PRÁCTICA 1

COLORACIONES DIFERENCIALES: Coloración de Gram

INTRODUCCÓN
Los colorantes son compuestos químicos orgánicos que al unirse a la célula
bacteriana van a permitir visualizar su morfología, paso inicial fundamental para
llegar a la identificación final del microorganismo. Así todos los colorantes
usados en microbiología son derivados del alquitrán. Todos poseen en su
fórmula química al anillo benceno; la diferencia entre uno y otro colorante está
en el número de anillos que posee, su disposición y la sustitución de los
átomos de hidrógeno por otras moléculas.
Los colorantes se dividen en ácidos, básicos o neutros. En los colorantes
ácidos (eosina, fucsina ácida, azul de anilina, fluoresceína) el grupo iónico que
imparte el color, llamado también cromóforo tiene carga negativa y reacciona
con sustancias básicas tales como el citoplasma. Los colorantes básicos (azul
de metileno, violeta de genciana, fucsina básica, safranina) el cromóforo tiene
carga positiva y reacciona con sustancias ácidas como son los ácidos
nucleicos.
Los colorantes neutros están compuestos por colorantes ácidos y básicos
(hematoxilina (básico)) - eosina (ácido).

COLORACIÓN DE GRAM MODIFICADO POR KOPELOFF

En 1844 el médico danés Gram, invento un método especial de tinción de valor
práctico, taxonómico en bacteriología. Este método sirve para dividir bacterias
en dos grupos:
 Gram positivo que conservan el complejo cristal violeta.
 Gram negativos que pierden este complejo por la acción del alcohol –
acetona y se tiñen con el colorante de contraste, fucsina básica,
apareciendo de color rojo.

La modificación hecha por Kopeloff consiste en añadir 1 a 2 gotas de

bicarbonato de sodio a la Violeta de genciana, lo que favorece la impregnación
del colorante en la bacteria.

MATERIALES:
  Placa de cultivo con bacterias Gram positivas y Gram negativas.
 Serie de colorantes para Gram:
o Violeta de genciana (colorante primario)
o Bicarbonato de Sodio al5%
o Lugol (mordiente)
o Alcohol – acetona (decolorante)
o Fucsina básica (colorante de contraste)

 Lamina porta objeto

 Asa de siembra en aro y punta.
 Solución fisiológica al 0.85%.
 Laminas control coloreadas ( coloración Gram )
 Mechero de Bunsen.
 Varillas para colocación.
 Microscopio.
 Aceite de cedro.

Procedimiento
1. Colocar con el asa en aro 1 – gota de la solución fisiológica al 0.85% en
el centro de la lámina portaobjeto.
2. Con el asa de siembra en punta, tomar una porción muy pequeña de la
colonia bacteriana y resuspenderla en la gota de la solución fisiológica,
trazando un espiral del centro a la periferie para obtener un frotis de
capa fina
3. Fijar al calor.
4. Cubrir el frotis con la solución de violeta de genciana y agregar 1 – 2
gotas de bicarbonato de sodio. Dejar actuar por dos minutos.
5. Lavar con agua corriente.
6. Cubrir con Lugol durante 2 minutos.
7. Lavar con agua.
8. Decolorar con alcohol – acetona, inclinando la lámina y agregando
desde la parte superior del frotis (no directamente sobre este), hasta que
no arrastre más colorante, máximo por 10 segundos.
9. Lavar con agua
10. Cubrir con fucsina básica por 30 segundos.
11. Lavar con agua corriente
12. Dejar secar al aire o con la ayuda de la flama débil del mechero.
Observar al microscopio con objetivo de inmersión 100x.
RESULTADO:
Las bacterias Gram positivas se tiñen de color violeta y las Gram negativas de
color rojo.
 NOTA: si el frotis se realiza a partir de un cultivo líquido no es necesario usar la
solución fisiológica al 0.85%..

PROTOCOLO

LÁMINA MORFOLOGÍA ESQUEMA

GRAM
POSITIVAS

GRAM
NEGATIVAS
 TINCIÓN DE GRAM

Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica
a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias
Gram positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram
en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas
universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta.

PRINCIPIOS

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la

pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a
cada microorganismo.

PASOS

1. Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y

con un asa bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia
bacteriana.
a) Muestra solida: colocar solución salina previamente a colocar la colonia,
igual en muestra semisólida.

b) Muestra liquida: colocar la colonia directamente.

2. Dejar secar al aire, luego fijar la preparación pasando la placa rápidamente

por el mechero (2 ó 3 veces).
3. Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos, el cual tiene afinidad con el
peptidoglicano de la pared bacteