempo de vida útil provisional [8].
 Validación: Esta corresponde al establecimiento de la evidencia documentada de

la reproducibilidad del proceso productivo a escala industrial, de tal manera que
se garantice el cumplimiento de especificaciones y por consiguiente la calidad del
producto [4,10]. Nota: De acuerdo a la resolución 03827 de 22 de diciembre de
2003 del ICA, se someterán tres lotes de escala industrial para la realización de
los estudios a largo plazo con el fin de confirmar la vida útil del producto [8].
 Fase de mantenimiento de procesos: Comprende el desarrollo de actividades que

garantizan que las condiciones del proceso, establecidas previamente, se
mantienen lote tras lote. Se realizan controles periódicos y se diseñan estrategias
de mejoramiento continuo. En esta etapa se realizan constantemente estudios de
estabilidad con el fin de evidenciar el cumplimiento de las BPMv y estudios para
demostrar que cambios realizados a la formulación o al proceso no afectan
significativamente la estabilidad del producto [4,10].
Generalidades 7
2.2 Consideraciones acerca del estudio de estabilidad

para el desarrollo de una formulación probiótica
El producto probiótico evaluado en el presente trabajo, se encuentra en la fase de

formulación en la que se ha establecido dos prototipos bajo la forma de presentación tipo
emulsión teniendo como “principios activos”, microorganismos de naturaleza anaerobia
(Butyrivibrio fibrisolvens B9, Streptococcus bovis C2). La forma de presentación
preseleccionada fue una emulsión W/O debido a que el vehículo oleoso protege a los
“principios activos” que son de naturaleza anaerobia de la entrada de oxigeno [13].
Con el fin de escoger la formulación más adecuada se realizó un estudio de estabilidad a

dos temperaturas 4°C (condiciones normales de almacenamiento propuestas para el
futuro producto) y 25°C (condiciones de estrés por temperatura). Estas condiciones
fueron escogidas porque a temperaturas más altas (como por ejemplo 30°C) el
metabolismo celular alcanza la fase de muerte en un tiempo inferior a una semana [14].
Para el desarrollo del estudio de estabilidad de este tipo de productos se evaluaron como
variables respuesta propiedades fisicoquímicas, como el volumen de separación de
fases, la actividad de agua y el pH; propiedades microbiológicas como la contaminación
del producto por bacterias aerobias y la viabilidad de las bacterias que actúan como
“principios activos” en este caso; y las propiedades bioquímicas como la actividad
glucolítica, con el fin de determinar si las bacterias mantuvieron esta actividad a través
del tiempo.
2.2.1 Cálculos de velocidad de degradación [15]
El proceso de degradación de un bioproducto a base de bacterias anaerobias, lleva

consigo una cinética implícita del cambio en la viabilidad del “principio activo” en función
del tiempo, permitiendo establecer incluso, a partir de este parámetro, su vida útil bajo
condiciones de almacenamiento previamente definidas.
2.2.1.1 Orden de velocidad de degradación del “principio activo”
El orden de degradación del “principio activo” corresponde a la evaluación del

comportamiento matemático del perfil de pérdida de la viabilidad de los microorganismos
ruminales (Butyrivibrio fibrisolvens B9, Streptococcus bovis C2), en función del tiempo,
que va a estar influenciado por las diferentes condiciones de almacenamiento.
En general, las reacciones de degradación pueden ser cero, uno, dos o mayores y se
refiere a cómo se afecta la concentración de las especies (o su viabilidad, como es en
este caso) en diferentes condiciones. Cuando se tienen microorganismos y no
compuestos químicos que seguir y el medio es acuoso, la cinética que se tiene es de
8 Generalidades
orden uno. En este estudio se espera que los microorganismos, que se encuentran en la
fase acuosa de una formulación tipo emulsión, tenga el mismo comportamiento cinético
de degradación de células viables a lo mencionado anteriormente [16].
Al tratarse de un producto a base de bacterias anaerobias, hay que tener en cuenta que
los factores que afectan la degradación celular son generados por la concentración de
ácidos que produce una drástica reducción de la supervivencia de los mismos. Estos
ácidos orgánicos débiles, producto del metabolismo de las bacterias, son más efectivos
que los inorgánicos en la acidificación del medio intracelular; se supone que esto ocurre
porque es más fácil su difusión a través de la membrana celular en su forma no disociada
(lipofílica), y posteriormente se disocian en el interior de esta inhibiendo el transporte
celular y la actividad enzimática [17]. Por tanto, si se regula el pH para evitar la
acidificación, la velocidad de degradación del probiótico dependerá solo de la
concentración de las bacterias viables [18].
2.2.2 Variables respuesta a considerar en el estudio de

estabilidad
2.2.2.1 Pruebas microbiológicas: Viabilidad de los microorganismos por la técnica

de “Roll tube”
Existen diversos métodos para determinar la viabilidad en diferentes microorganismos,

sin embargos cada método es específico dependiendo de la naturaleza metabólica y
respiratoria de estos, ya que existen diferentes clases de microorganismos según su
respiración celular [19]:
 Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxígeno como

aceptador terminal de electrones, puede tolerar un nivel del oxígeno equivalente o
mayor de una atmósfera de aire (oxígeno del 21%), y tiene un tipo
terminantemente respiratorio de metabolismo [19].
 Anaerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del

oxígeno y en la presencia de un nivel de oxígeno equivalente a una atmósfera del
aire (oxígeno de 21%) [19].
 Microaerofílico: Un organismo que es capaz de un crecimiento oxígeno-

dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxígeno
equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21%) [19].
Generalidades 9
 Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxígeno-

dependiente y no puede crecer en la presencia de una concentración de oxígeno
equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21%) [19].
Por tanto para determinar la viabilidad de cada “principio activo” para este proyecto
(Butyrivibrio fibrisolvens B9 y Streptococcus bovis C2), los métodos convencionales como
conteo en caja no son válidos debido a que estas bacterias son de naturaleza anaerobia
[20] y por tanto requieren un medio saturado de CO2, es decir, que en presencia de
oxigeno no viven ni se desarrollan metabólicamente ya que en su mecanismo de
respiración celular, el aceptor último de electrones son sulfatos (SO3=), nitratos (NO3-),
cabonatos (CO3=) e hierro férrico (Fe3+), más no el oxigeno por tener un potencial de
reducción mayor (Figura 2-1), generando daños a la célula por el exceso de energía
liberada. Así que a pesar de que el metabolismo parta de los mismos sustratos (glucosa,
aminoácidos, triglicéridos), se produce menor energía en la respiración anaerobia, que en
la respiración y metabolismo aerobio convencional [16,21].
10 Generalidades
Figura 2-1: Tipos de respiración anaerobia y aerobia, los pares redox aparecen en
orden, desde potenciales de reducción (E0´) electronegativos hasta los E0´ más
electropositivos [16].
Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó una técnica no convencional llamada “Roll

tube”, ya que ésta es específica para microorganismos de naturaleza anaerobia. Esta es
una técnica que fue desarrollada por primera vez en Virginia Polytechnic Institute (VIP)
por R. E. Hungate en 1947 para el aislamiento de bacterias anaerobias, aunque más
adelante Hungate realizó una serie de mejoras en 1966. En principio este método
requiere utilizar un tubo agrafable sellado que contiene medio agar nutritivo y un
ambiente saturado de CO2 para el crecimiento optimo de bacterias anaerobias estrictas
[22,23]. A groso modo la técnica consiste en inocular una muestra diluida
(aproximadamente diluida nueve veces si el cultivo se encuentra en fase logarítmica de
su crecimiento, de lo contrario se diluye la muestra menos de nueve veces) a un tubo
agrafable sellado que contiene medio-agar fundido por temperatura, para luego llevar a
rotación y enfriamiento bajo una fuente de agua, esto se hace con el objetivo de formar
Generalidades 11
una película sobre las paredes para facilitar la formación de colonias distinguibles para
realizar un recuento (Figura 2-2). [22]
Figura 2-2: Formación de colonias distinguibles por el método de Roll tube. En dirección
de inferior a superior en la imagen derecha, se observan los grados de dilución 107 a 109,
respectivamente.
2.2.2.2 Actividad biológica (Propiedades bioquímicas: Actividad enzimática)
Las bacterias propuestas para el probiótico están activamente implicadas en degradación

de sustancias complejas, tanto cualitativamente por su alta actividad enzimática como a
nivel cuantitativo por su gran concentración en el rumen [24], cumpliendo diferentes
funciones; dentro de las cuales algunas bacterias ruminales son de tipo glucolíticos y
hemicelulolíticas por tanto se hace necesario determinar su actividad enzimática frente a
la degradación de materiales fibrosos que están conformados por azúcares complejos.
Las enzimas implicadas en los procesos de degradación de materiales fibrosos se

encuentran ampliamente distribuidas entre las diferentes especies de microbios
ruminales celulolíticos, tal es el caso de Fibrobacter succinogenes, uno de los microbios
más estudiados y que presenta un complejo enzimático muy activo en la degradación de
celulosa [25,26].
De igual forma, cada microorganismo en lugar de una enzima, tiene un complejo

enzimático que actúan en forma similar y atacan específicamente sobre enlaces
particulares que están presentes tanto en celulosas como en xilanos. Se asume que el
modelo de degradación de la celulosa en el rumen se presenta de la siguiente manera:
12 Generalidades
Figura 2-3: Metabolismo enzimático sobre celulosas y hemicelulosas [26,27].
(a) exo- 1, 4- ß glucanasa (celobiohidrolasa). (b) endo- 1,4- ß glucanasa. (c) celodextrinasa. (d)
1,4-ß glucosidasa (celobiasa). (e) endo- 1, 4- ß xilanasa. (f),-L- arabinofuranosidasa. (g) acetil –
xilan esterasa. (h) ácido ferúlico esterasa. (i) - glucuronidasa. (j) 1,4- ß xilosidasa. Glu: glucosa ;
Xil: xilosa ; Ara: arabinofuranosa ; Ac: grupo acetilo; Fer: ácido ferúlico ; me Glc: ácido 4-O- metil
glucurónico.
Según Fondevila (1998), este proceso se inicia con el ataque de las endo. 1,4 beta
glucanasas (celobiohidrolasas) a las regiones más amorfas de la celulosa, rompiendo
aleatoriamente las cadenas en celodextrinas y creando así extremos libres para la acción
de las exo-1,4 beta glucanasas, que liberan unidades de celobiosa a partir del extremo
de la cadena. Estas celobiosas son finalmente hidrolizadas a glucosa por la beta-
glucosidasa.
Algunos factores que pueden modificar la actividad enzimática son el pH, la temperatura
y la concentración salina. Estos factores favorecen la desnaturalización, proceso en el
cual se da un cambio estructural de las proteínas o ácidos nucleicos, donde pierden su
estructura nativa, y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian
sus propiedades físico-químicas.
Generalidades 13
Para evaluar la actividad enzimática, se determinó la capacidad de degradación de

sustratos que tienen las enzimas de microorganismos con acción probiótica. El método
utilizado fue la espectrofotometría que permitió detectar cambios en la absorbancia de luz
por parte del sustrato (glucosa) o del producto (según la concentración de estos) con el
fin de medir la cantidad de sustrato remanente en el tiempo [28].
Para determinar la degradación de sustratos (azúcares reductores) de la fermentación

[29] se utilizó el método de DNS. Que consistió en la reducción del ácido dinitrosalicílico
que inicialmente es de color amarillo a la formación del ácido 3-amino-5-dinitrosalicílico
de color rojo, el cual por espectrofotometría determinó la concentración de azúcares
reductores de forma indirecta con el fin de que se calculara la actividad enzimática del
microorganismo [29].
2.2.2.3 Estabilidad de emulsiones [30,31]
Las emulsiones son sistemas heterogéneos conformados por dos fases líquidas. Una
fase interna o discontinua que se encuentra en forma de pequeñísimas gotas
uniformemente dispersas en la fase externa o fase continua que se encuentra en mayor
proporción.
En emulsiones es importante tener en cuenta los diferentes factores que desestabilizan

esta forma de presentación, las cuales pueden ser de naturaleza química, física y
microbiológica. En la estabilidad química hay que tener en cuenta los componentes
presentes en la emulsión ya que algunos pueden ser propensos a degradarse en estados
emulsificados, ya sea por degradación de la fase oleosa [32]. Con respecto a la
estabilidad microbiológica, hay que tener en cuenta que agentes antimicrobianos a
utilizar estén distribuidos en ambas fases de la emulsión. Sin embargo para el caso de un
producto probiótico esta condición no aplica ya que el uso de preservantes puede matar
las células viables del producto (“principio activo”). Por último y no menos importante es
necesario mantener la estabilidad física del producto, debido a que esta puede afectarse
formándose dos fases.
Los principales fenómenos asociados a la estabilidad física de las emulsiones son los
siguientes:
1) El movimiento ascendente (sobrenadante) y descendente (sedimento) de las

gotas relativas dispersas en el medio continuo conocidos como cremado o
sedimentación, respectivamente).
En emulsiones puede suceder un efecto u otro dependiendo de las densidades de la fase

continua y dispersa. Cuando se forma el cremado o la sedimentación se genera un gran
14 Generalidades
problema ya que las gotas que deberían estar dispersas se encuentran muy cerca la una
de la otra, evitando la mezcla homogénea entre las fases.
Para solucionar este problema es importante poder disminuir el tamaño de gota

causando menor cremado, ya que la velocidad de movimiento de la partícula dependerá
del tamaño de gota, por otro lado es complicado tecnológicamente reducir el diámetro de
la gota por debajo de 0.1µm. Otra forma más frecuente de solucionar este problema es
modificar la viscosidad para que la densidad de la fase dispersa alcance a la densidad de
la fase continua.
2) La agregación o posible coalescencia de las gotas dispersas para dar lugar a la

separación de fases:
No necesariamente la sedimentación y el cremado rompen la emulsión, la cual puede ser

redispersada con suave agitación. Sin embargo un problema más serio de inestabilidad
es la agregación y coalescencia de la fase interna.
La agregación (floculación) consiste en que las gotas dispersas en la fase continua se

empiezan a aproximar unas con otras por interacciones entre ellas, mientras que la
coalescencia consiste en la fusión de las gotas, terminando en la separación de fases.
Por tanto la agregación precede a la coalescencia en la inestabilidad de una emulsión.
Aunque no siempre es así ya que la agregación puede ser un proceso reversible y la
coalescencia no.
Para solucionar este problema se usa estratégicamente una combinación de

emulsificantes, provocando un efecto sinérgico que estabiliza más la emulsión, además
de aumentar la viscosidad del medio disminuyendo la velocidad de sedimentación o
cremado.
3) Inversión de fases en la cual un sistema agua en aceite (W/O) pasa a ser un

sistema aceite en agua (O/W):
La inversión puede darse por la adición de algún electrolito en la mezcla o algún cambio
en la relación de volúmenes entre fase externa e interna.
Muchas veces la inversión se observa cuando una emulsión es preparada por

calentamiento y mezcla de fases para luego enfriarse. La inversión de fases se debe a
que la temperatura afecta la solubilidad de los agentes emulsificantes cambiando el
numero de HLB del surfactante.
Para evaluar la estabilidad de las emulsiones es importante realizar un estudio del estado
de esta, es decir si hay o no transformación de alguna de las especies de la formulación
Generalidades 15
durante el almacenamiento, como la formación de sólidos, cambio de coloración,

inversión de la relación agua/aceite determinándose a través de la conductividad de la
emulsión, el cambio de pH, la actividad de agua, la viscosidad y el grado de separación
de fases [33].
2.2.2.3.1 Pruebas fisicoquímicas en emulsiones
Las pruebas de estabilidad anteriores se enfocan principalmente en la supervivencia y

actividad del “principio activo”, sin embargo es importante evaluar los cambios y el estado
fisicoquímico del producto con el fin de determinar la estabilidad de los demás
componentes como un conjunto de formulación. Los parámetros a calcular en una
formulación tipo emulsión principalmente son el pH (determinar la acidez del formulado),
viscosidad (a mayor viscosidad da cuerpo al probiótico ya que disminuye la movilidad de
las gotículas de agua, evitando la agregación rápida de los mismas), determinación de
sólidos (se puedan generar con el tiempo por algún efecto fisicoquímico) y la
conductividad (esto con el fin de controlar si la emulsión se mantiene de la forma W/O a
través del tiempo) [34,35,36,37].
Para este trabajo se evaluaron algunos aspectos fisicoquímicos de la estabilidad de la

emulsión como la actividad de agua, volumen de separación de fases y pH [38].
Actividad de agua
El agua es el factor que más influye en la estabilidad de los alimentos, debido a que
facilita la difusión de los componentes de cualquier producto, quedando expuestos a
cualquier efecto de descomposición o degradación. Por otra parte cuando se trata de
bioproductos es necesario mantener cierto grado de disponibilidad de agua debido a que
mantendrá la naturaleza biológica de las sustancias que para el caso de los probióticos
es la naturaleza de los microorganismos [39].
A partir de esto aparece el concepto de la actividad de agua (aw), que indica la fracción
del contenido de humedad total de un producto que está libre, y por tanto, disponible para
el crecimiento de microorganismos y para que se puedan llevar a cabo reacciones
químicas que afectan a la estabilidad producto.
En casos específicos como los productos probióticos, ciertos valores mínimos requeridos
de actividad de agua mantiene acelerado y activado el metabolismo celular para el
crecimiento de microorganismos (Tabla 2-1) (aW ~ 0.9) incrementando la viabilidad de los
microorganismos a través del tiempo debido a que desacelera la velocidad metabólica
alcanzando un estado latente [40].
16 Generalidades
Tabla 2-1: Actividad de agua mínima para el crecimiento de diferentes microorganismos

[41].
Microorganismo aW límite
Bacterias normales 0.91
Levaduras normales 0.88
Mohos normales 0.80
Bacterias halófilas 0.75
Levaduras osmofílicas 0.60
Mohos xerofílicos 0.65
El valor mínimo de aW en el cual las bacterias pueden crecer varía ampliamente, pero el
valor óptimo para muchas especies es mayor a 0.90. Algunas bacterias halófilas
(bacterias que se desarrollan en altas concentraciones de sal) crecen mejor con aW =
0.80.
Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la composición

celular y la actividad metabólica de la bacteria, debido a que si no disponen de suficiente
cantidad de agua libre en el medio necesitarán realizar más trabajo para obtenerla y
disminuirá el rendimiento del crecimiento [41].
Importancia del pH [38]
El pH en medios biológicos se encuentra restringido por ciertos límites de tolerancia, esto

se debe a que no solo afectaría la reacciones bioquímicas, grado de protonación de las
enzimas sino también la permeabilidad de los constituyentes celulares perdiendo su
función biológica y por tanto su supervivencia.
En el caso específico de las bacterias, a pesar de su capacidad de adaptación, estas no

pueden resistir pH muy ácidos provocando la muerte celular, por tanto en importante
regular el pH en los medios de cultivo para lograr crecimientos óptimos (pH 6 y 7) y
también mantener su naturaleza funcional óptima [16]. En el caso específico de las
bacterias ruminales el pH del rumen es algo variable, un tanto ligeramente ácido
(aproximadamente un pH entre 5-7) el cual afecta los niveles poblacionales de las
diferentes bacterias. Por tanto la particular sensibilidad celular de cada tipo de bacteria se
debe principalmente a la isohidronia que a la misma isotonicidad [42].
2.3 Importancia de los probióticos

Generalidades 17
La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación FAO define

a los probióticos como microorganismos vivos, que al administrarse en dosis adecuadas
producen como efecto beneficios en la salud del receptor [43].
Los probióticos están contemplados en la rama de la nutracéutica (nutrición y

farmaceútica) que consiste en medicamentos para la prevención y tratamiento de
enfermedades como bioterapéuticos, sin embargo el Instituto Colombiano Agropecuario
(ICA) los considera como complementos nutricionales debido a que estos productos
mayormente son de importación y no cumplen a cabalidad los estándares totales como
medicamentos de tipo nutracéutico.
Un probiótico tiene como objetivo mejorar el funcionamiento intestinal ya que son

bacterias que sobreviven al paso por el tracto gastrointestinal y se pueden implantar en el
colon, estómago o intestino delgado con el fin principal de mejorar la salud del huésped
desde la flora intestinal ayudando a degradar los alimentos completamente para su
posterior absorción [44].
El mecanismo de acción consiste en la capacidad del “principio activo” (microorganismo)

para adherirse a las células con el fin de que persistan y se multipliquen, así comenzarán
a producir ácidos, peróxido de hidrógeno y bactericinas (sustancias antagonistas al
crecimiento de patógenos) para finalmente coagregarse y formar una flora normal
balanceada [44].
Una consecuencia adicional de la presencia de los probióticos en la flora intestinal es que

provocan que las proteínas que reconocen las moléculas microbianas, producen un
cambio conformacional activando una cascada de señalización intracelular que finaliza
en la producción de mediadores de inflamación, promoviendo la diferenciación celular o
apoptosis celular y por último activando la respuesta inmune frente a cualquier posible
infección [45].
Para el desarrollo de un probiótico es importante tener en cuenta aquellos factores que

influyen en la formulación como el estado fisiológico de la bacteria, la temperatura de
trabajo y almacenamiento, el pH del formulado, la actividad de agua, la presencia de
oxígeno, factores de crecimiento bacteriano, ingredientes sinérgicos, fuerzas físicas,
tolerancia a bajas temperaturas y la toxicidad de los componentes y sus productos de
degradación.
Con el fin de prevenir la incidencia de diarreas en terneros neonatales, Corpoica

seleccionó el uso de cinco microorganismos anaerobios que son extraídos del rumen
[46], para elaborar un producto probiótico. La acción de estos es brindar la colonización y
establecimiento temprano de cepas microbianas ruminales en el rumen de los terneros,
facilitando la transición de bovinos jóvenes monogástricos a rumiantes aprovechando
mejor los nutrientes de los alimentos. Estos se da por la colonización temprana de estas
cepas, altamente fibrolíticas, estimulando el sistema inmunológico y por ende la salud
animal y ganancia de peso, provocando una disminución del tiempo al destete. Huscano
et al (2002) reportaron que al suplementar productos de origen ruminal, genera una
18 Generalidades
disminución de diarreas y un aumento de peso en recién nacidos; ellos le atribuyen esto

a la potenciación del sistema inmune y al rápido desarrollo del rumen [47].
2.3.1 Microorganismos ruminales
Los rumiantes tienen una morfología y fisiología digestivas que los hace únicos de los
demás animales. Las principales diferencias están relacionadas con la parte anterior del
tracto digestivo en aquellos órganos responsables del proceso de degradación de los
alimentos. En los rumiantes la boca tiene funciones como la prensión, masticación,
insalivación, deglución y la rumia. La capacidad de los rumiantes par aprovechar los
carbohidratos fibrosos de la dieta se debe al rumen, retículo y omaso, que son órganos
que anteceden el abomaso (Figura 2-4). La superficie exterior del rumen y retículo están
rodeados por pliegues que se proyectan al interior, separan al órgano en sacos y su
función es contribuir con la contracción de los sacos y mezclado de la ingesta. [17]
Figura 2-4: Tracto digestivo de un rumiante
A diferencia del resto del tracto digestivo, las superficies internas del rumen, retículo y del
omaso con epiteliales y no mucosas, es decir, no hay producción de secreciones en esos
órganos. Por otro lado el líquido ruminal es muy dinámico ya que existe un intercambio
constante a través de la pared del órgano, debido al enriquecimiento por saliva (sales) y
agua bebida. Con respecto a los sólidos, la rapidez de su paso a través del rumen está
afectada por el tamaño y el peso específico de las partículas, la digestibilidad y la
cantidad de alimento consumido.
El rumen es una cámara de fermentación principalmente anaeróbico. Esta cámara

presenta una retención alta de partículas largas de forraje que estimula la ruminación. Se
encuentra a temperatura promedio de 39-40°C, con un pH variable dado por la
fermentación microbiana y el metabolismo corporal. Además, es una fuente de sustratos
(alimento, saliva, metabolitos microbianos, entre otros), con una continua remoción de
productos a través de la absorción, crecimiento microbiano y paso a otros
compartimientos. [17]
Generalidades 19
El rumen tiene un ambiente apropiado para el crecimiento y reproducción de

microorganismos. Las tres poblaciones dominantes en el rumen son las bacterias,
protozoarios y hongos. Estos se pueden encontrar en tres sitios diferentes en el rumen,
es decir, pueden estar adheridos en la pared, asociado a partículas alimenticias o
flotando en el fluido ruminal [24].
Los microorganismos se ven favorecidos por la ausencia de oxígeno lo cual se logra por
bacterias adheridas en la pared que hidrolizan la urea y consumen el oxígeno que llega
con el alimento ingerido ya que este es tóxico para la mayoría de bacterias por ser en su
mayoría anaerobios estrictos. Estos microorganismos tienen la capacidad de digerir
carbohidratos complejos (celulosa, hemicelulosa, pectina) para producir azúcares
sencillos, también aprovechan el nitrógeno no proteico para su conversión en
aminoácidos y en proteínas, sintetizan vitaminas hidrosolubles y la producción y posterior
utilización de ácidos grasos volátiles (AGV: acético, propiónico, butírico, isobutírico) como
fuentes de energía metabólica. [17,24].
2.4 Marco Actual en el desarrollo de bioproductos
En los últimos años se han desarrollado grandes avances en el campo de la nutrición ya

que se ha expandido a otras áreas como la inmunología, la ecología microbiana y la
genómica. Los estudios han permitido encontrar que hay una gran relación entre la dieta
y el estado de salud, encontrando efectos beneficiosos entre el huésped y la microbiota
gastrointestinal. Desde ese momento se empezaron a desarrollar los alimentos y
suplementos funcionales que provocan efectos benéficos al consumidor, tales como
alimentos vitamínicos, mineralizados y aquellos llamados probióticos. Los probióticos son
los más destacados actualmente, se han realizado muchos estudios sobre su actividad,
las posibles formulaciones, su estabilidad, su mecanismo de acción para su producción y
distribución tanto para consumidores humanos como animales [48].
Michael Phillips et al (2003) evaluaron la viabilidad de probióticos (L. acidophilus,

Bifidobacterium sp., L. casei, L. paracasei and L. rhamnosus) en quesos cheddar durante
32 semanas encontrando que el queso cheddar es un buen vehículo de entrega del
probiótico ya que la viabilidad se mantiene entre 106 – 107 ufc/g, concluyendo que si una
bacteria se encuentra en un vehículo adecuado puede mantenerse activa por más de dos
años [49].
Claude P. Champagne y Nancy J. Gardner evaluaron la viabilidad de probióticos

lactobacilos en bebidas de frutas durante su almacenamiento (40 días), en el cual
encontraron que no todas las cepas bajo las mismas condiciones tienen la capacidad de
supervivencia al almacenarse a 4°C por 40 días. Adicionalmente observaron que la
actividad del probiótico no se ve afectada durante el almacenamiento en bebidas frutales,
20 Generalidades
el cual es un factor importante ya que el efecto del almacenamiento no afecta la

naturaleza y funcionalidad del mismo [50].
Iryna B. Sorokulova et al (2008) evaluaron nuevas formulaciones sólidas de esporas

probióticas de Bacilos para extender su vida útil en condiciones de almacenamiento,
utilizando dos vehículos que son el tapioca y carbón vegetal. En sus experimentos
encontraron que la cinética de degradación es de orden uno, también se obtuvo que las
formulaciones con esos dos vehículos aumentaron el tiempo de vida de las esporas de
Bacilos hasta 7 semanas con valores altos de viabilidad a temperatura ambiente sin
necesidad de refrigeración [51].
Maria Saarela et al (2000) encontró que la viabilidad de los probióticos en alimentos

matrices (yogurts, carnes, quesos) un largo periodo de tiempo depende del pH, de la
temperatura de almacenamiento, actividad de agua, la presencia de microorganismos
inhibidores o promotores y de posibles agentes inhibidores. Para evitar estos problemas
se han empezado a utilizar tecnologías de encapsulación de cepas para mantener tanto
la viabilidad como la estabilidad de los probióticos [52].
Maria Saarela et al, evaluó en el año 2006, la estabilidad y funcionalidad de células

liofilizadas del probiótico de Bifidobacteria durante su almacenamiento en jugo (6
semanas a 4-20°C) y leche (2 semanas a 4°C), determinando su comportamiento a
diferentes tiempos de fermentación, crioprotectores y pHs durante el secado. En
conclusión encontraron que no importa las condiciones iniciales de fermentación sino el
uso del crioprotectores (sacarosa), al determinar la viabilidad del Probiótico durante las
semanas de almacenamiento, además que el vehículo que presentó mayor conservación
de la cepa fue la leche ya que tiene un efecto protector sobre las bacterias [53].
Por otra parte se han realizado estudios de otros probióticos y su viabilidad en Salami,
como es el caso de estudios con Lactobacillus casei y Lactobacillus paracasei y su efecto
en las propiedades físico-químicas (pH, actividad de agua, humedad, contenido de
proteínas y ácido láctico) de un salami seco (Yanina de Jesús Pérez Cayo) en este
estudio encontrarón que la mezcla de microorganismos inoculada en productos cárnicos
ocasiona una mayor carga bacteriana (mayor viabilidad) que implementar de a un
microorganismo. Lo anterior se debe a que la combinación de microorganismos presentó
menor actividad de agua disminuyendo la velocidad metabólica de los mismos, también
se originó menor pH por la producción bacteriana de ácido láctico y menor porcentaje de
humedad a diferencia de los otros tratamientos evaluados presentando mayor viabilidad
de las bacterias [54].
Srikanjana Klayraung et al (2009) desarrollaron bajo diferentes condiciones de

manufactura y auxiliares de formulación, tabletas con probióticos, todo esto con el fin de
evaluar la viabilidad al momento de liofilizarse y durante su almacenamiento por 6 meses.
Por otra parte también se evaluaron las propiedades de dureza de la tableta y como la
viabilidad puede verse afectada durante los procesos tecnológicos de manufactura. El
estudio concluyó que la supervivencia celular es sensible al tipo de formulación que se
tenga, a los parámetros del proceso de preparación del producto y a las condiciones de
Generalidades 21
almacenamiento ya que para este caso se encontró que a mayor fuerza de compresión
de la tableta y a menor temperatura de almacenamiento, las células probióticas tienen
mayor viabilidad que otras condiciones de manufactura y almacenamiento [55,56].
Con respecto al desarrollo de formulaciones a base de probióticos para ganado, se han

desarrollado una serie de productos en el exterior, sin embargo la mayoría utiliza
microorganismos aerobios [57], los cuales no han presentado efectividad para las
enfermedades de diarrea neonatales en el ganado colombiano según las quejas
presentadas por los usuarios en el ICA, sin embargo el ICA tiene registrado esta clase de
productos como suplementos mas no como nutracéuticos. Esto se debe a que las dietas
son diferentes en Colombia con respecto a otros países, por tanto las poblaciones
ruminales de bacterias son distintas, algunos de estos productos son [57]:
Tabla 2-2: Productos probióticos para el ganado regulados en colombia.
Nombre Presentación Productor Activo Aplicación
8
Prokura Pasta empacada en Bentoli Lactobacillus acidophilus 2.5x10 Oral
probiotic jeringa plástica. Agricultural ufc/mL, Lactobacillus lactis
7
Tamaño 32 g x unidad Products 2.5x10 ufc/mL, Bifidobacterium bifidum
8
o 300 g x unidad. Gel (Estados 2.5x10 ufc/mL, Bacillus subtilis
8
azul /verdoso de Unidos) 1.25x10 ufc/mL
textura consistente y
base oleosa
Diamond Bolsa por 25 Kg Diamond V Levadura (Saccharomyces cerevisiae) Oral
V XP Mills (México)
Tri Star capsulas de 20 g Cooprinsem 1 levadura,6 especies de bacterias Oral

10
Cooperativa 1 hongo 3x10 ufc/cápsula
agrícola de
Chile
Producto de fermentación de: Oral
Accelerate
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
Tri Star Cápsulas de 6 g genetics
lactis, Lactobacillus casei,
Jr Estreptococus diacetilactic,
Estreptococus faecium, Bifidobacterium
bifidum, Aspergillus orizae, Bacilus
subtilis, Aspergillus niger,
Saccharomyces cerevisiae, cultivo de
levadura, ácido ascórbico, suplemento
de vitamina B12, suplemento de
riboflavina
10
1.2x10 ufc/cápsula
Para solucionar el problema anterior, Corpoica ha desarrollado trabajos proponiendo

bacterias nativas del rumen con actividad benéfica como probiótico, en el cual se
implementó la técnica de PCR en tiempo real para caracterizar la relación que hay entre
las poblaciones ruminales al utilizarse como inductor microbiano para el desarrollo
adecuado de los “principios activos” del futuro probiótico con base en el rumen del
ganado colombiano [58]. Otros trabajos como el de Cecilia Mantilla et al (2005) evaluaron
la interacción entre diferentes microorganismo ruminales realizando co-cultivos,
observando que en diferentes combinaciones de microorganismos no se ve afectado
22 Generalidades
significativamente el pH y pueden dar un efecto sinérgico que favorece la degradación de

forrajes obteniendo mejor aprovechamiento fibroso del material, dieta del ganado
colombiano [59].
Otros países como Argentina, están enfocados en solucionar el mismo problema

utilizando de igual manera bacterias nativas del rumen, los cuales han demostrado
actividad probiótica [60]. Estudios realizados por Lorena Soto et al. en el 2010, obtuvo
que al formular estas bacterias por microencapsulamientos con alginato, las mejores
condiciones de almacenamiento fueron por refrigeración que a temperatura ambiente, sin
embargo también observó que su viabilidad al cabo de 42 días decae totalmente [66];
con base en esto Corpoica con el apoyo de la Universidad Nacional busca superar este
tiempo de almacenamiento proponiendo no solo la supervivencia de las bacterias por
mínimo 6 meses como vida útil, sino también la estabilidad del mismo como un producto
probiótico.
3. Metodología
3.1 Materiales y reactivos
3.1.1 Equipos
Equipos Marca
Red de gasificación -------------

Incubadora Memmert UL40
Incubadora Gallenkamp Hot box oven
Balanza electrónica GHAUS Adventurer
Plancha de calentamiento IKA
Potenciómetro SCHOTT Instruments Lab 850
Microscópio NIKON eclipse 6600
Cámara microscópio NIKON DS-Fi1
Homogenizador Dynamic
Autoclave
Thermoconstanter Novasina ms1
Cámara de flujo laminar Labconco Puffier clean bench
Centrífuga refrigerada Sorvall fresco
Vortex Fisher Scientific
Rolling --------------------
Baño Prescision 180 series
Baño Labline Aquabath
Espectrofotómetro Synergy HT Biotech
24 Metodología
3.1.2 Reactivos
Reactivo Marca
Fosfato básico de potasio Scharlau

Fosfato dibásico de potasio Scharlau
Bicarbonato de sodio Scharlau
Cloruro de sodio Merck
Ácido isobutírico ICN biomedicals
Ácido propiónico ICN biomedicals
Ácido valérico ICN biomedicals
Ácido isovalérico ICN biomedicals
Ácido acético ICN biomedicals
Ácido clorhídrico J. T. Baker
Extracto de levadura Oxoid
Glucosa Scharlau
Cisteína Scharlau
Agar nutritivo Scharlau
Agar bacteriológico Oxoid
Ácido 3,5-dinitrosalicílico Sigma
Tartrato de sodio y potasio Sigma
tetrahidratado
Hidroxido de sodio Scharlau
Reactivos de formulación (Secreto
industrial)
Etanol 70% Merck
Balas de dióxido de carbono Criogas
3.2 Cultivo y caracterización microbiológica y

fisicoquímica de las bacterias.
La caracterización cada fermentación de cada microorganismo (Streptococcus bovis y

Butyrivibrio fibrisolvens), consistió primero en realizar los medios de cultivo de acuerdo
con los protocolos internos del laboratorio BGMINA 007 de Corpoica. Para un volumen
total de 600 mL, se adicionaron alícuotas iguales de SAL I y II (15% v/v, compuesto por
sales de NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4); se agregó resazurina al 0,1% v/v, extracto
de levadura 0,25% p/v, ácido grasos volátiles-AGV´s 0,04% v/v, glucosa 1%; y se aforó
con agua al 68,9% v/v. Luego se ajustó el pH a 7,2 con NaOH (6 M) y HCl (3 M), luego se
adicionó NaHCO3 al 0,6% p/v como regulador de pH y se calentó durante 10 min.
Finalmente, se gasificó con CO2 y se adicionó 0,1% p/v de HCl-císteina. Por último el
medio fue esterilizado por 20 minutos a 120°C y a 15 psi para su posterior inoculación.
Metodología 25
Los medios de cultivo se inocularon por inyección de jeringa de cada cepa reactivada del
banco de germoplasma de microorganismos con interés en nutrición animal (BGMINA).
Streptococcus bovis y Butyrivibrio fibrisolvens se inocularon en su respectivo medio a una
concentración del 0.01% v/v y del 3% v/v, respectivamente. Los medios de cultivo fueron
incubados durante 12 a 14 horas a 39+2°C.
De cada cultivo fermentado se tomó una muestra de 3 mL con el fin de evaluar sus
propiedades microbiológicas y fisicoquímicas. Esta caracterización se realizó para tres
lotes de medio de cultivo de cada microorganismo (Figura 3-1). Para determinar su
repetibilidad y su reproducibilidad se utilizó el método estadístico ANOVA y coeficiente de
varianza.
Figura 3-1: Tres lotes para caracterización del cultivo.
3.2.1 Morfología y pureza bacteriana.
La pureza de los cultivos bacterianos se realizó utilizando el microscopio Nikon eclipse

ϵ600, corroborando la morfología de cada microorganismo correspondiente y la ausencia
de microorganismos contaminantes [61].
3.2.2 Viabilidad bacteriana.
La viabilidad bacteriana fue evaluada mediante el uso de la técnica “roll tube” (tubo
rodante), la cual implica el uso de medios de cultivo anaerobios y una matriz sólida de
agar para el crecimiento de las colonias bacterianas. Fue necesario realizar en principio
medios de dilución y de agar nutritivo para bacterias ruminales anaerobias..
26 Metodología
La preparación de los medios de dilución anaerobios se realizaron con base en el

protocolo interno BGMINA N°008 de Corpoica, se tomó un frasco Schott para preparar
1000 mL de medios de dilución y se le adicionó Sal I 150 mL, Sal II 150 mL y resazurin 1
mL y se aforó a 1000 mL. Se ajustó el pH de la solución a 7,2 (se mantuvo en agitación
para homogenizar) adicionando NaOH y HCl según se requirió. A continuación se
adicionó 6 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) en agitación. Se llevó luego a
calentamiento por 10 a 15 min para retirar el oxígeno de la solución.
Se gasificó el medio de dilución utilizando CO2. Durante la gasificación se dejó enfriar la

solución para adicionarle 1g de cisteína con el fin de captar el exceso de oxígeno.
Cuando el medio viró a transparente, se sirvió 9 mL de medio a cada uno de los 9 tubos
Hungate previamente gasificados con CO2. Se taparon los tubos con un tapón y tapa
rosca. Luego se llevaron al autoclave (15+1 psi y 120+2°C) para esterilización y por
último se almacenaron en nevera a 4+2°C.
Con respecto a la preparación de los medios de agar nutritivo para anaerobiós, se

realizaron con base en el protocolo BGMINA N°007, se tomó un frasco Schott para
preparar 1000 mL de medio agar y se le adicionó Sal I (150 mL), Sal II (150 mL) y
resazurin (1 mL), extracto de levadura (2,5 g), glucosa (10 g), ácidos grasos volátiles
(AGV´s) (0,4 mL) y por último se aforó a 1000 mL. El pH de la solución se ajustó a 7,2 (se
mantuvo en agitación magnética para mantener el medio homogéneo) adicionando
NaOH y HCl según se requirió para aumentar o disminuir el pH, respectivamente. Luego
se adicionó 0,6 de bicarbonato de sodio (NaHCO3) en agitación y se llevó a
calentamiento por 10 a 15 minutos para retirar oxigeno de la solución. Después se
gasificó utilizando CO2 y se pasó a un baño maría de 46°C. Durante la gasificación se
dejó enfriar la solución para adicionarle 1g de cisteína con el fin de captar el oxígeno que
aún pudiera haber para favorecer un ambiente anaerobio.
Cuando el medio se tornó transparente o un color amarillo claro (Figura 3-2), se sirvió 4,5
mL de medio a cada uno de los tubos de ensayo agrafables (la cantidad de tubos
servidos fue igual a la cantidad que se requiriera) previamente gasificados con el fin de
mantener la anaerobiosis dentro del medio. Se taparon los tubos con un tapón y ágrafe,
para luego ser llevados al autoclave para esterilización y finalmente se almacenaron en
nevera a 4°C.
Metodología 27
Figura 3-2: Apariencia del medio de cultivo después ser llevado a calentamiento y
gasificación con CO2.
Para determinar la viabilidad de los microorganismos en los respectivos tratamientos se

siguió el protocolo IN-R-123 de Corpoica, se tomó 1 mL de muestra con una jeringa de 3
mL para ser llevado a diluciones de 1:10 hasta 10-9 (los cuales debían estar en un baño
maría a 39°C + 0,3) agitándose bien en cada dilución para mantener la homogeneidad de
los microorganismos en la solución al tomar cada alícuota.
Luego se tomó 1,5 mL de cada dilución desde 10-7 a 10-9 (si es poco viable la muestra se
tomaron diluciones inferiores a <10-7) y se sembró 0,5 mL por cada tubo (triplicado) de
medio de agar de crecimiento (Previamente fundido en un baño maría a ebullición, para
luego ser mantenido a 45+2°C), respectivamente. Los tubos sembrados se ubicaron
rápidamente en el rolling (Figura 3-3), para rotarlos bajo una fuente de agua hasta ver
totalmente cubierta la pared interna por la película de agar.
Figura 3-3: “Rolling” de tubos ágrafes con medio de cultivo agar nutritivo para el
crecimiento de bacterias anaerobias.
28 Metodología
Luego los tubos MPN se colocaron un minuto sobre una bandeja a temperatura ambiente
para asegurar la fijación del agar sobre la pared interna. Posteriormente se incubaron a
39° + 0,5°C en posición inclinada (ángulo de 30°) durante 72 horas (Figura 3-4), para
finalmente realizar conteo de unidades formadoras de colonia por mililitro (U.F.C./mL).
Figura 3-4: Incubación de los tubos de medio de cultivo agar inoculados.
3.2.3 Caracterización fisicoquímica del “principio activo”
La caracterización se basó en pruebas reportadas [31] y en los procedimientos

operativos estándar del laboratorio de control de calidad Biotécnica de Corpoica DT- R-
01 y DT-R-68.
3.2.3.1 pH
Se tomó el pH del medio de cultivo en su contenedor original por cada lote y se adicionó
con una barra magnética para mantener la muestra homogénea. Luego con un
potenciómetro SCHOTT Instruments Lab 850 (Figura 3-5) se determinó el pH del medio
por triplicado.
Metodología 29
Figura 3-5: Potenciómetro SCHOTT Instruments Lab 850 para la determinación de pH

en los tratamientos evaluados.
3.2.3.2 Actividad de agua
Se realizó con un termonconstanter Novasina® (Figura 3-6), en el que se tomó una

muestra 10mL de cada lote de “principio activo”, se colocó en el portamuestras y se
ajustó la temperatura del equipo a 4+2°C o 20+2°C según la temperatura a la que se
estaba almacenando la muestra y se dejó hasta alcanzar el equilibrio para tomar la
lectura. Se realizó por triplicado.
Figura 3-6: Equipo para la determinación de actividad de agua Thermoconstanter

Novanisa®.
3.3 Estudio de estabilidad de dos prototipos de

probiótico
30 Metodología
3.3.1 Formulación de los prototipos de probióticos y diseño del

estudio de estabilidad
Se evaluaron tres tratamientos, dos prototipos de formulación (T1 y T2) diseñados como
una emulsion W/O y un control que consistió en la mezcla de los “principios activos”
(C2B9, C2B9T1, C2B9T2). Por otra parte también se preparó y evaluó de la misma
manera cada formulación (T1 y T2) con cada “principio activo” por separado (B9T1,
B9T2, C2T1 y C2T2) y con su respectivo control (C2, B9) para ver el comportamiento de
cada formulación con cada cepa. Cada prototipo estaba compuesto de un 40% de la fase
acuosa (caldo de fermentación o la mezcla en relación 50:50 %) y un 60% de la fase
oleosa (La composición de los tratamientos se presenta en la tabla 3-1); la mezcla de
fases se realizó bajo constante gasificación con CO2 (figura 3-7) y con un homogenizador
Dynamic® a 9000 revoluciones por minuto.
Figura 3-7: Proceso de mezcla de las formulaciones bajo constante gasificación.
Tabla 3-1: Composición de los tratamientos evaluados en la prueba de estabilidad en

almacenamiento. B9, Butyrivibrio fibrisolvens; C2, Streptococcus bovis; T1, Formulación
1; T2, Formulación 2.
Vehículo Emulsi Viscosan Regulador Regulador
Tratamiento Composición oleoso Ficante tes de pH1 de pH2
(%) (%) (%) (%NaHCO3) (%Na2HPO4)
B9 Caldo de
Control - - - - -
fermentación B.
Metodología 31
B9T1 fibrisolvens (B9)

49,96 1,84 5,95 1,5 0,75
40%
B9T2
49,62 1,84 5,95 1,5 1,09
C2 Caldo de
control - - - - -
fermentación S.
C2T1 bovis (C2) 40%
49,96 1,84 5,95 1,5 0,75
C2T2
49,62 1,84 5,95 1,5 1,09
C2B9 Caldo de
Control - - - - -
fermentación S.
C2B9T1 Bovis (C2) 20%
49,96 1,84 5,95 1,5 0,75
y caldo de
C2B9T2 fermentación B.
fibrisolvens (B9) 49,62 1,84 5,95 1,5 1,09
20%
Posteriormente, se tomaron muestras de 20 ml de cada formulación (T1 y T2) y del

tratamiento control y se colocaron en frascos plásticos (capacidad 25 mL, Figura 3-8),
gasificados con CO2, estos se sellaron con su respectiva tapa plástica y parafilm. Se
prepararon 24 frascos de cada tratamiento para el almacenamiento a 25+2°C
(Temperatura ambiente) y otros 24 frascos a 4°C, de cada formulación y del “principio
activo”.
Figura 3-8: Muestras para almacenamiento de las formulaciones propuestas.
El diseño experimental para este ensayo de estabilidad, fue un diseño factorial completo
donde se evaluaron dos temperaturas, nueve tratamientos (B9, B9T1, B9T2, C2, C2T1,
C2T2, C2B9, C2B9T1, C2B9T2) en ocho tiempos (0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 días
por triplicado).
Recién empacados los tratamientos y después de 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 días de
almacenamiento, se tomaron tres frascos muestra (25 mL cada uno) de cada tratamiento
almacenados a cada temperatura, se les extrajo una alícuota aproximada de 4 mL y se le
realizaron pruebas microbiológicas, bioquímicas y fisicoquímicas.
32 Metodología
3.3.2 Pruebas microbiológicas
3.3.2.1 Cuantificación del “principio activo”
Se cuantificó siguiendo la metodología previamente descrita en el numeral 4.1.3.1.
3.3.2.2 Contenido de contaminantes
Para determinar el contenido de contaminantes [61], fue necesario preparar medios de

dilución salina (0.85% NaCl) y medio agar nutritivo en cajas petri. Los medios de dilución
se prepararon en un frasco Schott para preparar 1000 mL, se le adicionó 8.5 g Sal de
NaCI y se aforó a 1000 mL con agua destilada y desionizada. Luego se sirvió de a 9 mL
por tubo hungate, se taparon los tubos con un tapón y tapa rosca. Por último se llevaron
a esterilización (15+1 psi y 120+2°C) y se almacenaron en nevera a 4+2°C.
Luego se prepararon cajas petri con medio agar nutrivo que consistió en adicionar 8 g
agar Nutritivo para bacterias anaerobias y se disolvió en agua destilada y desionizada a 1
litro. Se llevó a esterilizar (15+1 psi y 120+2°C) y se sirvió en caliente bajo condiciones
esteriles dentro de la cámara de flujo laminar LABCONCO, de a 20 mL aproximadamente
en cajas petri esteriles. Por último se almacenaron a 4+2°C.
Con el material de trabajo disponible, la pureza fue determinada a través del contenido
de bacterias aerobias viables presentes mediante recuento en conteo en placa (Figura 3-
9) en medio de cultivo de agar nutritivo (extracto de carne, peptona de carne, agar, agua
destilada) [61]. Consistió en diluir cada tratamiento (10-1-10-3) y se sembró de a 0.1mL en
el medio nutritivo en caja. Se llevo a incubación de 35+2°C por 24 horas y se realizó el
recuento en placa. Los resultados se expresaron por unidades formadoras de colonia por
mililitro (ufc/mL).
Metodología 33
Figura 3-9: Cajas petri inoculadas con la formulación
3.3.3 Pruebas bioquímicas (actividad glucolítica)
Se determinó la actividad glucolítica del “principio activo” mediante el sustrato glucosa,

dentro de cada uno de los tratamientos (controles, T1 y T2) a diferentes tiempos,
evaluando la concentración de glucosa remanente.
Para lograr esto, se utilizó el método del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS), este consistió
en preparar el reactivo Acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS). En un volumen de 50mL de
NaOH 3.2% p/v con agitación, se le adicionó 43.8g de tartrato de sodio y potasio hasta
disolución. Luego se recubrió el recipiente ámbar con aluminio y se adicionó 1g de DNS,
se aforó a 100mL y se dejó en agitación por 12 horas aproximadamente.
Luego se preparó una curva patrón con diferentes concentraciones conocidas (0.5, 0.7,
1, 1.5, 2 g/L) de solución de glucosa a volúmenes de 3mL, se tomó 0.25 µL de cada una
de las soluciones de glucosa y se le adicionaron a cada una 0.25 µL del reactivo DNS,
luego se llevó durante 5 minutos a baño maria, se dejó enfriar a 4°C por 5 minutos para
detener la reacción. Por último se adicionó 2.5 mL de agua destilada para realizar la
lectura por absorbancia en un fluorómetro (540nm) y se realizó la curva de calibración
con el fin de conocer la reactividad del DNS preparado.
Por último se siguió uno de los protocolos internos de Corpoica, con el cual se
prepararon medios de cultivo. Esto consistió en pesar 1g de glucosa en un tubo de
Hungate y adicionar 9mL de un medio (Sal I y II, AVG, extracto de levadura, rezasurin,
NaHCO3, agua, HCl-cisteina). Y por último se llevó a esterilización por 15 minutos a
15psi.
Con base en todo lo anterior, para determinar la actividad glucolítica se tomó 1mL a cada
uno de los tratamientos (controles, T1´s y T2´s) por triplicado, para inocular el medio
cultivo a evaluar. Luego por adaptación de la bacteria se dejó por 24 horas de incubación
34 Metodología
a 39°C (figura 4-10). Luego se tomó una muestra de 2mL se llevó a centrifugación en la
centrífuga SORVALL® por 20 minutos a 3000 r.p.m. y 4°C, se retiró el sobrenadante
(250µL) y se depositó en un tubo de ensayo. Luego se le adicionó 250 µL del reactivo
DNS, para ser calentado por 5 minutos en baño maria (100+2°C), enfriado a 4°C por 5
min para detener la reacción. Se adicionó agua destilada (2.5mL) para realizar la lectura
por absorbancia a 540nm en el espetrofotómetro Synergy HT y el software GEN5. Se
obtuvo la concentración de glucosa remanente en el medio que permitió determinar la
actividad glucolitica de cada tratamiento.
Figura 3-10: Cultivos inoculados con los diferentes tratamientos a los 24 horas de
incubación.
3.3.4 Pruebas fisicoquímicas (Estabilidad de la emulsión)
3.3.4.1 pH
Se siguió el procedimiento descrito en el numeral 4.1.4.1. [31]
3.3.4.2 Aspecto macroscópico de la emulsión
A cada tratamiento se le determinó el volumen de sedimentación o cremado (agua y

emulsión), midiendo el volumen sedimentado en el frasco (previamente graduado con
diferentes volúmenes) con respecto al volumen total de la emulsión para determinar el
grado de separación de la mezcla con respecto al tiempo. Los resultados fueron
expresados en porcentaje de separación de fases con base en que cada muestra
contiene 25 mL [31].
Metodología 35
Con base en el apartado 4.1.2.
3.4 Análisis estadístico y criterios de selección de la

formulación
En principio, los resultados que se obtuvieron del estudio de estabilidad de las

formulaciones se trataron con el método estadístico de regresión lineal con base en las
normas de la ICH Q1E [62], con un error de tipo alfa (α) de 0.05 con el fin de comprobar
que los datos obtenidos son estadísticamente diferentes entre los seis prototipos de
formulación y los tres controles.
Por este mismo método estadístico se evaluó el comportamiento entre formulaciones

para determinar si existen cambios significativos de degradación de los “principios
activos” en los prototipos con respecto al tiempo tanto en conjunto como por individual.
Los criterios principales que se tuvieron en cuenta para seleccionar la mejor formulación,
dependieron en primera estancia de aquella que presente menor pérdida de viabilidad de
la mezcla bacteriana, y aquella que pudo mantener viable en mayor proporción las cepas
del producto probiótico en el tiempo. En segunda estancia la mejor formulación presentó
mayor actividad biológica con respecto a la otra. En última estancia se tuvo en cuenta la
estabilidad de la emulsión, es decir que principalmente esta mantenga el pH en el tiempo
debido a que una disminución significativa podría afectar la estabilidad del producto e
inclusive afectar la viabilidad del “principio activo” o ya sea su naturaleza metabólica.
Por tanto la matriz de selección es la siguiente:
Tabla 3-2: Matriz de selección del mejor prototipo. Se calificará de 1 a 3, en el cual 3

representa el mejor resultado y 1 el resultado más bajo.
Tratamiento
Criterios de selección Prioridad
T1 T2
Viabilidad 35%
Actividad glucolítica 30%
Separación de fases 10%
pH 15%
Actividad de agua 10%
Total ∑(X*prioridad)/100
4. Resultados y discusión
4.1 Caracterización de la fermentación de los “principios

activos”.
4.1.1 Streptococcus bovis C2
En primera instancia se realizó el control de la calidad mediante la observación por

microscopio de la morfología y de la pureza de las fermentaciones (Figura 4-1),
notándose que la morfología de cocos (diplococos y estreptococos) no motil
corresponden al microorganismo ruminal Streptococcus bovis [58]. No se evidencio la
presencia de otros tipos de morfología celular ni de contaminantes en el cultivo
analizado.
Figura 4-1: Cocos y diplococos de Streptococcus bovis C2 visualizados bajo microscopía

de contraste de fases (magnificación x 1000).
Resultados y discusión 37
Se determinó la viabilidad, pH y actividad de agua (aw) a tres lotes de 600 mL, producidos
con un inoculo del 0.01% de la bacteria y fermentados durante 12 a 14 horas. La
viabilidad se encontró entre 6.47x109 y 4.33x109 ufc/mL, el pH se mantuvo entre 5.5 y 5.6
y la aw estuvo entre 0.93 y 0.95 (Tabla 4-1).
Tabla 4-1: Valores de pH, viabilidad y actividad de agua (aw) obtenidos a partir de 3 lotes
de S. bovis C2.
Viabilidad
pH Viabilidad Log aw
Lote Réplica pH (ufc/mL) aw
promedio (ufc/mL) Viabilidad promedio
promedio
9
1 5.59 5.33x10 0.942
9
1 2 5.63 5.59 5.83x10
9 5.89x10 9.74 0.948
0.952
9
3 5.56 6.50x10 0.949
9
1 5.65 6.37x10 0.935
9 9
2 2 5.72 5.72 6.30x10 5.58x10 9.73 0.95 0.946
9
3 5.65 4.07x10 0.953
9
1 5.58 4.50x10 0.937
9 9
3 2 5.57 5.57 3.67x10 4.73x10 9.66 0.943 0.939
9
3 5.63 6.03x10 0.937
C.V (%) 0.91 0.95 0.91
9
Límite Superior 5,67 6.47x10 0.95
9
Límite inferior 5,55 4.33 x10 0,93
Los resultados de pH, viabilidad y actividad de agua no mostraron diferencias

estadísticamente significativas entre los lotes, como lo demuestra el ANOVA (α=0.05)
efectuado a un nivel de confianza del 95% (Anexo A). Tampoco se mostró un coeficiente
de varianza superior al 5% infiriendo que la producción masiva de este microorganismo
es reproducible para su posible escalamiento.
La caracterización del cultivo fermentado alcanzó la viabilidad máxima para esta clase de
microorganismo, según sus curvas de crecimiento [63], bajo condiciones en lote sin
agitación siendo el punto óptimo para realizar su formulación. El pH caracterizado es
inferior a los valores deseados para el crecimiento de bacterias anaerobias ruminales que
debería estar entre 6 y 7, esto se debe a que el sistema buffer contenido en el medio de
cultivo no es lo suficientemente efectivo para evitar la disminución de pH en el medio de
fermentación, causada por los metabolitos producidos por el Streptococcus bovis C2 [64].
El bajo pH justifica la necesidad de reajustarlo entre 6 y 7, para que la viabilidad celular
de esta bacteria anaerobia se sostenga en el tiempo, pues cuando el valor es bajo afecta
su metabolismo celular y permeabilidad de la membrana [65,66,67]. La actividad de agua
presentada en los lotes caracterizados se encuentra en un valor óptimo (> 0.90) para el
crecimiento de bacterias [39] lo cual podría favorecer la estabilidad de su posterior
formulación ya que el medio acuoso no se encuentra totalmente saturado permitiendo la
adición de excipientes para el desarrollo de la misma. Como resultado hasta este
momento, es de resaltar que la fermentación del Streptococcus bovis se encuentra en su
38 Resultados y discusión
punto óptimo como “principio activo”, teniendo en cuenta que se hace necesario reajustar
su pH, como parte de una posterior formulación, para asegurar la estabilidad del mismo
en el tiempo.
4.1.2 Butyrivibrio fibrisolvens B9
En primer lugar se realizó el control de calidad observando por microscopio la morfología

y pureza del microorganismo en las fermentaciones (Figura 4-2), evidenciando la
morfología celular de bacilos (pequeños y largos), es decir, bastones curvos que
adicionalmente contienen un flagelo, lo que explica la movilidad de esta cepa durante la
observación. Esto concuerda con lo reportado en la literatura acerca de la morfología y
movilidad del Butyrivibrio fibrisolvens [58] y demuestra la inexistencia de otros
contaminantes morfológicos.
Figura 4-2: Bacilos cortos y largos de Butyrivibrio fibrisolvens B9 visualizados bajo

microscopía de contraste de fases (magnificación x 1000).
Se determinó la viabilidad, pH y actividad de agua (aw) a tres lotes de 600 mL, producidos
con un inoculo del 0.01% de la bacteria y fermentados durante 12 a 14 horas. La
viabilidad se encontró entre 5.42*109 y 2.75*109 ufc/mL, el pH entre 5.8 y 5.9 y la aw entre
0.94 y 0.95 (Tabla 4-2).
Tabla 4-2: Valores obtenidos de determinación de pH, viabilidad y actividad de agua (aw)
de 3 lotes de la misma bacteria para su caracterización.
pH Viabilidad Viabilidad Log aw

Lote Réplica pH aw
promedio (ufc/mL) (ufc/mL) promedio Viabilidad promedio
9
1 5.96 2.20x10 0.953
9
1 2 5.87 6.04 2.30x10
9 3.24x10 9.51 0.952 0.952
9
3 5.99 5.22x10 0.95
9
1 5.87 3.76x10 0.945
9 9
2 2 5.95 5.90 5.21x10 4.86x10 9.68 0.948 0.948
9
3 5.89 5.60x10 0.951
9
1 5.84 4.80x10 0.947
9 9
3 2 5.82 5.77 3.60x10 4.30x10 9.63 0.949 0.947
9
3 5.84 4.50x10 0.946
C.V (%) 1.02 1.59 0.3
9
Límite Superior 5.95 5.42x10 0.95
9
Límite inferior 5,83 2.75 x10 0,94
Los resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los lotes,

como lo demuestra el ANOVA efectuado a un nivel de confianza del 95% (Anexo A).
Tampoco se mostró un coeficiente de varianza superior al 5% infiriendo, al igual que en
con el otro microorganismo, que la producción masiva de este fué reproducible para su
posible escalamiento con base en los criterios establecidos por Corpoica.
La caracterización del cultivo fermentado alcanzó la viabilidad máxima para esta clase de
microorganismo según sus curvas de crecimiento [63], bajo condiciones en lote sin
agitación, siendo este el punto óptimo para realizar su formulación. El pH caracterizado
es inferior a los valores deseados para el crecimiento de bacterias que debería estar
entre 6 y 7, esto debido a que el sistema buffer contenido en el medio de cultivo no es lo
suficientemente efectivo para sostener la disminución de pH en el medio de
fermentación, a pesar de encontrarse en un valor muy cercano a 6. Esta disminución de
pH es causada por los metabolitos (ácido butírico) producidos por el Butyrivibrio
fibrisolvens B9 [68]. El bajo pH que se presenta justifica, la necesidad de mantenerlo
entre 6 y 7 para que la viabilidad celular de esta bacteria anaerobia se sostenga en el
tiempo, pues un valor bajo afecta el metabolismo celular y la permeabilidad de la
membrana [65,66,67]. La actividad de agua presentada en los lotes caracterizados se
encuentra en un valor óptimo para el crecimiento de bacterias [39] lo que favorecería la
estabilidad de su posterior formulación como se explicó con el microorganismo anterior.
De igual manera que para el caso anterior, se destaca que la fermentación del
Butyrivibrio fibrisolvens se encuentra en su punto óptimo como “principio activo” para su
posterior formulación, teniendo en cuenta que se hace necesario reajustar su pH para
asegurar la estabilidad del mismo en el tiempo.
4.2 Estudio de estabilidad de dos prototipos de

probiótico
Las formulaciones se prepararon durante 3 días, teniendo en consideración los detalles

explicados en la metodología. Primero se formuló la cepa Butyrivibrio fibrisolvens B9 en
dos formulaciones (T1 y T2) y su respectivo control (B9), luego se formuló la cepa
Streptococcus bovis C2 también en dos formulaciones (T1 y T2) y su control (C2), y por
último la mezcla de ambas cepas formuladas y sin formular (T1 y T2 y control C2B9). A
estas formulaciones se les realizó un estudio de estabilidad evaluando diferentes
variables microbiológicas (viabilidad, contenido de contaminantes y actividad glucolítica)
y fisicoquímicas (pH, separación de fases y actividad de agua), con el fin de establecer el
mejor prototipo que sea capaz de retener por mayor tiempo las características deseadas
para este tipo de productos. En los siguientes apartados se presentan los resultados de
cada variable y el análisis realizado, para la determinación del mejor prototipo de
formulación (T1 o T2) para el desarrollo del producto probiótico (mezcla de las dos
bacterias).
4.2.1 Cuantificación del “principio activo” (Viabilidad)
Se determinó la viabilidad de los prototipos (formulaciones) y los controles tal como se

presenta en la Figura 4-3 (Los datos primarios se muestran en el Anexo B). A partir de
estos resultados se observa que los mayores valores de pérdida de viabilidad se dieron
para los controles C2 y C2B9 a las dos temperaturas de almacenamiento. A las
temperaturas de 4°C y 25ºC, el control C2 presentó una pérdida total de viabilidad
(100%), en comparación con los otros controles y formulaciones, después de 15 días de
almacenamiento. Para el control C2B9 se obtuvo una pérdida total de la viabilidad
después de 120 días de almacenamiento a 4°C y después de 30 días a 25°C. Las
pérdidas de viabilidad de estos controles son mayores que el control B9 y las
formulaciones B9T1, B9T2, C2T1, C2T2, C2B9T1 y C2B9T2.
Figura 4-3: Viabilidad de prototipos de formulación y medios de cultivo de probióticos

almacenados a una temperatura de 25°C (parte superior de la figura) y 4ºC (parte inferior
de la figura), respectivamente durante seis meses. Los tratamientos T1 y T2
corresponden a las cepas formuladas. Los tratamientos B9, C2 y C2B9, corresponden al
caldo de fermentación sin formular (controles).
25°C Almacenamiento
12
10
Log(UFC/mL)
8
viabilidad
0
B9 B9 T1 B9 T2 C2 C2 T1 C2 T2 C2B9 C2B9 T1 C2B9 T2
0 días 15 días 30 días 60 días 90 días 120 días 150 días 180 días
4°C Almacenamiento
12
10
8
Log(UFC/mL)
viabilidad
0
B9 B9 T1 B9 T2 C2 C2 T1 C2 T2 C2B9 C2B9 T1 C2B9 T2
Los resultados en general evidenciaron el efecto protector de la formulación sobre los

microorganismos anaerobios S. bovis y B. fibrisolvens. Esto es debido a que la
formulación, que corresponde a una emulsión W/O, reduce el contacto del oxígeno con
los microorganismos que se encuentran en la fase interna, acuosa en este caso. Otro
aspecto que es importante mencionar, corresponde a la temperatura de almacenamiento,
ya que se evidenció su efecto sobre los tratamientos (formulaciones y controles). Aunque
la tendencia es la misma en las dos temperaturas propuestas, a 4ºC ± 2ºC la pérdida de
viabilidad es menor en comparación con la pérdida a 25ºC ± 2ºC. Resultados similares
fueron encontrados por Heidebach et al., (2010), quienes microencapsularon y
almacenaron Lactobacillus (F19) y Bifidobacterioum (Bb12) a 4 y 25ºC y observaron que
la viabilidad de estas bacterias estaban afectadas por la temperatura de almacenamiento,
presentando mayor viabilidad a menor temperatura. Lo anterior se explica debido a que
el metabolismo de las bacterias se ve acelerado a medida que se incrementa la
temperatura, acelerando su ciclo de vida celular causando su muerte prematuramente
[69].
4.2.1.1 Cinética de degradación
Con el fin de determinar el comportamiento degradativo de los “principios activos” dentro

de los tratamientos, se buscó evaluar diferentes modelos, con miras a determinar aquel
orden cinético de degradación que más se ajustara a la pérdida de viabilidad de estos
microorganismos.
Para la selección del mejor modelo cinético se evaluaron tres órdenes diferentes de
degradación: orden cero (ver Ecuación 4.1), orden uno (ver Ecuación 4.2) y orden dos,
(ver Ecuación 4.3), con cada uno de las formulaciones y sus correspondientes controles.
Orden cero,
(4.1)
Orden uno,
(4.2)
Orden dos,
(4.3)
Donde [viabilidad] es la variable determinada en unidades formadoras de colonia por

mililitro (ufc/mL), k representa la constante de degradación en días-1, t el tiempo dado en
días y el valor inicial de la viabilidad del tratamiento (formulación o control).
Con las ecuaciones definidas para cada orden de degradación, se procedió a graficar y
determinar por regresión lineal, la tendencia de los resultados, su coeficiente de
correlación (R2) y la ecuación correspondiente, para todos los tratamientos y para ambas
condiciones de almacenamiento (4+2°C y 25+2°C).
En las figuras, desde la 4-4 hasta la 4-11, se presentan las gráficas que describen el
comportamiento de pérdida de la viabilidad para cada microorganismo en las condiciones
evaluadas y en las mezclas correspondientes.
orden dos) para el tratamiento B9 a condiciones de almacenamiento a 25+2°C (A.
izquierda) y 4+2°C (B. derecha).
A. B.
Orden cero Orden cero
8.00E+08 8.00E+08
7.00E+08
6.00E+08 6.00E+08
Viavilidad [UFC/mL]
Viavilidad [UFC/mL]
y = -2E+06x + 3E+08 5.00E+08

y = -4E+06x + 6E+08
4.00E+08 R² = 0.3154 4.00E+08 R² = 0.7784
3.00E+08
2.00E+08 2.00E+08
1.00E+08
0.00E+00 0.00E+00
0 50 100 150 200 -1.00E+08 0 50 100 150 200
-2.00E+08 -2.00E+08
tiempo (Días) Tiempo (Días)
Orden uno Orden uno

10 10
9 9
Viabilidad [log ufc/mL]
8 8
7 7
6 6
5 5
4 4 y = -0.016x + 9.0971
y = -0.0182x + 8.3445
3 3 R² = 0.8432
R² = 0.9014
2 2
1 1
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Tiempo (Días) Tiempo (Días)
Orden dos Orden dos

5.00E-06 5.00E-07
4.00E-06 4.00E-07
1/viabilidad [mL/ufc]
y = 2E-08x - 6E-07 3.00E-07

3.00E-06 R² = 0.7456
2.00E-07 y = 3E-09x - 8E-08
2.00E-06 R² = 0.8181
1.00E-07
1.00E-06
0.00E+00
0.00E+00 0 50 100 150 200
-1.00E-07
0 50 100 150 200
-1.00E-06 -2.00E-07
A. B.
7.00E+10 7.00E+10
6.00E+10 6.00E+10
5.00E+10
Viavilidad [UFC/mL]
5.00E+10
Viavilidad [UFC/mL]
y = -3E+08x + 5E+10 y = -3E+08x + 6E+10

4.00E+10 4.00E+10
R² = 0.6996 R² = 0.7617
3.00E+10
3.00E+10
2.00E+10
2.00E+10
1.00E+10
0.00E+00 1.00E+10
-1.00E+10 0 50 100 150 200 0.00E+00

0 50 100 150 200
-2.00E+10 -1.00E+10
Orden uno Orden uno

12 12
10 10
8 8
6 6
y = -0.0194x + 10.921 y = -0.0135x + 11.078
4 R² = 0.9718 4 R² = 0.7845
2 2
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Orden dos Orden dos

5.00E-08 5.00E-09
4.00E-08 4.00E-09
y = 2E-10x - 6E-09 y = 2E-11x - 7E-10

3.00E-08 R² = 0.5578 3.00E-09 R² = 0.5799
2.00E-08 2.00E-09
1.00E-08 1.00E-09
0.00E+00 0.00E+00
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
-1.00E-08 -1.00E-09
A. B.
8.00E+09 5.00E+10
4.50E+10
4.00E+10
Viavilidad [UFC/mL]
6.00E+09
3.50E+10
Viavilidad [UFC/mL]
y = -4E+07x + 6E+09 3.00E+10 y = -7E+07x + 2E+10

4.00E+09 R² = 0.6869 2.50E+10 R² = 0.0663
2.00E+10
2.00E+09 1.50E+10
1.00E+10
0.00E+00 5.00E+09
0 50 100 150 200 0.00E+00
0 50 100 150 200
-2.00E+09
Orden uno Orden uno

10 12
9.8
10

9.6
9.4 y = -0.008x + 9.7509 8
9.2 R² = 0.7792
6
9 y = -0.0101x + 10.404
8.8 4 R² = 0.4913
8.6
2
8.4
8.2 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Orden dos Orden dos

4.00E-09 6.00E-09
3.50E-09 5.00E-09
3.00E-09 y = 2E-11x + 9E-11

R² = 0.8027 4.00E-09 y = 2E-11x - 6E-10

2.50E-09 R² = 0.6486
2.00E-09 3.00E-09
1.50E-09 2.00E-09
1.00E-09
1.00E-09
5.00E-10
0.00E+00 0.00E+00
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
-1.00E-09
A. B.
3.00E+10 3.00E+10
2.50E+10 2.50E+10
Viavilidad [UFC/mL]
Viavilidad [UFC/mL]
2.00E+10 2.00E+10
y = -8E+07x + 1E+10 y = -9E+07x + 1E+10
1.50E+10 R² = 0.4446 1.50E+10 R² = 0.5065
1.00E+10
1.00E+10
5.00E+09
5.00E+09
0.00E+00
0 50 100 150 200 0.00E+00
-5.00E+09
0 50 100 150 200
-1.00E+10 -5.00E+09
Orden uno Orden uno

12 12
10 10
8 8
6 6 y = -0.0106x + 10.135
R² = 0.9104
4 y = -0.024x + 9.9036 4
R² = 0.8607
2 2
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Orden dos Orden dos

6.00E-07 7.00E-09
5.00E-07 6.00E-09
5.00E-09
y = 3E-09x - 5E-08 y = 3E-11x - 7E-10

4.00E-07
R² = 0.86 4.00E-09 R² = 0.7229
3.00E-07 3.00E-09
2.00E-07 2.00E-09
1.00E-09
1.00E-07
0.00E+00
0.00E+00 -1.00E-09 0 50 100 150 200
0 50 100 150 200
-1.00E-07 -2.00E-09
A. B.
3.00E+10 3.50E+10
3.00E+10
2.50E+10
Viavilidad [UFC/mL]
2.50E+10
Viavilidad [UFC/mL]
2.00E+10
y = -7E+07x + 9E+09 2.00E+10 y = -7E+07x + 1E+10
1.50E+10 R² = 0.2289
1.50E+10 R² = 0.2148
1.00E+10
1.00E+10
5.00E+09 5.00E+09
0.00E+00 0.00E+00
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
-5.00E+09 -5.00E+09
Orden uno Orden uno

12 12
10 10

y = -0.0295x + 9.5963
8 8 R² = 0.8859
6 6
4 y = -0.0204x + 9.5895 4
R² = 0.7947
2 2
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Orden dos Orden dos

6.00E-07 4.00E-05
3.50E-05
5.00E-07
3.00E-05
4.00E-07 y = 2E-09x - 3E-08 2.50E-05 y = 1E-07x - 5E-06

R² = 0.5246 R² = 0.4413
3.00E-07 2.00E-05
1.50E-05
2.00E-07 1.00E-05
1.00E-07 5.00E-06
0.00E+00
0.00E+00
-5.00E-06 0 50 100 150 200
0 50 100 150 200
-1.00E-07 -1.00E-05
orden dos) para el tratamiento C2B9 a condiciones de almacenamiento a 25+2°C (A.
A. B.
3.00E+08
3.00E+08
2.50E+08
2.50E+08
Viavilidad [UFC/mL]
Viavilidad [UFC/mL]
2.00E+08
2.00E+08 y = -2E+07x + 3E+08 y = -1E+06x + 1E+08
R² = 1 1.50E+08 R² = 0.3291
1.50E+08
1.00E+08
1.00E+08 5.00E+07
5.00E+07 0.00E+00
0 20 40 60 80 100 120 140
0.00E+00 -5.00E+07
0 2 4 6 8 10 12 14 16
-1.00E+08
Orden uno Orden uno

9 9.00E+00
8 8.00E+00

7 7.00E+00
6 6.00E+00
5 5.00E+00 y = -0.0659x + 8.4345
4 4.00E+00 R² = 0.9697
y = -0.3404x + 8.426
3 3.00E+00
R² = 1
2 2.00E+00
1 1.00E+00
0 0.00E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 20 40 60 80 100 120 140
Orden dos Orden dos

6.00E-04 2.00E-03
5.00E-04
1.50E-03 y = 2E-05x - 0.0003

4.00E-04 y = 3E-05x + 4E-09

R² = 0.6256
R² = 1
3.00E-04 1.00E-03
2.00E-04 5.00E-04
1.00E-04
0.00E+00
0.00E+00 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 14 16
-5.00E-04
A. B.
8.00E+10 3.50E+10
7.00E+10 3.00E+10
6.00E+10
Viavilidad [UFC/mL]
2.50E+10
Viavilidad [UFC/mL]
5.00E+10 y = -3E+08x + 5E+10 y = -1E+08x + 2E+10

2.00E+10
4.00E+10 R² = 0.6228 R² = 0.493
1.50E+10
3.00E+10
1.00E+10
2.00E+10
1.00E+10 5.00E+09
0.00E+00 0.00E+00
-1.00E+10 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
-5.00E+09
Orden uno Orden uno

12 12
10 10

8 8
6 y = -0.0193x + 11.166 6
y = -0.013x + 10.368
R² = 0.8184
4 4 R² = 0.8594
2 2
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Orden dos Orden dos

3.00E-08 2.00E-08
2.50E-08
1.50E-08
2.00E-08 y = 1E-10x - 5E-09

y = 6E-11x - 2E-09
R² = 0.6754
1.50E-08 R² = 0.5517
1.00E-08
1.00E-08
5.00E-09 5.00E-09
0.00E+00
0.00E+00
0 50 100 150 200
-5.00E-09 0 50 100 150 200
-1.00E-08 -5.00E-09
A. B.
7.00E+10 7.00E+10
6.00E+10 6.00E+10
5.00E+10 5.00E+10
Viavilidad [UFC/mL]
Viavilidad [UFC/mL]
4.00E+10 4.00E+10 y = -2E+08x + 3E+10

y = -3E+08x + 4E+10
3.00E+10 3.00E+10 R² = 0.3277
R² = 0.4761
2.00E+10 2.00E+10
1.00E+10 1.00E+10
0.00E+00 0.00E+00
-1.00E+10 0 50 100 150 200 -1.00E+10 0 50 100 150 200
-2.00E+10 -2.00E+10
Orden uno Orden uno

12 12
10 10
8 8
6 6
y = -0.0229x + 9.9966 y = -0.0103x + 10.391
4 4
R² = 0.7622 R² = 0.713
2 2
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Orden dos Orden dos

3.50E-07 1.00E-08
3.00E-07
8.00E-09
2.50E-07 y = 2E-09x - 3E-08

6.00E-09 y = 3E-11x - 1E-09
2.00E-07 R² = 0.5958
R² = 0.4624
1.50E-07 4.00E-09
1.00E-07
2.00E-09
5.00E-08
0.00E+00
0.00E+00
0 50 100 150 200
0 50 100 150 200
-5.00E-08 -2.00E-09
Para el caso del control C2, no fue posible evaluar los modelos cinéticos debido a que el
Streptococcus bovis C2 se degradó en menos de 15 días.
Por otra parte se observó que en la mayoría de los tratamientos evaluados a excepción
del tratamiento B9T2, se encontró una mayor correlación y linealidad en los modelos
cinéticos de orden uno, para ambas condiciones de almacenamiento.
Una vez definido el modelo cinético de degradación, aplicando la Ecuación (4.2), fue
posible determinar la constante de pérdida de viabilidad o de degradación, por regresión,
para cada caso. Estos valores se presentan en la Tabla 4-3.
Tabla 4-3: Constantes de degradación de los tratamientos almacenados a 25+2°C y

4+2°C, determinado por el método de regresión, aplicando la Ecuación (4.2).
Constante Constante
Tratamiento degradación Tratamiento degradación
-1 -1
[día ] [día ]
25°C de almacenamiento 4°C de almacenamiento
B9 0.041 B9 0.037
B9T1 0.044 B9T1 0.032
B9T2 0.018 B9T2 0.023
C2 1.004 C2 1.004
C2T1 0.055 C2T1 0.023
C2T2 0.046 C2T2 0.069
C2B9 0.640 C2B9 0.152
C2B9T1 0.046 C2B9T1 0.030
C2B9T2 0.053 C2B9T2 0.023
Con respecto a las constantes de degradación, se observó que los tratamientos control
C2 y C2B9 presentaron los mayores valores, lo que explica su corta viabilidad en el
tiempo, bajo ambas condiciones de temperatura de almacenamiento. Por otra parte, se
observó que entre formulaciones, T1 y T2, para el mismo “principio activo”, las
constantes de degradación no difieren mucho y por tanto para poder determinar con más
certeza qué formulación confiere mayor estabilidad, mirando por el momento sólo la
viabilidad, la evaluación de la influencia de la temperatura sobre cada uno de ellas es un
aspecto muy importante a considerar. El aumento de la temperatura permite acelerar la
degradación que en condiciones normales de almacenamiento tomaría más tiempo
alcanzarla. Con el ánimo de evaluar la influencia de este parámetro, se determinó la
energía de activación, haciendo claridad que apenas es una aproximación a este valor,
teniendo en cuenta que sólo se evaluaron dos temperaturas y que por tanto podría
hablarse de que se calculó algo así como una “energía de activación aparente”.
La energía de activación aparente se determinó utilizando la ecuación de Arrhenius,

Ecuación (4.4).
(4.4)
Donde k es la constante de degradación, A es la constante de Arhenius (que involucra

las constantes de Planck y Boltzmann), Ea es la energía de activación y T es la
temperatura de almacenamiento evaluada [15].
En la figura 4-12 se presenta el comportamiento de la variación de la constante de

velocidad de degradación (calculadas asumiendo orden 1, de acuerdo a lo determinado
anteriormente) con respecto al cambio de temperatura. A partir de la pendiente es posible
calcular el valor aproximado de la energía de activación. Se agruparon las gráficas para
cada microorganismo y la última corresponde a la mezcla de ellos, mostrando en cada

caso la ecuación resultante.
Figura 4-12: Gráficas de Arrhenius de todos los tratamientos. A) Tratamientos B9, B9T1
y B9T2; B) Tratamientos C2, C2T1 y C2T2; C) Tratamientos C2B9, C2B9T1 y C2B9T2.
A)
Tratamientos Butyrivibrio fibrisolvens
-1
-1.1
-1.2
-1.3
Log (k)
-1.4 B9 y = -219.93x - 0.6396

-1.5 B9T1 y = -618.97x + 0.7272
-1.6 B9T2 y = 397.92x - 3.0699
-1.7
-1.8
0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037
1/temperatura [k-1 ]
B)
Tratamientos Streptococcus bovis
-1
-1.1
-1.2
-1.3
Log (k)
C2T1 y = -1395x + 3.4239

-1.4
C2T2 y = 629.68x - 3.4411
-1.5
-1.6
-1.7
0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037
C)
Tratamientos mezcla bacterias
0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8 C2B9
Log (k)
y = -2803x + 9.3005
-1 C2B9T1 y = -674.57x + 0.9115
-1.2 C2B9T2 y = -1364x + 3.2992
-1.4
-1.6
-1.8
0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037
Con base en las gráficas del modelo de Arrhenius se determinaron las energías de
activación (Ea) correspondientes a cada tratamiento evaluado, los cuales se presentan en
la tabla 4.4 [15].
Tabla 4-4: Energías de activación determinadas para cada uno de los tratamientos con
base en las temperaturas de almacenamiento de 25+2°C y 4+2°C.
Tratamiento
B9 B9T1 B9T2 C2 C2T1 C2T2 C2B9 C2B9T1 C2B9T2
*
Ea
[Calorias/ 1006.41 2832.44 -1820.91 - 6383.61 -2878.34 12826.7 3086.87 6241.75
mol]
*Ea, energía de activación.
Las energías de activación reflejan qué tratamientos (controles y formulaciones) se

afectaron en mayor medida, por influencia de la temperatura en su degradación. En la
tabla anterior se observa que las formulaciones B9T2 y C2T2 presentan una energía de
activación negativa, esto podría explicarse teniendo en cuenta que cuando estuvieron
almacenados a la temperatura de 25+2°C se contaminaron por un hongo que pudo
afectar el resultado. Por tanto, no es recomendable hacer comparaciones entre los
tratamientos B9, B9T1 y B9T2 ni entre los tratamientos C2, C2T1 y C2T2.
Por otro lado, no se observó contaminación por hongos a 25+2°C en los tratamientos
compuestos por la mezcla de los “principios activos” (C2B9, C2B9T1 y C2B9T2), lo que
permitió comparar las energías de activación. El mejor comportamiento lo presentó la
formulación C2B9T1, debido a que presentó una energía de activación menor que el
tratamiento control (C2B9) y la formulación C2B9T2, indicando una mayor estabilidad.
Con la información generada, partiendo del análisis cinético realizado, es posible

determinar de manera preliminar una “vida útil tentativa”, que en ningún momento
correspondería a la vida útil definitiva del producto, puesto que hasta el momento el
diseño está en una fase de formulación y aspectos como el envase y el escalamiento de
la producción todavía no se han considerado. Con el cálculo de este valor de “vida útil
tentativa” se pretende disponer de una herramienta adicional para elegir la formulación
más estable.
El valor de vida útil tentativa se determinó a partir de las gráficas correspondientes a los
modelos ajustados a un orden uno, a ambas temperaturas, que se presentaron en las
Figuras 4-4 a 4-11. Este cálculo se realizó mediante el análisis de regresión, calculando
los límites de confianza inferiores (Anexo H) y teniendo como criterio el nivel mínimo
permitido de viabilidad para productos probióticos (1x107 ufc/mL) [60,70]. Los resultados
de estas “vidas útiles tentativas” se presentan en la tabla 4-5.
Tabla 4-5: Resultados de las “vidas útiles tentativas” de los “principios activos” en los
tratamientos almacenados a 25+2°C y 4+2°C.
“Vida útil” “Vida útil”
Tratamiento Tratamiento
[Días] [Días]
B9 29 B9 90
B9T1 179 B9T1 >180
B9T2 >180 B9T2 >180
C2 No aplica C2 No aplica
C2T1 72 C2T1 >180
C2T2 66 C2T2 44
C2B9 No aplica C2B9 6
C2B9T1 159 C2B9T1 >180
C2B9T2 64 C2B9T2 >180
De la tabla 4-5 se observan resultados similares entre los tratamientos B9T1 y B9T2 y
diferencias entre los tratamientos C2T1 y C2T2, evidenciando que la formulación T1
presenta mayor estabilidad ya que su “vida útil tentativa” supera considerablemente a la
formulación T2. De manera similar, para los tratamientos C2B9T1 y C2B9T2, la
formulación T1 fue más estable a condiciones de 25+2°C, mientras a 4°C su
comportamiento fue similar.
De acuerdo a lo descrito la formulación T1 podría seleccionarse debido a que conserva la

viabilidad de ambas bacterias de manera más eficiente que T2, incluso a condiciones de
25+2°C. Por otra parte, es importante destacar que el formulado T1 presenta una “vida
útil” mayor a 180 días a condiciones de almacenamiento de 4+2°C con ambos “principios
activos” de manera independiente, lo que no sucede con T2, asegurando que la mezcla
de los dos microorganismos con esta formulación sea la más adecuada.
Estos resultados se compararon con el estudio realizado por Soto et al., (2010) en el que
se utilizó bacterias de origen ruminal con acción probiótica para microencapsulación [60].
El estudio fue llevado a cabo durante 63 días, determinando que al cabo de 35 días la
viabilidad bacteriana se encontraba por debajo del límite mínimo requerido (1x107
ufc/mL), a temperatura de 4°C. Esto contrasta con los 180 días obtenidos para la
formulación T1 a la misma temperatura para las cepas individuales y en mezcla,
resultados mostrados anteriormente.
4.2.2 Contenido de contaminantes
Esta evaluación garantiza la inocuidad que va a tener la formulación al momento de ser

administrada a los terneros neonatos y la estabilidad del producto en almacenamiento, ya
que la presencia de otros microorganismos aerobios de tipo mesófilos puede afectar la
viabilidad y la actividad del activo, o tener un efecto negativo en las características

fisicoquímicas de la emulsión.
En los tratamientos evaluados se presentaron contaminantes por bacterias aerobias.

Estas bacterias se observaron por microscopía (Figura 4-13) y presentaron una
morfología tipo bacilos de gran tamaño y no motiles.; en la figura 4-13 se encuentran
señalados dentro de círculos rojos.
Figura 4-13: Microscopía de una colonia de contaminantes aerobios mesófilos (bacilos

de gran tamaño, no motiles) encontrados en el tratamiento C2T1.
Para todos los tratamientos (Tablas 4-6 y 4-7), tanto a 25°C como a 4°C de temperatura
de almacenamiento, se obtuvo una concentración de contaminantes aerobios menor a
1x105 ufc/mL (el Anexo C presenta los datos primarios de contaminantes aerobios),
indicando que la cantidad de contaminantes encontrados no está por fuera de los límites
generales permitidos por el ICA, para alimentos animales [71].

de almacenamiento a 25°C.
Almacenamiento 25°C
Contaminantes aerobios (ufc/ml)
Prototipo\Muestreo 0 15 días 1 mes 2 mes 3 mes 4 mes 5 mes 6 mes
3 3 3 3 2 3 4
B9 10 1x10 1x10 1x10 1x10 6.67x10 9.67x10 3.00x10
3 3 3 3 3 2 2
B9 T1 10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 3.33x10 6.67x10
3 3 3 3 3 3 3
B9 T2 10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10
C2 10 0 0 0 0 0 0 0
3 3 4 4 3 2 3
C2 T1 10 1x10 1x10 4.07x10 4.40x10 1x10 3.33x10 1.67x10
3 3 4 4 2 2 4
C2 T2 10 2.33x10 1x10 1.30x10 1.07x10 6.67x10 6.67x10 1.84x10
3
C2B9 10 1x10 0 0 0 0 0 0
3 3 2 2 2 2 3
C2B9 T1 10 1x10 3x10 6.67x10 6.67x10 3.33x10 6.67x10 1x10
3 3 3 3 3 2 3
C2B9 T2 10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 3.33x10 4.67x10
Por otra parte, se observó que los tratamientos almacenados a 4+2°C presentaron menor
concentración de contaminantes con respecto a los almacenados a 25°C. Esto se debe a
que en condiciones de almacenamiento a baja temperatura, el metabolismo de bacterias
mesófilas es lento y por tanto su proliferación también lo es [20,66], disminuyendo así el
riesgo de superar rápidamente los límites permitidos por el Instituto Colombiano
Agropecuario (ICA) para alimentos veterinarios [71].

de almacenamiento a 4°C.
Almacenamiento 4°C
Contaminantes aerobios (ufc/ml)
Prototipo\Muestreo 0 15 días 1 mes 2 mes 3 mes 4 mes 5 mes 6 mes
3 3 3 3 3 3 2
B9 10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 6.33x10 3.33x10
3 3 3 3 3 3 3
B9 T1 10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10
3 3 3 3 3 3 3
B9 T2 10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10
3
C2 10 1x10 0 0 0 0 0 0
3 3 4 3 4 3 3
C2 T1 10 1x10 1x10 1.20x10 4.33x10 3.70x10 3.33x10 2.67x10
3 3 3 3 4 3 3
C2 T2 10 1x10 1x10 8.00x10 2.00x10 3.67x10 1.33x10 2.00x10
3 3 3 3
C2B9 10 1x10 2.00x10 3.00x10 5.33x10 0 0 0
3 3 3 3 3 3 3
C2B9 T1 10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10
3 3 2 3 3 3 3
C2B9 T2 10 1x10 1x10 3.30x10 1x10 1x10 1x10 1x10
Es de mencionar también, que se presentaron contaminantes diferentes a bacterias

mesófilas, puesto que se observó el crecimiento de un hongo durante el tiempo de
estudio en varios de los tratamientos almacenados a 25°C (Figura 4-14).
Figura 4-14: Contaminación de uno de los tratamientos C2T2 a seis meses de

almacenamiento a 25°C (Izquierda), en comparación con el tratamiento C2T2 que no
sufrió contaminación a 5 meses de almacenamiento a 4°C (derecha).
El hongo presentado en los tratamientos fue examinado en la Planta de Bioproductos del

centro de biotecnología y bioindustria en Corpoica, determinando que el microorganismo
presente fue un hongo del género Thrichoderma. Esto explica algunas incoherencias en
los resultados obtenidos a 25°C, a diferencia de los tratamientos almacenados a 4°C (por
ejemplo el incremento de pH en los tratamientos B9, C2 y C2B9 almacenados a 25°C),
ya que a condiciones de baja temperatura se desfavorece su crecimiento. La razón
principal por la que se presentó este problema fue dada por la posible contaminación
cruzada que se presentó, ya que en la Planta de producción de Corpoica en el Centro de
biotecnología y bioindustria, se trabaja con este género (Thrichoderma) y hasta ahora se
está incursionando en la producción con bacterias anaerobias.
4.2.3 Determinación de la actividad glucolítica
En la figura 4-15 se presentan los resultados de la determinación de la actividad

glucolítica de los tratamientos y los datos primarios de estos resultados se muestran en el
Anexo D. Estos resultados permiten observar la posible pérdida de actividad en el tiempo
de almacenamiento dada por las condiciones de estrés o por la formulación.
Figura 4-15: Resultados de la actividad glucolítica de los tratamientos evaluados a través

del tiempo de estudio bajo condiciones de almacenamiento de 25+2°C (parte superior de
la figura) y 4+2°C (parte inferior de la figura), respectivamente.
25°C almacenamiento
4.50E-02
Acitivdad glucolitica (U/mL)
4.00E-02
3.50E-02
3.00E-02
2.50E-02 fgh
2.00E-02
1.50E-02
1.00E-02
5.00E-03
0.00E+00
Tratamiento
4.50E-02
4°C almacenamiento
4.00E-02
Acitivdad glucolitica (U/mL)
3.50E-02
3.00E-02
2.50E-02
2.00E-02
1.50E-02
1.00E-02
5.00E-03
0.00E+00
Tratamiento
En general, se observó que tanto para los tratamientos a 25°C como para aquellos
almacenados a 4°C, los controles no pudieron retener la actividad glucolítica en el
tiempo, debido al pH en el que se encontraban (Figura 4-16 en el apartado 4.2.5.1). Esto
puede ser debido a que a pH inferiores a 6, las bacterias se encuentran con una afección
en su permeabilidad celular y los H+ del medio se intercambian por K+ (ión potásico) o
Na+ (ión sódico), lo que induce al agotamiento de reservas de ATP (adenosintrifosfato)
[65], causando disminución en el rendimiento de la degradación de la glucosa (actividad
glucolítica).
Otro efecto que se observó a través del tiempo en los tratamientos C2T1, C2T2, C2B9T1
y C2B9T2 fue la disminución de su actividad glucolítica, aunque no tan marcada como en
los tratamientos control C2, B9 y C2B9. Este efecto podría deberse al envejecimiento
celular ya que de por sí el Streptococcus bovis es muy activo metabólicamente [63] y
estas células al ser llevadas a un nuevo medio de crecimiento con fuente de glucosa,
presenta un mayor tiempo de latencia para su proliferación celular a medida que
transcurre el tiempo en comparación a lo sucedido al inicio del estudio [13]. Este efecto
también se observó con los tratamientos B9T1 y B9T2 a condiciones de almacenamiento

de 25°C a pesar de no ser tan activas como el Streptococcus bovis [63].
Cuando se evaluaron los resultados por el método estadístico de regresión (Anexo D), se
obtuvieron las constantes de pérdida de actividad glucolítica (Tabla 4-8). También se
determinó que no hay diferencias estadísticamente significativas del comportamiento de
la actividad glucolítica entre las formulaciones que contenían el mismo “principio activo“
pero sí con los controles C2 y C2B9 en ambas condiciones de almacenamiento (4+2°C y
25+2°C). Este mejor comportamiento de la actividad glucolítica de las formulaciones
frente a los controles, posiblemente se debe a que la actividad de agua y el pH se
sostiene en condiciones relativamente óptimas en el tiempo.
Tabla 4-8: Resultados de la velocidad de cambio de la actividad glucolítica durante el

almacenamiento de los tratamientos, obtenidos por el método estadístico de regresión
(α=0.05).
constante Constante
Tratamiento de pérdida Tratamiento de pérdida
A.G./día A.G./día
B9 9.21x10-05 B9 6.91 x10-05
B9T1 4.61x10-05 B9T1 9.21 x10-05
B9T2 2.30 x10-05 B9T2 2.30 x10-05
C2 5.53 x10-03 C2 2.76x10-03
C2T1 1.15 x10-04 C2T1 9.21 x10-05
C2T2 1.38 x10-04 C2T2 1.38 x10-04
C2B9 2.30 x10-03 C2B9 4.61 x10-04
C2B9T1 9.21 x10-05 C2B9T1 9.21 x10-05
C2B9T2 8.52 x10-03 C2B9T2 1.15 x10-04
*A.G., actividad glucolítica
Se observó que tanto la formulación T1 como T2 presentaron un buen comportamiento

de la actividad glucolítica con los “principios activos”, tanto de forma individual como en
conjunto y esta actividad no se vio afectada significativamente por la temperatura de
almacenamiento. De esta manera, se puede decir que cualquiera de las formulaciones,
T1 o T2, es apta para el desarrollo del producto probiótico con relación al parámetro de
sostener por mayor tiempo la actividad glucolítica de las bacterias.
4.2.4 Pruebas fisicoquímicas (Estabilidad de la emulsión)
4.2.4.1 pH
En la Figura 4-16 se presentan los resultados de la determinación de pH de los

tratamientos y los datos primarios correspondientes se muestran en el Anexo E. Es de
recordar que para asegurar la viabilidad de los microorganismos, este parámetro debe
mantenerse entre 6 y 7.5 [78]. En las dos temperaturas evaluadas, los controles y la
formulación C2T2 presentaron valores de pH por debajo de 6, a diferencia de lo sucedido
con las formulaciones B9T1, B9T2, C2T1, C2B9T1 y C2B9T2, cuyo pH bajo condiciones
de refrigeración (4+2°C), se mantuvo por encima de 6 cumpliendo con las características
deseadas para el desarrollo de este probiótico, durante los seis meses de
almacenamiento. A condiciones de 25+2°C estas formulaciones presentaron valores de
pH más alto que los tratamientos control (C2, B9, C2B9) y el tratamiento C2T2, estando
para algunos ensayos por debajo de 6.
Figura 4-16: Resultados del pH de los tratamientos evaluados a través del tiempo de
estudio, bajo condiciones de almacenamiento de 25°C (parte superior figura) y 4°C (parte
inferior figura) respectivamente.
9
8
7
6
5
pH
4
3
2
1
0
4°C almacenamiento
9
8
7
6
5
pH
4
3
2
1
0
En la tabla 4-9 se presentan los cálculos del porcentaje de variación del pH,
considerando el valor final respecto al inicial y la constante de cambio de pH en el tiempo
(velocidad de cambio), determinado a partir del análisis de regresión. Los datos primarios
y los análisis correspondientes se presentan en el Anexo E.
Tabla 4-9: Resultados del porcentaje de variación del pH y velocidad de cambio de pH

durante el almacenamiento de los tratamientos a 6 meses.
% variación Constante % variación Constante

Tratamiento *1 *2 Tratamiento
de pH ΔpH /día de pH ΔpH/día
B9 9.000 -4.60x10-03 B9 8.480 1.00x10-03
B9T1 10.54 6.90x10-03 B9T1 0.090 7.00x10-04
B9T2 12.91 2.00x10-03 B9T2 2.030 1.30x10-03
C2 9.580 -1.43x10-02 C2 3.440 5.10x10-03
C2T1 8.740 3.50x10-03 C2T1 0.150 8.00x10-04
C2T2 22.64 5.90x10-03 C2T2 12.66 3.70x10-03
C2B9 8.500 -4.00x10-03 C2B9 6.410 2.10x10-03
C2B9T1 5.580 5.00x10-03 C2B9T1 0.980 8.00x10-04
C2B9T2 11.43 3.00x10-03 C2B9T2 0.790 1.50x10-03
*1
% variación pH:
*2
ΔpH, variación de pH.
De acuerdo a los resultados de la tabla 4-9, se evidencia en cuanto a la velocidad de

cambio, que esta es mayor a 25°C que a 4°C, poniendo de manifiesto el efecto del
aumento de la temperatura sobre la magnitud del cambio de pH. Por otra parte, tanto la
velocidad de cambio como el porcentaje de variación del pH, muestran que las
formulaciones T1 y los tratamientos con el microorganismo Butyrivibrio fibrisolvens
presentan valores menores en comparación con los controles, las formulaciones T2 y los
tratamientos con el microorganismo Streptococcus bovis, presentándose el cambio más
drástico con la formulación C2T2. Los resultados evidenciaron que el tratamiento C2T2
mostró una variación en el pH de más de un 12% con respecto a su valor inicial a 4°C,
mientras que a 25°C de almacenamiento, la variación en el pH fue de más de un 22%.
Teniendo en consideración las recomendaciones de la OMS [73] respecto a lo que se
considera un cambio significativo en una formulación, que está asociado a que no se
presenten variaciones mayores al 5% con respecto a sus características iniciales en un
producto, podría afirmarse que esto se cumplió a la condición de 4°C, para las
formulaciones T1 y T2, con excepción de C2T2.
El pH de las formulaciones puede verse afectado por el metabolismo propio del

microorganismo o por factores inherentes a la formulación. Respecto al primer caso, se
sabe que los espacios intracelulares de las bacterias ruminales tienen una alta
concentración de K+ y una baja concentración de Na+ [74]. El potasio está involucrado en
el mantenimiento de la presión de turgencia, la activación de enzimas y la homeostasis
del pH intracelular [75]. Las bacterias expuestas a cambios de pH intracelular, estrés
osmótico, o cambios en el potencial de membrana pueden ganar o perder grandes
cantidades de potasio [76]. La bacteria ruminal posee un pH celular neutro o ligeramente
alcalino debido al transporte de electrones hacia el exterior de la membrana celular.
Cuando la bacteria se encuentra en un medio ácido, como ocurre en el caso del caldo de
fermentación sin formular, como consecuencia de la acidificación del medio por la
producción de ácido láctico, el pH posiblemente afecta la permeabilidad celular y los
iones H+ del medio son intercambiados por K+ o Na+. La pérdida de K+ produce un menor
volumen de agua intracelular afectando la turgencia [80], además la bacteria responde a
la acidificación del citoplasma hidrolizando ATP vía ATPasa para transportar H+ fuera de
la célula. También activa otra bomba ATP para incrementar la excreción de K+ y Na+ para
restablecer el gradiente iónico, lo que puede conducir al agotamiento de las reservas de
ATP y a la muerte celular [65]. Respecto a los factores inherentes a la formulación, en un
estudio realizado por Ferreira et al., (2010) donde se evaluó la estabilidad de diferentes
emulsiones hechas con aceite vegetal, se observó que después de tres meses de
almacenamiento el pH de todas las emulsiones se redujo. Este fenómeno fue explicado
por la posible liberación de ácidos grasos después de una hidrólisis parcial de los
triglicéridos, fenómeno que ocurre generalmente por acción del oxígeno, la temperatura o
la luz [60].
Para la selección del mejor tratamiento para la formulación del probiótico fue necesario
realizar una regresión (α=0.05) de los datos evaluando el comportamiento del pH,
determinando una aproximada velocidad de disminución de pH en el tiempo a través de
las pendientes (tabla 4-9). De este análisis se obtuvo que todos los tratamientos T1
presentaban menor velocidad de disminución de pH y menor porcentaje de degradación
(menor al 5% los tratamientos almacenados a 4°C). Este efecto se debe a que la
formulación T1 maneja como agente buffer al bicarbonato de sodio (NaHCO3) que tiene
un pKa de 7.21. De esta manera al tenerse un pH en la formulación entre 6 y 7, permite
que haya una mayor concentración del anión HCO3-, logrando un mayor efecto alcalino
que soporta y neutraliza la presencia de ácidos en la formulación, ácidos que son
generados por los metabolitos de los microorganismos o por hidrólisis de los triglicéridos
presentes en la fase oleosa. La formulación T2 no presentó el mismo efecto de sostener
el pH en el tiempo, debido a que el ión fosfato ácido (HPO4=), en el equilibrio
correspondiente, tiene un pKa de 6.8, que al pH de la formulación (entre 6 y 7) ejerce un

efecto tampón insuficiente para contrarrestar los metabolitos ácidos de los “principios
activos” [46] y los posibles ácidos producidos por descomposición de la fase oleosa [32].
De acuerdo a este análisis, las formulaciones T1 presentan unas condiciones más
adecuadas para mantener el pH de los “principios activos” en el tiempo, logrando un pH
superior a 6 en los tratamientos C2T1, B9T1 y C2B9T1 en ambas temperaturas de
almacenamiento.
4.2.4.2 Aspecto macroscópico de la emulsión
En el desarrollo de prototipos tipo emulsión se busca que está mantenga su estabilidad

durante el máximo tiempo posible, es decir, que no presente separación de fases. Entre
los signos de inestabilidad es aceptable que se presente cremado o sedimentación ya
que este puede restablecer fácilmente la homogeneidad del prototipo por simple
agitación, recuperando su apariencia física como formulación.
Teniendo en cuenta lo anterior se presentó inestabilidad cuando en las formulaciones

hubo separación de fases. En el anexo F se muestran los volúmenes de fase oleosa
separada en caso de que se hubiera presentado esta inestabilidad y se muestra su
representación gráfica en la figura 4-17, correspondiente a la temperatura de 25°C, pues
a 4°C no se evidenció este problema.
Figura 4-17: Resultados de la separación de fases de los tratamientos evaluados a

través del tiempo de estudio bajo condiciones de almacenamiento de 25+2°C.
70
60
Separación de fases (%)
50
40
30
20
10
0
B9 T1 B9 T2 C2 T1 C2 T2 C2B9 T1 C2B9 T2
Tratamiento
15 días 30 días 60 días 90 días 120 días 150 días 180 días
Los tratamientos almacenados a 4+2°C demostraron estabilidad durante el tiempo de

estudio ya que solo se presentó cremado, a excepción del tratamiento C2B9T2 (Figura 4-
18) que no presentó ninguna inestabilidad. A esta temperatura de almacenamiento las

formulaciones T1 y T2 cumplen con los criterios de estabilidad de formulaciones tipo
emulsión durante el tiempo de estudio. Por otra parte, a 25°C se observaron diferencias
en la estabilidad de las formulaciones, permitiendo evidenciar cuál de los tratamientos
podría ser el más estable.
Figura 4-18: Prototipos de formulación del tratamiento C2B9T2 al cabo de 6 meses de

almacenamiento a 4+2°C.
Los resultados mostrados en la figura 4-17 reflejan que los tratamientos B9T1, B9T2 y
C2T1 almacenados a 25+2°C presentaron inestabilidad a partir del segundo mes a
diferencia del tratamiento C2B9T2, el cual presentó solo separación de fases a partir de
los 180 días. Por otra parte al comparar los tratamientos que contenían el mismo
“principio activo”, se observó que las formulaciones T2 presentaron mayor estabilidad.
La inestabilidad presentada en los tratamientos formulados a 25°C (figura 4-19) se dió

posiblemente a dos aspectos: uno podría ser por la descomposición de los triglicéridos
presentes en la fase oleosa (aceite vegetal) [39], generando ácidos grasos de cadena
larga y el segundo por la producción de metabolitos (ácido láctico y ácido butírico) del
Butyrivibrio fibrisolvens y Streptococcus bovis. Estas moléculas fueron posiblemente
neutralizadas por el sistema buffer formando su sal sódica, la que presuntamente
potenció su poder anfipático, que las convierte en “tensioactivos” orientadores O/W por
ser sales monovalentes de ácidos grasos o relacionados [77], generando una
desestabilización de la micela que puede llevar a la separación de fases de la emulsión.
Figura 4-19: Separación de fases en uno de los tratamientos almacenados a 25+2°C a

los 180 días de almacenamiento.
Por último, al evaluar los tratamientos que contenían la mezcla de los dos “principios
activos” (C2 y B9), se observó que los volúmenes de separación de fases son menores
con respecto a las formulaciones en las que estos se encontraban separados. La razón
de lo anterior podría deberse a interacciones sinérgicas entre ambas cepas, que consiste
en aprovechar los ácidos grasos volátiles generados (ácido láctico y butírico) por uno de
los microorganismo, el cual es aprovechado por la otra bacteria para la síntesis de
aminoácidos intracelulares [78], evitando así el efecto de formación de sales causado por
el sistema buffer que desestabiliza la emulsión.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se determinó que la formulación que

presentó menor separación de fases fue la T2, lo que adicionalmente podría relacionarse
con lo explicado para el pH, en donde se consideró cada uno de los buffers empleados,
en los que las formulaciones T2, buffer fosfatos (pKa 6.8), eran menos resistentes a la
variación del pH, generando valores más ácidos con respecto a las formulaciones T1
(pKa 7.21), contribuyendo a la estabilidad de la emulsión ya que todos los ácidos
producidos (metabolitos bacterianos y ácidos grasos de la fase oleosa) no son
neutralizados formando su sal correspondiente, sales que podrían contribuir a ejercer un
efecto emulsificante que afecte la estabilidad de las micelas llevando a la separación de
fases [77].
Por lo general para el crecimiento de bacterias, se requiere una actividad de agua que
esté por encima de 0.9 [39], así que por debajo de ella implica detener el crecimiento y
alterar la velocidad metabólica de las bacterias más no su muerte inmediata [38]. Es así
que a actividades de agua inferiores a 0.9 puede ocurrir deterioro celular [40], y por lo
tanto el producto podría mantenerse por encima de la viabilidad requerida para ejercer su
función probiótica [79].
En la figura 4-20 se presentan los resultados obtenidos de la actividad de agua de los

tratamientos y los datos primarios de estos resultados se muestran en el Anexo G, con el
fin de observar si se presentan cambios relevantes en el tiempo de almacenamiento dada
por las condiciones de estrés, por la formulación y/o las características fisicoquímicas de
los tratamientos.
Figura 4-20: Actividad de agua aw de los tratamientos evaluados a través del tiempo de
estudio, bajo condiciones de almacenamiento de 25°C y 4°C, respectivamente.
1
0.9
0.8
Actividad de agua (aw)
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Tratamientos
0 15 30 60 90 120 150 días 180
4°C almacenamiento
1
0.9
0.8
Actividad de agua (aw)
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Tratamientos
0 15 30 60 90 120 150 180
Teniendo en cuenta lo anterior, el criterio de selección consistió en preferir aquella

formulación que pudiera retener en mayor proporción la actividad de agua en el tiempo.
Es así que con base en los resultados, se encontró que por lo general en todos los
tratamientos evaluados, la actividad no disminuyó de 0.86 y por tanto se mantuvo en un
rango cercano de 0.9 que es el punto mínimo requerido para el crecimiento de las
bacterias.
Para la selección del mejor tratamiento para la formulación del probiótico, fue necesario
realizar una regresión de los datos (Anexo G) determinando el comportamiento de la aw
en el tiempo y la velocidad de disminución aw a través de las pendientes (tabla 4-10). La
regresión de los resultados indicaron que no hay diferencias estadísticamente
significativas entre todos los tratamientos evaluados (C2, B9, C2B9), demostrando que el
comportamiento de la actividad de agua en el tiempo no se ve influenciada por los
prototipos T1 y T2.
Tabla 4-10: Resultados de porcentaje de variación de aw y su velocidad de cambio de aw

durante el almacenamiento de los tratamientos, empleando el análisis de regresión
(α=0.05).
Constante Constante
Tratamiento % Δaw*1 Tratamiento % Δaw*1
Δaw/día Δaw/día
B9 3.19 3.00x10-04 B9 4.41 2.00 x10-04
B9T1 1.61 2.00 x10-04 B9T1 1.39 1.00 x10-04
B9T2 2.53 2.00 x10-04 B9T2 3.76 3.00 x10-04
C2 1.28 1.00 x10-04 C2 1.35 1.00 x10-04
C2T1 1.07 2.00 x10-04 C2T1 0.41 1.00 x10-04
C2T2 0.41 2.00 x10-04 C2T2 0.07 1.00 x10-04
C2B9 2.58 8.00 x10-04 C2B9 3.42 2.00 x10-04
C2B9T1 0.63 1.00 x10-04 C2B9T1 0.3 5.00 x10-05
C2B9T2 0.48 8.00 x10-05 C2B9T2 2.87 2.00 x10-05
*1
Δaw, variación de actividad de agua
Por otro lado se determinó que la actividad de agua varió más en los tratamientos control,
por efecto del tiempo, debido a la producción de ácidos grasos volátiles (AGV´s) por el
metabolismo de estas bacterias, aumentando su concentración en la fase acuosa. Caso
contrario se dio en las formulaciones, debido a que los AGV´s producidos forman su sal
por el sistema buffer de la formulación, generando lactato (Streptococcus bovis C2) ó
butirato (Butyrivibrio fibrisolvens B9), los cuales son anfipáticos y pueden ubicarse en las
barreras interfaciales [77], evitando aumentar la concentración de sustratos contenidos
en la fase acuosa.
De acuerdo a estos resultados de actividad de agua, se observa que no existieron

cambios significativos que superaran un 5% en todos los tratamientos. Además este
parámetro no se ve influenciado por las temperaturas de almacenamiento propuestas
(25°C y 4°C), siendo indistinta la formulación que se emplee para el diseño del producto
probiótico.
4.3 Tratamiento de resultados y criterios de selección de

la formulación
Teniendo en cuenta todos los parámetros evaluados como viabilidad, actividad

glucolítica, pH, separación de fases y actividad de agua, se determinó bajo una matriz de
decisiones el mejor prototipo de formulación. Para tal fin se consideraron los parámetros
que presentaron mayor estabilidad a condiciones de almacenamiento a 4°C, cumpliendo
con todas las especificaciones deseadas.
La matriz de decisiones se presenta en la tabla 4-11. Los criterios consistieron en

catalogar con un puntaje de 1 a 3 cada parámetro, donde 3 es el mejor tratamiento y 1 el
menos favorable para la mezcla de las cepas Butyrivibrio fibrisolvens B9 y Streptococcus
bovis C2, teniendo en cuenta la compatibilidad y estabilidad de cada microorganismo en
los prototipos (T1 y T2). Por consiguiente, se procedió a seleccionar aquella formulación
que presentara mayor puntaje acorde a las características primarias del producto, dando
prioridad a los parámetros de viabilidad de los “principios activos”, a su actividad
glucolítica y al pH que pueden estar asociados directamente a la funcionalidad probiótica
del producto y a la estabilidad celular. De esta manera se propuso la siguiente
ponderación en términos porcentuales:
Viabilidad: 35%
Actividad glucolítica: 30%
pH: 15%
Separación de fases: 10%
Actividad de agua: 10%
Tabla 4-11: Matriz de decisiones para la selección del mejor prototipo del “principio
activo” mezcla (C2B9).
Tratamiento
Criterios de selección Prioridad
Control T1 T2
Viabilidad 35% 1 3 2
Actividad glucolítica 30% 1 2 2
Separación de fases 10% --------- 1 2
pH 15% 1 3 2
Actividad de agua 10% 1 1 1
Total Ʃ 0.9 2.3 1.9
Los resultados de la matriz de decisiones exhibieron que el tratamiento que presentó

mayor estabilidad, teniendo en cuenta cada uno de los parámetros y el comportamiento
de los “principios activos” en las formulaciones, fue el prototipo de formulación T1, ya que
mantuvo a condiciones de 4°C de almacenamiento la viabilidad por encima de 1x10 7
ufc/mL en todas las formulaciones, el pH por encima de lo especificado (pH 6.0), no
presentó separación de fases a estas condiciones de almacenamiento y se mantuvo
entre los límites permitidos de contaminantes aerobios mesófilos (<1x105 ufc/mL).
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
Los “principios activos” trabajados para el desarrollo del probiótico fueron caracterizables
y reproducibles entre lotes desde los puntos de vista fisicoquímico (pH y actividad de
agua), microbiológico (Viabilidad) y bioquímico (Actividad glucolítica).
Las formulaciones T1 y T2, a excepción del tratamiento C2T2, bajo condiciones de 4°C
de almacenamiento lograron mantener un pH superior a 6, una viabilidad superior a
1x107 ufc/mL y el nivel de contaminantes inferior a 1x105 ufc/mL, además mantuvieron su
actividad glucolítica en el tiempo y no presentaron separación de fases.
El prototipo que presentó mayor estabilidad para favorecer a cada “principio activo” y la
mezcla de ellos fue la formulación T1. Las formulaciones T1 a 25+2°C sostuvieron por
más tiempo la mayoría de las características propuestas y a 4°C fueron estables todas
las especificaciones durante el tiempo de estudio.
5.2 Recomendaciones
Se recomienda para las siguientes etapas, realizar un estudio de estabilidad del producto
en los posibles envases dispuestos para su presentación, con el fin de analizar si hay
algún efecto que cause inestabilidad del producto.
Para el desarrollo del producto, se debe tener en cuenta que éste va a ser elaborado
para consumo animal, así que es importante determinar el contenido de bacterias
patógenas como Salmonella, E. coli y Clostridium sulfito reductores de acuerdo con lo
establecido en LANIP (Laboratorio nacional de insumos pecuarios).
Estudiar más a detalle el comportamiento de la mezcla de los “principios activos” en una

formulación, utilizando la técnica de PCR en tiempo real, ya que esta técnica podría
determinar la relación de las concentraciones entre los “principios activos”, asegurando
de forma directa su relación con respecto a la viabilidad del producto.
Para tener un mejor criterio y exactitud en la reproducibilidad del comportamiento de las

bacterias en la formulación, es importante realizar el estudio a mínimo tres lotes, para así
predecir correctamente la vida útil que podría tener este producto para tener en cuenta
en sus posteriores etapas de desarrollo.
Conclusiones y recomendaciones 71
A. Anexo: Análisis estadístico de la
producción de los “principios
activos” (ANOVA)
 Caracterización de la producción del Streptococcus bovis C2
pH
Análisis de varianza de un factor
RESUMEN
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
Columna 1 3 16.78 5.59333333 0.00123333
Columna 2 3 17.02 5.67333333 0.00163333
Columna 3 3 16.78 5.59333333 0.00103333
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de los Probabili Valor crítico

variaciones cuadrados libertad cuadrados F dad para F
4.92307 0.05428
Entre grupos 0.0128 2 0.0064 692 529 5.14325285
Dentro de los
grupos 0.0078 6 0.0013
Total 0.0206 8
Se cumple la Hipótesis nula indicando que son estadísticamente iguales.

74 Anexos
Viabilidad
RESUMEN
Columna 1 3 1.766E+10 5886666667 3.4463E+17

Columna 2 3 1.674E+10 5580000000 1.7113E+18
Columna 3 3 1.42E+10 4733333333 1.4332E+18
Origen de las Suma de Grados de Promedio de los Valor crítico

variaciones cuadrados libertad cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 2.1411E+18 2 1.0705E+18 0.92044901 0.4480808 5.14325285
Dentro de los
grupos 6.9783E+18 6 1.1631E+18
Total 9.1194E+18 8
Actividad de agua
RESUMEN
Columna 1 3 2.855 0.95166667 2.3333E-06
Anexos 75
Columna 2 3 2.802 0.934 3.9E-05
Columna 3 3 2.842 0.94733333 2.3333E-06
Origen de las Suma de Grados de Promedio de los Valor crítico
variaciones cuadrados libertad cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 0.00050867 2 0.00025433 17.4732824 0.00314631 5.14325285
Dentro de los
grupos 8.7333E-05 6 1.4556E-05
Total 0.000596 8
 Caracterización de la producción del Butyrivibrio fibrisolvens B9
pH
RESUMEN
Columna 1 3 17.82 5.94 0.0039
Columna 2 3 17.71 5.90333333 0.00173333
Columna 3 3 17.5 5.83333333 0.00013333
76 Anexos
4.58381 0.06190
Entre grupos 0.01762222 2 0.00881111 503 141 5.14325285
Dentro de los
grupos 0.01153333 6 0.00192222
Total 0.02915556 8
Viabilidad
RESUMEN
Columna 1 3 9720000000 3240000000 2.9428E+18
Columna 2 3 1.457E+10 4856666667 9.40033E+17
Columna 3 3 1.29E+10 4300000000 3.9E+17
1.420751 0.312518
Entre grupos 4.0471E+18 2 2.02354E+18 258 353 5.14325285
Dentro de los
grupos 8.5457E+18 6 1.42428E+18
Total 1.2593E+19 8
Actividad de agua

Anexos 77
RESUMEN
Columna 1 3 2.855 0.951666667 2.33333E-06
Columna 2 3 2.844 0.948 9E-06
Columna 3 3 2.842 0.947333333 2.33333E-06
3.585365 0.09454
Entre grupos 3.26667E-05 2 1.63333E-05 854 184 5.14325285
Dentro de los
grupos 2.73333E-05 6 4.55556E-06
Total 6E-05 8

78 Anexos
B. Anexo: Resultados del estudio de

viabilidad del “principio activo”.
Tabla B-1. Datos de viabilidad obtenidos de los tratamientos a 25°C de

almacenamiento
tiempo tiempo 1 tiempo 2 tiempo 3 tiempo 4 tiempo 5 tiempo 6

Lote Réplica tiempo 0
15 mes mes mes mes mes mes
1 8.60E+08 2.09E+07 3.64E+07 3.92E+07 1.00E+06 8.05E+05 2.05E+05 4.90E+05

(1) B9
2 6.50E+08 8.30E+07 3.36E+07 3.64E+07 3.00E+06 6.58E+05 1.67E+05 2.66E+05
control
3 7.40E+08 7.67E+07 1.96E+07 6.80E+07 4.00E+06 7.30E+05 3.60E+05 2.73E+05
1 4.13E+10 7.84E+10 4.20E+10 2.05E+09 3.06E+09 4.40E+08 9.80E+07 3.64E+07
(2) B9
2 5.86E+10 7.70E+10 2.52E+10 2.14E+09 3.43E+09 3.40E+08 8.96E+07 1.82E+07
T1
3 7.77E+10 2.04E+10 2.66E+10 2.62E+09 2.56E+09 6.00E+08 8.82E+07 1.79E+07
1 8.32E+09 5.32E+09 6.16E+09 6.40E+08 6.40E+08 9.52E+08 3.51E+08 5.46E+08
(3) B9
2 4.06E+09 8.54E+09 6.00E+09 6.00E+08 6.00E+08 2.30E+08 3.25E+08 5.74E+08
T2
3 4.97E+09 7.56E+09 7.60E+09 6.36E+08 5.80E+08 4.50E+08 1.74E+08 1.72E+08
1 5.00E+06 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
(4) C2
2 3.00E+06 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
control
3 3.00E+06 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
1 2.01E+10 7.56E+09 4.06E+09 7.60E+07 7.50E+06 3.71E+06 5.46E+06 2.61E+06
(5) C2
2 3.29E+10 7.28E+09 3.92E+09 8.50E+07 6.30E+06 1.61E+06 5.32E+06 2.48E+06
T1
3 1.82E+10 3.22E+09 4.20E+09 5.90E+07 2.60E+06 2.80E+06 1.29E+06 1.22E+06
1 4.30E+09 2.90E+10 3.00E+08 3.26E+07 6.23E+07 2.80E+06 3.72E+06 3.36E+06
(6) C2
2 3.39E+09 3.80E+10 8.00E+08 3.22E+07 7.98E+07 1.58E+06 3.24E+06 5.88E+06
T2
3 2.00E+09 1.30E+10 8.00E+08 3.90E+07 2.61E+07 1.83E+06 3.70E+06 4.20E+06
(7) 1 5.00E+08 2.90E+03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
Anexos 79
C2+B9 2 2.00E+08 2.32E+03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00

control
3 1.00E+08 1.05E+03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
1 3.62E+10 8.90E+10 4.62E+10 2.06E+10 6.02E+10 2.74E+08 7.89E+07 2.86E+07
(8)
C2+B9 2 2.83E+10 6.16E+10 5.04E+10 2.42E+10 3.22E+10 3.78E+08 2.15E+07 3.68E+07
T1
3 2.55E+10 5.32E+10 4.30E+10 1.79E+10 3.91E+10 9.60E+08 6.20E+07 1.61E+07
1 8.71E+10 5.32E+10 1.50E+08 5.50E+07 7.40E+07 2.12E+06 2.12E+06 7.42E+06
(9)
C2+B9 2 2.18E+10 3.36E+10 2.70E+08 7.80E+07 5.20E+07 2.43E+06 3.54E+06 1.55E+06
T2
3 8.06E+10 5.38E+10 1.80E+08 2.50E+07 7.90E+07 6.50E+06 1.42E+06 4.62E+06
Tabla B-2. Datos de viabilidad obtenidos de los tratamientos a 4°C de

almacenamiento
tiempo tiempo 1 tiempo 2 tiempo 3 tiempo 4 tiempo 5 tiempo 6

Lote Réplica tiempo 0
15 mes mes mes mes mes mes
1 8.60E+08 3.20E+08 5.20E+08 3.78E+08 3.20E+08 6.30E+06 2.54E+06 1.44E+06

B9
2 6.50E+08 3.90E+08 4.80E+08 3.08E+08 2.50E+08 3.30E+06 1.52E+06 1.41E+06
control
3 7.40E+08 2.08E+08 5.30E+08 8.00E+08 1.33E+08 3.22E+06 3.10E+06 3.64E+06
1 4.13E+10 4.40E+10 3.92E+10 6.82E+10 2.46E+10 1.05E+10 3.20E+08 2.20E+08
B9 T1 2 5.86E+10 2.58E+10 4.48E+10 4.62E+10 1.79E+10 1.34E+10 1.30E+08 2.60E+08
3 7.77E+10 5.66E+10 2.29E+10 7.28E+10 1.09E+10 1.19E+10 2.10E+08 4.50E+08
1 8.32E+09 6.16E+09 2.39E+10 4.90E+10 6.02E+10 5.20E+08 2.20E+08 3.80E+08
B9 T2 2 4.06E+09 7.98E+09 2.17E+10 4.76E+10 5.46E+10 6.20E+08 2.30E+08 1.80E+08
3 4.97E+09 4.20E+09 1.78E+10 1.48E+10 2.80E+10 8.00E+08 1.31E+08 3.60E+08
1 5.00E+06 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
C2
2 3.00E+06 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
control
3 3.00E+06 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
1 2.01E+10 2.66E+09 7.70E+09 3.29E+09 3.13E+09 3.36E+08 5.60E+08 1.40E+08
C2 T1 2 3.29E+10 7.68E+09 7.84E+09 3.00E+09 3.08E+09 2.47E+08 5.32E+08 2.00E+08
3 1.82E+10 4.60E+09 6.16E+09 1.31E+09 1.55E+09 4.48E+08 4.62E+08 1.56E+08
1 4.30E+09 3.78E+10 4.00E+07 5.32E+07 6.00E+06 3.60E+05 5.18E+05 2.40E+04
C2 T2 2 3.39E+09 2.94E+10 6.00E+07 6.02E+07 2.33E+06 1.20E+05 5.88E+05 2.80E+04
3 2.00E+09 2.24E+10 5.00E+07 7.40E+07 2.24E+06 8.00E+05 2.52E+05 3.00E+04
1 5.00E+08 6.72E+06 3.64E+06 1.70E+05 7.28E+02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
C2+B9
2 2.00E+08 5.22E+06 7.28E+06 1.30E+05 6.44E+02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
control
3 1.00E+08 4.64E+06 4.68E+06 2.00E+05 3.08E+02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
C2+B9 1 3.62E+10 5.90E+09 5.70E+09 7.00E+09 6.80E+09 3.50E+08 3.80E+08 7.28E+07
80 Anexos
T1 2 2.83E+10 5.80E+09 4.80E+09 5.04E+09 6.00E+09 4.62E+08 3.40E+08 5.60E+07

3 2.55E+10 7.00E+09 7.00E+09 7.84E+09 8.70E+09 2.51E+08 3.00E+08 2.37E+07
1 8.71E+10 5.00E+09 7.14E+09 4.76E+09 5.32E+09 6.44E+09 8.70E+08 4.22E+07
C2+B9
2 2.18E+10 5.00E+09 8.26E+09 3.22E+09 3.78E+09 7.14E+09 8.50E+08 4.00E+07
T2
3 8.06E+10 5.90E+09 7.98E+09 2.94E+09 6.72E+09 7.28E+09 6.90E+08 5.12E+07
Anexos 81
C. Anexo: Resultados del estudio de

contaminantes aerobios mesófilos
del “principio activo”.
Tabla C-1. Datos de contaminantes aerobios obtenidos de los tratamientos a 25°C de

almacenamiento. N.A. no aplica debido a que los datos no fueron tomados porque el
“principio activo” se degrado totalmente, siendo innecesario continuar con la toma de
datos.
tiempo tiempo tiempo 1 tiempo 2 tiempo 3 tiempo 4 tiempo 5 tiempo 6

Lote Réplica
0 15 mes mes mes mes mes mes
1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 6.00E+03 1.30E+04
B9
2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 1.00E+03 7.00E+03 3.80E+04
control
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 1.00E+03 1.60E+04 3.90E+04
1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
B9 T1 2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 1.00E+03 2.00E+03
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
B9 T2 2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
1 < 10 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
C2
2 < 10 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
control
3 < 10 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
1 < 10 < 1000 < 1000 3.20E+04 8.10E+04 < 1000 1.00E+03 4.00E+03
C2 T1 2 < 10 < 1000 < 1000 5.00E+04 3.70E+04 < 1000 < 1000 1.00E+03
3 < 10 < 1000 < 1000 4.00E+04 1.40E+04 < 1000 < 1000 < 1000
C2 T2 1 < 10 7.00E+03 < 1000 4.00E+03 1.90E+04 1.00E+03 1.00E+03 2.00E+03
82 Anexos
2 < 10 < 1000 3.00E+03 3.00E+04 1.30E+04 1.00E+03 1.00E+03 2.46E+05

3 < 10 < 1000 < 1000 5.00E+03 < 1000 < 1000 < 1000 3.03E+05
1 < 10 < 1000 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
C2+B9
2 < 10 < 1000 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
control
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 N.A. N.A.
1 < 10 < 1000 4.00E+03 2.00E+03 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
C2+B9
2 < 10 < 1000 5.00E+03 < 1000 1.00E+03 < 1000 1.00E+03 < 1000
T1
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 1.00E+03 1.00E+03 < 1000
1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 3.00E+03
C2+B9
2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 0.00E+00
T2
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 1.00E+03 1.10E+04
Tabla C-2. Datos de contaminantes aerobios obtenidos de los tratamientos a 4°C de

almacenamiento. N.A. no aplica debido a que los datos no fueron tomados porque el
“principio activo” se degrado totalmente, siendo innecesario continuar con la toma de
datos.

Lote Réplica
B9
1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 7.00E+03 < 1000
control
2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 1.10E+04 1.00E+03
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 1.00E+03 < 1000
B9 T1 1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
B9 T2 1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
C2
1 < 10 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
control
2 < 10 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
3 < 10 < 1000 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
C2 T1 1 < 10 < 1000 < 1000 1.20E+04 5.00E+03 2.00E+03 3.00E+03 3.00E+03
2 < 10 < 1000 < 1000 1.50E+04 1.00E+03 1.03E+05 2.00E+03 1.00E+03
3 < 10 < 1000 < 1000 9.00E+03 7.00E+03 6.00E+03 5.00E+03 4.00E+03
C2 T2 1 < 10 < 1000 < 1000 4.00E+03 4.00E+03 1.00E+03 1.00E+03 2.00E+03
2 < 10 < 1000 < 1000 1.70E+04 2.00E+03 5.00E+03 3.00E+03 3.00E+03
Anexos 83
3 < 10 < 1000 < 1000 3.00E+03 0.00E+00 5.00E+03 1.00E+03 1.00E+03
C2+B9
1 < 10 < 1000 6.00E+03 3.00E+03 < 1000 < 1000 N.A. N.A.
control
2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 N.A. N.A.
3 < 10 < 1000 < 1000 6.00E+03 1.60E+04 < 1000 N.A. N.A.
C2+B9
1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
T1
2 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
C2+B9
1 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
T2
2 < 10 < 1000 < 1000 <1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
3 < 10 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000 < 1000
D. Anexo: Resultados y regresión
del estudio de determinación de la
actividad glucolítica
D-1. Resultados de la actividad glucolítica determinada en los tratamientos evaluados.
Tabla D-1. Datos de actividad glucolítica (U/mL) obtenidos de los tratamientos

almacenados a 25°C.
Réplic tiempo tiempo 1 tiempo 2 tiempo 3 tiempo 4 tiempo 5 tiempo 6

Lote tiempo 0
a 15 mes mes mes mes mes mes
1 2.28E-02 2.37E-02 1.55E-02 1.26E-02 1.72E-02 2.13E-02 6.37E-03 4.87E-03

B9
2 1.60E-02 1.55E+02 1.49E-02 1.37E-02 9.51E-03 1.93E-02 6.37E-03 2.82E-03
control
3 7.46E-03 9.63E-03 1.34E-02 1.22E-02 1.38E-02 2.38E-02 7.82E-03 4.15E-03
1 7.46E-03 3.35E-02 3.20E-02 3.17E-02 2.40E-02 3.12E-02 2.78E-02 1.94E-02
B9 T1 2 1.11E-02 3.16E-02 2.87E-02 2.60E-02 2.14E-02 2.94E-02 2.24E-02 2.14E-02
3 1.25E-02 3.31E-02 3.01E-02 2.95E-02 2.19E-02 2.81E-02 2.91E-02 2.01E-02
1 2.40E-02 3.36E-02 3.14E-02 2.84E-02 2.53E-02 2.88E-02 2.78E-02 1.61E-02
B9 T2 2 1.10E-02 3.31E-02 3.20E-02 2.95E-02 2.54E-02 2.89E-02 2.75E-02 2.03E-02
3 2.59E-02 3.26E-02 3.12E-02 2.95E-02 2.47E-02 3.06E-02 2.85E-02 1.82E-02
1 3.60E-02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
C2
2 3.66E-02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
control
3 3.64E-02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
1 3.19E-02 3.02E-02 3.18E-02 3.07E-02 2.40E-02 3.10E-02 2.57E-02 2.20E-02
C2 T1 2 3.29E-02 2.93E-02 3.16E-02 3.16E-02 2.37E-02 3.06E-02 2.69E-02 2.13E-02
3 3.35E-02 3.06E-02 3.13E-02 3.14E-02 2.01E-02 3.11E-02 2.82E-02 2.19E-02
1 3.32E-02 2.60E-02 2.93E-02 2.93E-02 2.44E-02 2.16E-02 6.49E-03 2.21E-02
C2 T2 2 3.34E-02 2.70E-02 3.00E-02 2.64E-02 2.29E-02 2.87E-02 2.82E-02 2.16E-02
3 3.35E-02 2.81E-02 2.94E-02 2.99E-02 2.25E-02 3.02E-02 2.75E-02 2.08E-02
86 Anexos
1 3.58E-02 2.82E-02 1.19E-03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00

C2+B9
control 2 3.61E-02 2.98E-02 1.17E-02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
3 3.53E-02 2.90E-02 1.34E-03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
1 2.94E-02 2.93E-02 2.96E-02 3.12E-02 2.47E-02 2.94E-02 2.64E-02 2.23E-02

C2+B9
T1 2 3.17E-02 2.91E-02 2.95E-02 2.85E-02 2.31E-02 2.73E-02 2.63E-02 2.05E-02
3 3.25E-02 2.85E-02 2.83E-02 2.47E-02 2.16E-02 2.72E-02 2.69E-02 2.26E-02
1 3.11E-02 3.12E-02 2.94E-02 3.11E-02 2.81E-02 2.91E-02 2.44E-02 2.19E-02

C2+B9
T2 2 3.36E-02 3.00E-02 2.95E-02 2.99E-02 2.64E-02 2.77E-02 2.82E-02 2.03E-02
3 3.28E-02 3.14E-02 2.96E-02 2.95E-02 2.44E-02 2.85E-02 2.58E-02 2.01E-02
Tabla D-2. Datos de actividad glucolítica (U/mL) obtenidos de los

tratamientos almacenados a 4°C.

Lote Réplica
2.28E-
1 1.20E-02 1.58E-02 1.19E-02 9.75E-03 1.85E-02 1.02E-02 1.67E-03
02
B9 3.60E-
2 1.18E-02 1.46E-02 1.50E-02 1.30E-02 1.94E-02 7.94E-03 2.34E-03
control 03
7.46E-
3 7.10E-03 1.55E-02 1.19E-02 1.24E-02 1.95E-02 9.03E-03 3.54E-03
03
7.46E-
1 2.82E-02 2.25E-02 2.38E-02 1.70E-02 2.51E-02 2.42E-02 2.25E-02
03
1.11E-
B9 T1 2 2.43E-02 2.20E-02 2.43E-02 1.84E-02 2.47E-02 2.49E-02 1.82E-02
02
1.25E-
3 2.42E-02 2.22E-02 2.89E-02 1.70E-02 2.54E-02 2.40E-02 2.36E-02
02
2.40E-
1 2.73E-02 3.25E-02 2.34E-02 1.71E-02 2.67E-02 2.04E-02 2.27E-02
02
1.10E-
B9 T2 2 2.18E-02 3.13E-02 2.55E-02 1.89E-02 2.26E-02 2.42E-02 2.21E-02
02
2.59E-
3 1.49E-02 3.01E-02 2.52E-02 1.97E-02 2.16E-02 2.30E-02 2.30E-02
02
3.60E-
1 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
02
C2 3.66E-
2 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
control 02
3.64E-
3 1.59E-02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
02
3.19E-
1 3.16E-02 3.01E-02 2.96E-02 2.18E-02 3.05E-02 2.72E-02 1.97E-02
02
3.29E-
C2 T1 2 2.84E-02 2.84E-02 2.72E-02 2.24E-02 3.04E-02 2.59E-02 2.19E-02
02
3.35E-
3 2.82E-02 2.90E-02 2.79E-02 2.22E-02 2.65E-02 2.69E-02 2.22E-02
02
Anexos 87
3.32E-
1 2.63E-02 3.00E-02 2.60E-02 2.22E-02 2.93E-02 2.69E-02 1.13E-03
02
3.34E-
C2 T2 2 2.87E-02 2.93E-02 2.85E-02 2.32E-02 2.55E-02 2.72E-02 2.28E-02
02
3.35E-
3 2.63E-02 2.91E-02 2.96E-02 2.36E-02 2.67E-02 2.63E-02 2.16E-02
02
3.58E-
1 3.07E-02 6.86E-03 1.34E-02 1.24E-02 5.65E-03 0.00E+00 0.00E+00
02
C2+B9
3.61E- -3.63E-
control 2 2.55E-02 9.87E-03 1.44E-02 1.50E-02 0.00E+00 0.00E+00
02 03
3.53E- -1.70E-
3 3.25E-02 7.58E-03 1.55E-02 1.25E-02 0.00E+00 0.00E+00
02 03
2.94E-
1 2.79E-02 3.05E-02 3.14E-02 2.42E-02 2.87E-02 2.72E-02 2.18E-02
02
C2+B9
3.17E-
T1 2 3.08E-02 3.24E-02 2.91E-02 2.41E-02 2.79E-02 2.60E-02 2.13E-02
02
3.25E-
3 2.83E-02 3.07E-02 2.95E-02 2.48E-02 2.63E-02 2.73E-02 2.16E-02
02
3.11E-
1 2.64E-02 3.10E-02 3.11E-02 2.24E-02 2.38E-02 2.55E-02 2.01E-02
02
C2+B9
3.36E-
T2 2 2.89E-02 3.12E-02 2.98E-02 2.35E-02 2.72E-02 2.55E-02 2.32E-02
02
3.28E-
3 2.79E-02 3.20E-02 3.04E-02 2.41E-02 2.82E-02 2.49E-02 2.02E-02
02
D-2. Tratamiento estadístico por el método de regresión de la actividad glucolítica de los

tratamientos evaluados.
Los tratamientos B9, B9T1 y B9T2 bajo las dos condiciones de almacenamiento,
presentaron un comportamiento cinético de orden 2 (Ver Ecuación 4-3) a diferencia de
los demás tratamientos que presentaron cinética de orden cero (Ver Ecuación 4-1).
Figura D-1: Regresión de los tratamientos almacenados a 25°C. (α=0.05)
B9 B9T1 y = 0.1142x + 26.157

R² = 0.5997
300 y = 0.8015x + 29.829 60
1/Actividad glucolítica [mL/U]
R² = 0.5811
250 50
200 40
150 30
100 20
50 10
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Tiempo [Días] Tiempo [Días]
88 Anexos
B9T2 C2
y = 0.1015x + 28.12
70 R² = 0.3727 0.04
Actividad glucolítica [U/mL]

60 0.035
50 0.03
0.025
40
0.02 y = -0.0024x + 0.0363
30 R² = 0.9999
0.015
20 0.01
10 0.005
0 0
0 50 100 150 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16
C2T1 C2T2
0.04 0.04
y = -4E-05x + 0.0305

0.035 y = -5E-05x + 0.0322 0.035
R² = 0.4738
0.03 R² = 0.4936 0.03
0.025 0.025
0.02 0.02
0.015 0.015
0.01 0.01
0.005 0.005
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
C2B9 C2B9T1
0.045 0.035
0.04 0.03
0.035
0.025
0.03
0.025 0.02
0.02 0.015
0.015 y = -4E-05x + 0.0302
y = -0.001x + 0.0387 0.01 R² = 0.524
0.01 R² = 0.8635
0.005 0.005
0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 0 50 100 150 200
C2B9T2
0.04
0.035
0.03
0.025
0.02
0.015 y = -5E-05x + 0.0321
R² = 0.7514
0.01
0.005
0
0 50 100 150 200
Tiempo [Días]
Figura D-2: Regresión de los tratamientos almacenados a 4°C (α=0.05).

B9 B9T1y = 0.0832x + 34.223
700 70 R² = 0.2324
600 60
500 y = 1.0762x + 45.201 50
R² = 0.2687
400 40
300 30
200 20
100 10
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Anexos 89
B9T2 C2
80 0.04

y = 0.0532x + 37.854

70 0.035
R² = 0.0855
60 0.03
50 0.025
40 0.02 y = -0.0024x + 0.0363
30 0.015 R² = 0.9999
20 0.01
10 0.005
0 0
0 50 100 150 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16
C2T1 C2T2
0.04 0.04 y = -6E-05x + 0.0313

0.035 y = -4E-05x + 0.0309 0.035 R² = 0.3873
0.03 R² = 0.4972 0.03
0.025 0.025
0.02 0.02
0.015 0.015
0.01 0.01
0.005 0.005
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
C2B9 C2B9T1 y = -4E-05x + 0.0312

R² = 0.6365
0.04 0.035
0.035 0.03
0.03 0.025
0.025
y = -0.0002x + 0.0288 0.02
0.02 R² = 0.6255
0.015
0.015
0.01 0.01
0.005 0.005
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 0 50 100 150 200
C2B9T2
0.04 y = -5E-05x + 0.0314
R² = 0.6523
0.035
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0 50 100 150 200
Tiempo [Días]
Tabla D-3: Comparación entre tratamientos almacenados a 25+2°C y 4+2°C con base en
los valores críticos de la distribución de Fisher (F) calculados contra los valores de F
tabla (α=0.05).
Hipótesis nula
Tratamientos comparados F calculado F tabla
(H0)
25+2°C de almacenamiento
B9xB9T1xB9T2 12.2477725 2.525 No se cumple
B9T1xB9T2 0.33301871 3.232 Se cumple
90 Anexos
C2T1xC2T2 1.94455297 3.232 Se cumple

C2B9xC2B9T1xC2B9T2 51.9377073 2.525 No se cumple
C2B9T1xC2B9T2 1.97355438 3.232 Se cumple
B9T1xB9T2 0.54944289 3.232 Se cumple
C2T1xC2T2 0.91289001 3.232 Se cumple
Comparación entre condiciones de almacenamiento
(B9T1xB9T2)x2 1.42305255 2.201 Se cumple
(C2T1xC2T2)x2 1.03008445 2.201 Se cumple
(C2B9T1xC2B9T2)x2 0.8658023 2.201 Se cumple
((C2T1xC2T2)x2)x((B9T1xB9T2)x2) 2.08813551 2.201 Se cumple
Anexos 91
E. Anexo: Resultados y regresión

del estudio de determinación de pH.
E-1. Resultados de los valores de pH determinados en los tratamientos evaluados.
Tabla E-1. Datos de pH obtenidos de los tratamientos almacenados a 25°C. N.A., no

aplica debido a que los datos no fueron tomados porque el “principio activo” se degrado
totalmente, siendo innecesario continuar con la toma de datos..
Temperatura 25ºC
Tiempo
Tratamiento Réplica 0 días 15 días 1 mes 2 meses 3 meses 4 meses 5 meses 6 meses
1 5.47 4.87 5.07 4.86 4.90 5.10 5.89 6.00
B9 (1) 2 5.46 4.76 5.32 4.87 5.00 5.26 5.88 6.09
3 5.47 4.80 5.07 4.85 4.82 5.24 5.90 5.99
1 7.05 7.10 7.37 7.24 6.78 6.37 6.01 6.22
B9T1 (2) 2 7.05 7.06 7.42 7.35 6.96 6.09 6.02 6.23
3 7.06 6.92 7.81 7.23 6.99 6.14 6.02 6.48
1 6.73 6.91 6.16 6.36 6.16 6.41 6.45 5.98
B9T2 (3) 2 6.77 6.07 6.18 6.07 6.06 6.00 6.52 5.82
3 6.72 6.08 6.12 6.10 6.10 6.41 6.61 5.81
1 4.51 4.86 4.93 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
C2 (4) 2 4.48 4.99 4.90 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
3 4.47 4.47 4.92 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
1 6.81 6.67 6.93 6.65 6.35 6.35 6.43 6.25
C2T1 (5) 2 6.83 6.87 6.90 6.67 6.28 6.56 6.44 6.18
3 6.85 6.68 6.88 6.60 6.40 6.45 6.16 6.27
1 6.58 5.48 5.55 5.48 5.50 5.40 4.86 5.10
C2T2 (6) 2 6.64 5.50 5.66 5.06 5.20 5.10 5.00 4.94
3 6.61 5.49 5.78 5.33 5.35 5.25 5.20 5.30
1 4.95 4.97 4.97 5.07 5.51 N.A. N.A. N.A.
C2B9 (7) 2 4.94 4.72 5.16 5.09 5.21 N.A. N.A. N.A.
3 4.93 4.73 5.06 5.06 5.36 N.A. N.A. N.A.
1 7.14 7.85 7.40 7.07 7.49 6.88 5.93 6.56
C2B9T1 (8) 2 7.10 7.21 7.39 7.35 7.26 6.91 5.95 7.09
3 7.10 7.18 7.49 7.63 7.22 6.95 5.94 6.50
C2B9T2 (9) 1 6.79 6.35 7.13 6.93 6.88 6.38 6.15 5.97
92 Anexos
2 6.80 6.34 7.26 6.30 6.44 6.59 6.11 5.99

3 6.79 6.29 6.36 7.25 6.77 6.59 6.13 6.09
Tabla E-2. Datos de pH obtenidos de los tratamientos almacenados a 4°C. N.A., no

aplica debido a que los datos no fueron tomados porque el “principio activo” se degrado
totalmente, siendo innecesario continuar con la toma de datos..
Temperatura 4ºC
Tiempo (Días)
1 5.47 5.12 5.03 5.02 4.88 5.04 5.01 5.00
B9 2 5.46 4.98 5.04 4.89 4.84 5.01 5.00 5.01
3 5.47 5.08 5.04 4.87 4.86 5.25 5.07 5.00
1 7.05 7.22 7.26 7.03 7.04 7.18 7.06 6.74
B9T1 2 7.05 7.35 7.22 7.05 7.01 7.14 7.18 7.44
3 7.06 7.27 7.25 7.46 6.90 7.00 7.09 7.00
1 6.73 6.79 7.05 6.18 6.84 6.28 6.26 7.09
B9T2 2 6.77 6.55 7.01 6.68 6.20 6.36 6.24 6.78
3 6.72 6.65 6.75 6.23 6.14 6.31 6.25 6.76
1 4.51 4.36 4.35 4.18 N.A. N.A. N.A. N.A.
C2 2 4.48 4.27 4.32 4.20 N.A. N.A. N.A. N.A.
3 4.47 4.26 4.33 4.16 N.A. N.A. N.A. N.A.
1 6.81 7.35 7.10 7.08 7.17 6.84 6.94 6.84
C2T1 2 6.83 7.09 7.02 7.46 7.32 7.05 6.97 6.90
3 6.85 7.11 6.93 7.16 6.84 7.02 6.98 6.72
1 6.58 6.20 6.29 5.82 5.83 5.80 6.00 5.73
C2T2 2 6.64 6.17 6.30 5.69 5.66 5.80 5.73 5.78
3 6.61 6.14 6.27 5.76 5.74 5.80 5.95 5.81
1 4.95 5.30 5.28 5.75 5.46 5.25 N.A. N.A.
C2B9 2 4.94 5.30 5.28 5.77 5.28 5.27 N.A. N.A.
3 4.93 5.24 5.25 5.73 5.35 5.25 N.A. N.A.
1 7.14 7.40 7.29 7.15 7.00 7.61 7.13 7.05
C2B9T1 2 7.10 7.29 7.83 7.39 7.51 7.58 7.15 7.02
3 7.10 7.16 7.56 7.20 7.25 7.34 7.15 7.06
1 6.79 6.75 7.05 6.83 7.22 6.52 6.55 6.67
C2B9T2 2 6.80 6.77 6.83 7.10 7.31 6.65 6.40 6.70
3 6.79 6.64 7.08 7.10 6.53 6.49 6.46 6.85
E-2. Tratamiento estadístico por el método de regresión de los valores de pH de los

Anexos 93
Figura E-1: Regresión de los tratamientos almacenados a 25°C (Orden cero). (α=0.05)
B9 B9T1
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 4
y = -0.0069x + 7.3467
3 3 R² = 0.6553
y = 0.0046x + 4.9162
2 2
R² = 0.419
1 1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
B9T2 C2
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 4
y = -0.002x + 6.4326
3 R² = 0.1587 3
y = 0.0143x + 4.5106
2 2
R² = 0.637
1 1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 5 10 15 20 25 30 35
C2T1 C2T2
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 4
y = -0.0035x + 6.8455
3 R² = 0.7826 3
y = -0.0058x + 5.9438
2 2
R² = 0.5475
1 1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
C2B9 C2B9T1
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 4 y = -0.0055x + 7.472
3 3 R² = 0.4559
y = 0.005x + 4.8521
2 R² = 0.6541 2
1 1
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
94 Anexos
C2B9T2
8
7
6
5
pH
4
y = -0.0037x + 6.8259
3 R² = 0.3533
2
1
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Tiempo [Días]
Figura E-2: Regresión de los tratamientos almacenados a 4°C (Orden cero). (α=0.05)
B9 B9T1
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 4 y = -0.0007x + 7.1835
3 3 R² = 0.0705
2 2
y = -0.0012x + 5.1593
1 R² = 0.1826 1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
B9T2 C2
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 4
3 y = -0.0012x + 6.6678 3
2 R² = 0.0658 2 y = -0.0051x + 4.4489
R² = 0.5159
1 1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 5 10 15 20 25 30 35
C2T1 C2T2
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 y = -0.0008x + 7.0816 4
3 R² = 0.0763 3 y = -0.0037x + 6.2987
2 2 R² = 0.5471
1 1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Anexos 95
C2B9 C2B9T1
8 8
7 7
6 6
5 5
pH
pH
4 4
y = -0.0008x + 7.3346
3 3 R² = 0.0548
y = 0.0022x + 5.1963
2 2
R² = 0.1451
1 1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
C2B9T2
8
7
6
5
pH
4
y = -0.0015x + 6.9058
3 R² = 0.1387
2
1
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Tiempo [Días]
Tabla E-3: Comparación entre tratamientos almacenados a 25+2°C y 4+2°C con base en
tabla (α=0.05).
Hipótesis nula
(H0)
B9T1xB9T2 23.0767714 3.232 No se cumple
C2T1xC2T2 111.184289 3.232 No se cumple
C2B9T1xC2B9T2 11.7187453 2.525 No se cumple
F. Anexo: Resultados del aspecto
macroscópico de la emulsión
(separación de fases)
Tabla F-1. Datos de volumen de separación de fases (mL) con respecto a un volumen
total de la muestra de 25 mL, de los tratamientos almacenados a 25°Cos a 25°C. N.A.,
no aplica debido a que los datos no fueron tomados porque el “principio activo” se
degrado totalmente, siendo innecesario continuar con la toma de datos.

Lote Réplica
1 0 0 0 1.2 2.5 5 5 7
B9 T1 2 0 0 0 1.2 2.5 5.5 5.5 8
3 0 0 0 1.5 3 5 5 8
1 0 0 0 1.8 3 5 4 4
B9 T2 2 0 0 0 2.7 5 4 4 3.5
3 0 0 0 1.2 3 3 6 6.7
1 0 0 0 5 7 8 10.5 14
C2 T1 2 0 0 0 3 5 5 8 15
3 0 0 0 5 7 7 9 12
1 0 0 0 0 0 4 10 7
C2 T2 2 0 0 0 0 0 4 5.5 6
3 0 0 0 0 0 2.7 6 8.5
1 0 0 0 0 0.5 3.5 5.4 6
C2B9 T1 2 0 0 0 0 0.1 3.5 5 7
3 0 0 0 0 0.5 6.25 5 7
1 0 0 0 0 0 0 0 5
C2+B9 T2 2 0 0 0 0 0 0 0 4
3 0 0 0 0 0 0 0 6
98 Anexos
G. Anexo: Resultados y regresión

del estudio de la actividad de agua
de los tratamientos evaluados.
G-1. Resultados de actividad de agua de los tratamientos evaluados.
Tabla G-1. Datos de actividad de agua (aw) obtenidos de los tratamientos almacenados a
25°C. N.A., no aplica debido a que los datos no fueron tomados porque el “principio
activo” se degrado totalmente, siendo innecesario continuar con la toma de datos.
Temperatura 25ºC
Tiempo
1 0.934 0.922 0.954 0.941 0.902 0.893 0.889 0.898
B9 (1) 2 0.927 0.933 0.948 0.960 0.907 0.880 0.888 0.900
3 0.929 0.908 0.947 0.960 0.874 0.885 0.881 0.903
1 0.907 0.857 0.931 0.943 0.873 0.867 0.868 0.898
B9T1 (2) 2 0.907 0.856 0.926 0.934 0.881 0.878 0.877 0.897
3 0.923 0.919 0.930 0.934 0.860 0.890 0.885 0.898
1 0.924 0.919 0.948 0.940 0.881 0.867 0.890 0.900
B9T2 (3) 2 0.915 0.867 0.936 0.949 0.883 0.867 0.887 0.901
3 0.925 0.856 0.933 0.960 0.864 0.869 0.887 0.893
1 0.913 0.902 0.945 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
C2 (4) 2 0.910 0.935 0.942 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
3 0.910 0.931 0.949 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
1 0.890 0.867 0.943 0.926 0.873 0.869 0.871 0.890
C2T1 (5) 2 0.912 0.925 0.961 0.944 0.864 0.876 0.888 0.891
3 0.900 0.925 0.943 0.948 0.875 0.873 0.885 0.892
Anexos 99
1 0.896 0.902 0.933 0.938 0.876 0.867 0.894 0.892

C2T2 (6) 2 0.896 0.935 0.921 0.961 0.882 0.864 0.894 0.893
3 0.897 0.931 0.941 0.938 0.880 0.891 0.895 0.893
1 0.919 0.909 0.934 0.924 N.A. N.A. N.A. N.A.
C2B9 (7) 2 0.909 0.907 0.945 0.944 N.A. N.A. N.A. N.A.
3 0.924 0.906 0.944 0.948 N.A. N.A. N.A. N.A.
1 0.897 0.858 0.931 0.934 0.905 0.87 0.893 0.905
C2B9T1 (8) 2 0.890 0.906 0.950 0.930 0.906 0.90 0.893 0.892
3 0.894 0.910 0.962 0.932 0.918 0.87 0.895 0.901
1 0.900 0.910 0.954 0.934 0.905 0.89 0.899 0.901
C2B9T2 (9) 2 0.904 0.854 0.944 0.947 0.919 0.89 0.901 0.902
3 0.915 0.860 0.948 0.911 0.915 0.86 0.898 0.903
Tabla G-2. Datos de actividad de agua (aw) obtenidos de los tratamientos almacenados a
4°C. N.A., no aplica debido a que los datos no fueron tomados porque el “principio activo”
se degradó totalmente, siendo innecesario continuar con la toma de datos.
Temperatura 4ºC
Tiempo (Días)
1 0.934 0.908 0.946 0.93 0.936 0.898 0.895 0.882
B9 (1) 2 0.927 0.910 0.948 0.94 0.937 0.906 0.894 0.891
3 0.929 0.910 0.949 0.94 0.933 0.895 0.896 0.894
1 0.907 0.862 0.943 0.95 0.924 0.863 0.879 0.896
B9T1 (2) 2 0.907 0.855 0.938 0.94 0.924 0.865 0.853 0.902
3 0.923 0.920 0.937 0.94 0.923 0.865 0.875 0.901
1 0.924 0.860 0.938 0.940 0.930 0.875 0.883 0.880
B9T2 (3) 2 0.915 0.932 0.943 0.924 0.929 0.867 0.887 0.895
3 0.925 0.919 0.943 0.933 0.925 0.873 0.891 0.895
1 0.913 0.919 0.945 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
C2 (4) 2 0.910 0.918 0.947 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
3 0.910 0.933 0.949 N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
1 0.890 0.927 0.949 0.932 0.925 0.867 0.895 0.896
C2T1 (5) 2 0.912 0.859 0.949 0.934 0.939 0.886 0.897 0.897
3 0.900 0.873 0.943 0.938 0.935 0.889 0.893 0.898
1 0.896 0.918 0.951 0.935 0.923 0.873 0.895 0.894
C2T2 (6) 2 0.896 0.920 0.945 0.936 0.925 0.890 0.897 0.893
3 0.897 0.855 0.955 0.939 0.916 0.892 0.897 0.900
1 0.919 0.911 0.937 0.944 0.937 0.886 N.A. N.A.
C2B9 (7) 2 0.909 0.931 0.939 0.937 0.928 0.884 N.A. N.A.
3 0.924 0.939 0.943 0.943 0.940 0.888 N.A. N.A.
100 Anexos
1 0.897 0.852 0.941 0.939 0.950 0.890 0.884 0.897

C2B9T1 (8) 2 0.890 0.859 0.940 0.953 0.922 0.874 0.888 0.895
3 0.894 0.838 0.946 0.940 0.926 0.890 0.887 0.897
1 0.900 0.855 0.940 0.949 0.921 0.893 0.873 0.898
C2B9T2 (9) 2 0.904 0.862 0.942 0.956 0.920 0.896 0.881 0.898
3 0.915 0.856 0.946 0.936 0.928 0.905 0.887 0.899
G-2. Tratamiento estadístico por el método de regresión de la actividad de agua de los

Figura G-1: Regresión de los tratamientos almacenados a 25°C (Orden cero). (α=0.05)
B9 B9T1
1.000
1
0.950
0.95
Actividad de agua [aw]
0.900
0.9
0.850
0.85
0.800
0.8
0.750
0.75
0.7 0.700
y = -0.0003x + 0.9391 0.650
0.65
R² = 0.4643 0.600 y = -0.0002x + 0.9101
0.6
0.55 0.550 R² = 0.1265
0.5 0.500
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
B9T2 C2
1.000 1.000
0.950 0.950
0.900 0.900
0.850 0.850
0.800 0.800
0.750 0.750
0.700 0.700 y = 0.0008x + 0.911
0.650 y = -0.0002x + 0.9185 0.650 R² = 0.2377
0.600 R² = 0.1581 0.600
0.550 0.550
0.500 0.500
0 50 100 150 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16
C2T1 C2T2
1.000 1.000
0.950 0.950
0.900 0.900
0.850 0.850
0.800 0.800
0.750 0.750
0.700 0.700
0.650 y = -0.0002x + 0.9207 0.650 y = -0.0002x + 0.9208
0.600 R² = 0.2469 0.600 R² = 0.2361
0.550 0.550
0.500 0.500
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Anexos 101
C2B9 C2B9T1
1.000 1.000
0.950 0.950

0.900 0.900
0.850 0.850
0.800 0.800
0.750 0.750
0.700 y = 0.0008x + 0.9101 0.700
y = -0.0001x + 0.9144
0.650 R² = 0.4224 0.650
R² = 0.0748
0.600 0.600
0.550 0.550
0.500 0.500
0 5 10 15 20 25 30 35 0 50 100 150 200
C2B9T2
1.000
0.950
0.900
0.850
0.800
0.750
0.700
y = -8E-05x + 0.9134
0.650 R² = 0.0365
0.600
0.550
0.500
0 50 100 150 200
Tiempo [Días]
Figura G-2: Regresión de los tratamientos almacenados a 4°C (Orden cero). (α=0.05)
y = -0.0002x + 0.9375 y = -0.0001x + 0.9173

B9 R² = 0.5036 B9T1 R² = 0.0728
1 1.000
0.95 0.950
0.9 0.900
0.85 0.850
0.8 0.800
0.75 0.750
0.7 0.700
0.65 0.650
0.6 0.600
0.55 0.550
0.5 0.500
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Tiempo [Días] Tiempo [días]
y = -0.0003x + 0.9299
B9T2 R² = 0.3591 C2
1.000 1.000 y = 0.0008x + 0.911
0.950 0.950 R² = 0.6087
0.900 0.900
0.850 0.850
0.800 0.800
0.750 0.750
0.700 0.700
0.650 0.650
0.600 0.600
0.550 0.550
0.500 0.500
0 50 100 150 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16
102 Anexos
y = -0.0001x + 0.9183
C2T1 R² = 0.0678 C2T2 y = -0.0001x + 0.9204
R² = 0.1058
1.000 1.000
0.950 0.950

0.900 0.900
0.850 0.850
0.800 0.800
0.750 0.750
0.700 0.700
0.650 0.650
0.600 0.600
0.550 0.550
0.500 0.500
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
y = -0.0002x + 0.9349
C2B9 R² = 0.1792 C2B9T1
1.000 0.960
0.950 y = -3E-05x + 0.906
0.940

0.900 R² = 0.003
0.850 0.920
0.800 0.900
0.750
0.700 0.880
0.650 0.860
0.600
0.840
0.550
0.500 0.820
0 20 40 60 80 100 120 140 0 50 100 150 200
C2B9T2
0.980
0.960
y = -1E-05x + 0.9088
0.940
R² = 0.0008
0.920
0.900
0.880
0.860
0.840
0 50 100 150 200
Tiempo [Días]
Tabla G-3: Comparación entre tratamientos almacenados a 25+2°C y 4+2°C con base en
tabla (α=0.05).
Hipótesis nula
(H0)
B9xB9T1xB9T2 1.867 2.525 Se cumple
C2T1xC2T2 0.157 3.232 Se cumple
C2B9xC2B9T1xC2B9T2 0.734 2.525 Se cumple
B9T1xC2T1xC2B9T1 0.334 2.525 Se cumple
B9xB9T1xB9T2 1.257 2.525 Se cumple
Anexos 103

C2B9xC2B9T1xC2B9T2 1.459 3.15 Se cumple
104 Anexos
H. Anexo: Ejemplo estadístico

aplicado para la regresión lineal de
los datos del estudio de estabilidad
(viabilidad).
H-1. A continuación se pretendió dar un ejemplo de la estadística de regresión aplicada a

los datos del estudio de viabilidad dados a condiciones de 25°C de almacenamiento para
los tratamientos, para la determinación de las primeras aproximaciones de “vida útil” y la
comparación entre los prototipos que contenían el mismo “principio activo”, para este
ejemplo se manejó los tratamientos que contuvieron solo el “principio activo” Butyrivibrio
fibrisolvens B9:
 Tratamiento B9
Tiempo Log
(días) viabilidad
0 8.93449845
0 8.81291336
0 8.86923172
15 8.50514998
15 8.59106461
15 8.31806333
30 8.71600334
30 8.68124124
30 8.72427587
60 8.5774918
60 8.48855072
Anexos 105
60 8.90308999
90 8.50514998
90 8.39794001
90 8.12385164
120 6.79934055
120 6.51851394
120 6.50785587
150 6.40483372
150 6.18184359
150 6.49136169
180 6.15836249
180 6.14921911
180 6.56110138
Regresión
Resumen
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de 0.9372004
correlación múltiple 8
Coeficiente de 0.8783447
determinación R^2 4
0.8728149
R^2 ajustado 6
0.4323778
Error típico 9
Observaciones 24
Valor
Grados de Suma de Promedio de crítico de
libertad cuadrados los cuadrados F F
29.695028 1.5414E-
Regresión 1 8 29.6950288 158.838872 11
4.1129140
Residuos 22 8 0.18695064
33.807942
Total 23 9
Coeficient Probabilida
Inferior Superio
es Error típico Estadístico t d 95% r 95%
8.3121956 0.1457318 8.009966 8.6144
Intercepción 8 7 57.0375958 2.1186E-25 28 2509
106 Anexos
- -
- 0.0014383 0.021110 0.0151
Variable X 1 0.0181276 4 -12.6031295 1.5414E-11 53 4466
Desviación
Tiempo Yregresión T Error típico estándar IC Lcinf
8.3121956 0.783408 7.5287
0 8 1.717 0.43237789 1.05524822 72 8696
8.0402817 0.774828 7.2654
15 2 1.717 0.43237789 1.04369059 42 533
7.7683677 0.767939 7.0004
30 6 1.717 0.43237789 1.03441164 79 2797
7.2245398 0.759410 6.4651
60 4 1.717 0.43237789 1.02292262 43 2941
6.6807119 0.758054 5.9226
90 2 1.717 0.43237789 1.02109675 91 57
0.763911 5.3729
120 6.136884 1.717 0.43237789 1.02898546 44 7256
5.5930560 0.776816 4.8162
150 7 1.717 0.43237789 1.04636907 9 3917
5.0492281 0.796428 4.2527
180 5 1.717 0.43237789 1.07278609 71 9944
-
Pendiente 0.0181276
8.3121956
Intercepto 8
N 24
Promedio x 80.625
90431.223
SXx 2
Tiempo Yregresión Lcinf

0 8.3121956 7.5287869
15 8.0402817 7.2654533
30 7.7683677 7.0004279
60 7.2245398 6.4651294
90 6.6807119 5.922657
120 6.136884 5.3729725
150 5.5930560 4.8162391
180 5.0492281 4.2527994
Anexos 107
Figura H-1: Gráfica de la regresión lineal de datos obtenidos del tratamiento B9
Teniendo en cuenta que la vida el mínimo requerido para la funcionalidad de un

probiótico es de 1*107 ufc/mL, se determinó el logaritmo obteniendo el valor de 7, para el
cuál fue reemplazado en la ecuación Log[viabilidad] = -0.0182(días) + 7.5441. Por último
se obtuvo que la posible “vida útil” para este tratamiento fue de 29 días.
 Tratamiento B9T1
Tiempo Log
(días) viabilidad
0 10.6159501
0 10.7678976
0 10.890421
15 10.6434527
15 10.4116197
15 10.7528164
30 10.5932861
30 10.651278
30 10.3598355
60 10.8337844
60 10.664642
60 10.8621314
90 10.3909351
108 Anexos
90 10.252853
90 10.0374265
120 10.0211893
120 10.1271048
120 10.075547
150 8.50514998
150 8.11394335
150 8.32221929
180 8.34242268
180 8.41497335
180 8.65321251
Regresión
Resumen
Coeficiente de
correlación 0.98054
múltiple 218
Coeficiente de
determinación 0.96146
R^2 298
0.95971
R^2 ajustado 129
0.24700
Error típico 624
Observaciones 24
Grados Suma de Promedio de
de cuadrado los Valor crítico
libertad s cuadrados F de F
33.48828 548.8795
Regresión 1 63 33.4882863 67 4.7672E-17
1.342265
Residuos 22 85 0.06101208
34.83055
Total 23 22
Inferi Superi Inferio Superi

Coeficie Error Probabili or or r or
ntes típico Estadístico t dad 95% 95% 95.0% 95.0%
Intercepción 10.8945 0.083252 130.861435 2.6104E- 10.72 11.06 10.721 11.067
Anexos 109
847 83 33 1928 72405 9289 2405

9
- - - - -
0.01925 0.000821 4.7672E- 0.020 0.017 0.0209 0.0175
Variable X 1 062 69 -23.4281789 17 9547 54655 547 4655
Desviació
Yregresi n
Tiempo ón t Error típico estándar IC Lcinf
0.447
10.8945 1.055248 5410 10.44
0 847 1.717 0.24700624 22 3 70436
0.442
10.6058 1.043690 6393 10.16
15 253 1.717 0.24700624 59 2 3186
0.438
10.3170 1.034411 7040 9.878
30 659 1.717 0.24700624 64 3 3619
0.433
9.73954 1.022922 8314 9.305
60 718 1.717 0.24700624 62 3 71575
0.433
9.16202 1.021096 0570 8.728
90 843 1.717 0.24700624 75 6 97137
0.436
8.58450 1.028985 4027 8.148
120 968 1.717 0.24700624 46 4 10694
0.443
8.00699 1.046369 7752 7.563
150 093 1.717 0.24700624 07 9 21564
0.454
7.42947 1.072786 9790 6.974
180 218 1.717 0.24700624 09 1 49317
-
0.01925
Pendiente 062
10.8945
Intercepto 847
N 24
Promedio x 80.625
90431.2
SXx 232
110 Anexos
Yregresi
Tiempo ón Lcinf
0 10.8945 10.44704
15 10.6058 10.16318
30 10.3170 9.878361
60 9.73954 9.305715
90 9.16202 8.728971
120 8.58450 8.148106
150 8.00699 7.563215
180 7.42947 6.974493
Figura H-2: Gráfica de la regresión lineal de datos obtenidos del tratamiento B9T1
Teniendo en cuenta que la viabilidad mínima requerida para la funcionalidad de un

cuál fue reemplazado en la ecuación Log[viabilidad] = -0.0193(días)+10.456. Por último
se obtuvo que la posible “vida útil” para este tratamiento fue de 179 días.
 Tratamiento B9T2
Log
Tiempo viabilidad
0 9.92012333
Anexos 111
0 9.60852603
0 9.69635639
15 9.78958071
15 9.90200289
15 9.62324929
30 10.3783979
30 10.3364597
30 10.25042
60 10.6901961
60 10.677607
60 10.1702617
90 10.7795965
90 10.7371926
90 10.447158
120 8.71600334
120 8.79239169
120 8.90308999
150 8.34242268
150 8.36172784
150 8.1172713
180 8.5797836
180 8.25527251
180 8.5563025
Regresión
Resumen
Coeficiente de
correlación 0.86563
múltiple 286
Coeficiente de
determinación 0.74932
R^2 025
0.73792
R^2 ajustado 572
0.30644
Error típico 005
Observaciones 24
Grados Suma de Promedio de F Valor crítico
112 Anexos
de cuadrado los de F
libertad s cuadrados
6.175355 65.76137
Regresión 1 22 6.17535522 78 4.7087E-08
2.065921
Residuos 22 05 0.0939055
8.241276
Total 23 27
Inferi Superi Inferio Superi

Coeficie Error Probabili or or r or
ntes típico Estadístico t dad 95% 95% 95.0% 95.0%
9.534
9.74849 0.103284 3.4145E- 2961 9.962 9.534 9.9626
Intercepción 585 84 94.3845743 30 9 6955 29619 955
-
- 0.010 - - -
0.00826 0.001019 4.7087E- 3807 0.006 0.010 0.0061
Variable X 1 665 4 -8.10933892 08 5 15254 38075 5254
Desviació
Yregresi n
Tiempo ón t Error típico estándar IC Lcinf
0.555
9.74849 1.055248 2268 9.193
0 585 1.717 0.30644005 22 3 26901
9.62449 1.043690 0.549 9.075
15 615 1.717 0.30644005 59 1457 35046
9.50049 1.034411 0.544 8.956
30 646 1.717 0.30644005 64 2635 23296
0.538
9.25249 1.022922 2184 8.714
60 708 1.717 0.30644005 62 7 27861
0.537
9.00449 1.021096 2577 8.467
90 77 1.717 0.30644005 75 8 23992
0.541
8.75649 1.028985 4084 8.215
120 832 1.717 0.30644005 46 8 08984
8.50849 1.046369 0.550 7.957
150 894 1.717 0.30644005 07 555 94394
0.564
8.26049 1.072786 4545 7.696
180 955 1.717 0.30644005 09 1 04504
Anexos 113
-
0.00826
Pendiente 665
9.74849
Intercepto 585
N 24
Promedio x 80.625
90431.2
SXx 232
Yregresi
Tiempo ón Lcinf
0 9.74849 9.193269
15 9.62449 9.075350
30 9.50049 8.956232
60 9.25249 8.714278
90 9.00449 8.467239
120 8.75649 8.215089
150 8.50849 7.957943
180 8.26049 7.696045
Figura H-3: Gráfica de la regresión lineal de datos obtenidos del tratamiento B9T2
Teniendo en cuenta que la vida el mínimo requerido para la funcionalidad de un

cuál fue reemplazado en la ecuación Log[viabilidad] = -0.0083(días)+9.2041. Por último
se obtuvo que la posible “vida útil” para este tratamiento fue >180 días.
114 Anexos
 Comparación entre tratamientos (B9, B9T1, B9T2)
Resumen
Coeficiente de
correlación
múltiple 0.61315229
Coeficiente de
determinación
R^2 0.37595573
R^2 ajustado 0.36704082
Error típico 1.21989733
Observaciones 72
Promedio
Grados de Suma de de los Valor crítico
libertad cuadrados cuadrados F de F
62.757541 42.17
Regresión 1 62.7575414 4 15299 1.0311E-08
1.4881495
Residuos 70 104.170466 1
Total 71 166.928007
Inferi
Inferi Super or Superi
Estadístico Proba or ior 95.0 or
Coeficientes Error típico t bilidad 95% 95% % 95.0%
10.12
40.658629 1.967 9.178 5208 9.178 10.12
Intercepción 9.65175874 0.23738525 2 6E-50 3088 7 3088 52087
-
- - 0.010 - -
6.4939610 1.031 0.019 5421 0.019 0.010
Variable X 1 -0.01521496 0.00234294 3 1E-08 8878 1 8878 54211
SCRtotal 104.170466
SCB9 4.11291408
SCB9T1 1.34226585
SCB9T2 2.06592105
Grados de Grados de
libertad libertad Fcalculado Ftabla
Anexos 115
numerador denominador
212.03205 hay diferencias significativas
Modelos 4 66 7 2.525 entre prototipos
 Comparación entre tratamientos (B9T1 y B9T2)
Resumen
Coeficiente de
correlación
Coeficiente de
determinación
R^2 0.77957184
R^2 ajustado 0.77477993
Observaciones 48
Promedio de
Grados de Suma de los Valor crítico
162.68
Regresión 1 34.2124349 34.2124349 4774 1.0349E-16
Residuos 46 9.67375108 0.21029894
Total 47 43.886186
Super Inferio Superi

Probab Inferio ior r or
Coeficientes Error típico Estadístico t ilidad r 95% 95% 95.0% 95.0%
2.5376 10.10 10.54 10.10 10.541
Intercepción 10.3215403 0.10929357 94.4386785 E-54 15437 15368 15437 5368
- - - -
1.0349 0.015 0.011 0.015 0.0115
Variable X 1 -0.01375864 0.0010787 -12.7547942 E-16 92995 58732 92995 8732
SCB9T1T2 9.67375108
SCB9T1 1.34226585
SCB9T2 2.06592105
Grados de Grados de
libertad libertad
numerador denominador Fcalculado Ftabla
116 Anexos
hay diferencias significativas

Modelos 2 44 40.444499 3.232 entre formulados
Presentaron diferencias significativas entre los tres tratamientos ya que la hipótesis nula
no se cumple.
 Comparación entre tratamientos (B9T1 y B9)
Resumen
Coeficiente de
correlación
Coeficiente de
determinación
R^2 0.44098035
R^2 ajustado 0.42882775
Observaciones 48
Promedio de
36.286
Regresión 1 63.126331 63.126331 9104 2.6668E-07
Residuos 46 80.0236557 1.73964469
Total 47 143.149987

3.3903 8.970 10.23 8.970 10.236
Intercepción 9.60339018 0.31434485 30.5504931 E-32 64682 61335 64682 1335
- - - -
2.6668 0.024 0.012 0.024 0.0124
Variable X 1 -0.01868911 0.00310251 -6.02386175 E-07 93415 44408 93415 4408
SCB9T1T2 80.0236557
SCB9 4.11291408
SCB9T1 1.34226585
0
Anexos 117
Grados de Grados de
libertad libertad
Presentaron diferencias significativas entre los dos tratamientos ya que la hipótesis nula
no se cumple.
 Comparación entre tratamientos (B9T2 y B9)
Resumen
Coeficiente de
correlación
Coeficiente de
determinación
R^2 0.77957184
R^2 ajustado 0.77477993
Observaciones 48
Promedio de
162.68
Regresión 1 34.2124349 34.2124349 4774 1.0349E-16
Residuos 46 9.67375108 0.21029894
Total 47 43.886186

2.5376 10.10 10.54 10.10 10.541
Intercepción 10.3215403 0.10929357 94.4386785 E-54 15437 15368 15437 5368
- - - -
1.0349 0.015 0.011 0.015 0.0115
Variable X 1 -0.01375864 0.0010787 -12.7547942 E-16 92995 58732 92995 8732
SCB9T1T2 9.67375108
SCB9 4.11291408
118 Anexos
SCB9T2 2.06592105
Grados de Grados de
libertad libertad
Presentaron diferencias significativas entre los dos tratamientos ya que la hipótesis nula
no se cumple.
H-2. A continuación se presentan los resultados obtenidos luego de haber aplicado la

estadística de regresión de los demás tratamientos evaluados para este estudio.
Figura H-4. Regresión de los tratamientos evaluados bajo condiciones de

almacenamiento a 25+2°C (α=0.05). Se presenta la ecuación de la regresión con base en
el límite de confianza inferior. Lcinf, límite de confianza inferior.
C2 C2T1
7
11
6 10
9
5
y = -0.4x + 5 8
4 7
3 6
Yregresión 5 Yregresión
2 4
Lcinf y = -0.0243x + 8.7481 Lcinf
1 3
2
0
1
0 5 10 15 20
-1 0
0 50 100 150 200
-2
C2T2 C2B9
11 9
10
8
9
7
8
6
7
5 y = -0.2778x + 6.9441
6
5 Yregresión 4
Yregresión
4 y = -0.0204x + 8.3564
3
Lcinf Lcinf
3 2
2 1
1 0
0 -1 0 10 20 30 40
0 50 100 150 200
-2
Anexos 119
C2B9T1 C2B9T2
12 11
11 10
Viabilidad [log ufc/mL] 10 9

9 8
8 7
7
6
6
Yregresión 5 Yregresión
5
4 4
Lcinf Lcinf
3 3
2 y = -0.0195x + 10.104 2 y = -0.0228x + 8.4673
1 1
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
Figura H-5. Regresión de los tratamientos evaluados bajo condiciones de

almacenamiento a 4+2°C (α=0.05). Se presenta la ecuación de la regresión con base en
el límite de confianza inferior. Lcinf, límite de confianza inferior.
B9 B9T1
10 12
9 11
10
8
9
7 8
6 7
5 6
4 Yregresión 5 Yregresión
3 Lcinf 4 y = -0.0136x + 10.214 Lcinf
y = -0.0162x + 8.2774 3
2
2
1
1
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
B9T2 C2
11 7
10
6
9
5
8
7 4
6 y = -0.4367x + 5.0879
y = -0.0102x + 9.1968 Yregresión 3
5 Yregresión
4 Lcinf 2
Lcinf
3 Lineal (Lcinf) 1
2
1 0
0 0 5 10 15 20
-1
0 50 100 150 200
-2
120 Anexos
C2T1
11 C2T2
10 11
9 10
8 9

7 8
6 7
5 6
Yregresión
5 Yregresión
4
Lcinf 4
3 y = -0.0297x + 8.3164 Lcinf
3
2 y = -0.0106x + 9.6575
2
1 1
0 0
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200
C2B9 C2B9T1
9 11
8 10
9

7
8
6 7
5 6
4 Yregresión 5 Yregresión
3 4
Lcinf y = -0.013x + 9.7525 Lcinf
3
2 y = -0.0657x + 7.4018 2
1 1
0 0
-1 0 50 100 150 0 50 100 150 200
C2B9T2
11
10
9
8
7
6
Yregresión
5
Lcinf
4 y = -0.0101x + 9.6078
3
2
1
0
0 50 100 150 200
Tabla H-1: Comparación entre tratamientos almacenados a 25+2°C y 4+2°C con base en
tabla (α=0.05).
Hipótesis nula
(H0)
Anexos 121

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Estudio de estabilidad para la

selección de una formulación de un

Yorguin Leonel Villarreal Solano Quim.

Universidad Nacional de Colombia

Yorguin Leonel Villarreal Solano Quim.

Universidad Nacional de Colombia

A mis padres y a mi familia quienes siempre

Le Quiero agradecer a Corpoica y la Universidad Nacional por darme la oportunidad de

Quiero agradecer también al Ministerio de Agricultura y desarrollo rural por su confianza y

Le agradezco también a mis compañeros de maestría Aldemar Gordillo, Jimena Zuluaga

Palabras clave: probiótico, formulación, bacterias anaerobias, estabilidad,

Keywords: Probiotic, anaerobia bacteria, stability, biological, prototypes,

Lista de figuras ............................................................................................................. XIII

Lista de tablas ............................................................................................................. XVI

Lista de símbolos y abreviaturas .............................................................................. XVII

3.3 Estudio de estabilidad de dos prototipos de probiótico ...................................29

4. Resultados y discusión ..........................................................................................36

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................69

A. Anexo: Análisis estadístico de la producción de los “principios activos”

B. Anexo: Resultados del estudio de viabilidad del “principio activo”. ..................78

C. Anexo: Resultados del estudio de contaminantes aerobios mesófilos del

D. Anexo: Resultados y regresión del estudio de determinación de la actividad

E. Anexo: Resultados y regresión del estudio de determinación de pH. ................91

F. Anexo: Resultados del aspecto macroscópico de la emulsión (separación de

G. Anexo: Resultados y regresión del estudio de la actividad de agua de los

Lista de símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas

Símbolos con letras griegas

ICH International conference on harmonisation

En el caso de Colombia los sistemas de producción lechera se basan en el buen estado

Con el fin de contribuir a la solución de este problema, Corpoica en conjunto con la

El desarrollo de un producto de esta naturaleza, se debe llevar a cabo en una serie de

De acuerdo al planteamiento realizado en el presente proyecto se discutieron los tópicos

1.1 Objetivos específicos

 Caracterizar fisicoquímicamente y microbiológicamente los “principios activos”

 Evaluar las propiedades fisicoquímicas, microbiológicas y bioquímicas del

 Seleccionar la formulación que presente mayor estabilidad, basado en los

2.1 Estudios de estabilidad

Cuando se habla de un estudio de estabilidad de un producto se hace referencia a

2.1.1 Etapas del desarrollo de un producto que involucran

 Preformulación: En esta fase se determinan de manera experimental o por

 Formulación: Comprende el establecimiento de una fórmula cualicuantitativa en la

 Escalamiento: En esta etapa se evalúa la incidencia del cambio de escala del

 Validación: Esta corresponde al establecimiento de la evidencia documentada de

 Fase de mantenimiento de procesos: Comprende el desarrollo de actividades que

2.2 Consideraciones acerca del estudio de estabilidad

El producto probiótico evaluado en el presente trabajo, se encuentra en la fase de

Con el fin de escoger la formulación más adecuada se realizó un estudio de estabilidad a

2.2.1 Cálculos de velocidad de degradación [15]

El proceso de degradación de un bioproducto a base de bacterias anaerobias, lleva

2.2.1.1 Orden de velocidad de degradación del “principio activo”

El orden de degradación del “principio activo” corresponde a la evaluación del

2.2.2 Variables respuesta a considerar en el estudio de

2.2.2.1 Pruebas microbiológicas: Viabilidad de los microorganismos por la técnica

Existen diversos métodos para determinar la viabilidad en diferentes microorganismos,

 Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxígeno como

 Anaerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del

 Microaerofílico: Un organismo que es capaz de un crecimiento oxígeno-

 Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxígeno-

Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó una técnica no convencional llamada “Roll

2.2.2.2 Actividad biológica (Propiedades bioquímicas: Actividad enzimática)

Las bacterias propuestas para el probiótico están activamente implicadas en degradación

Las enzimas implicadas en los procesos de degradación de materiales fibrosos se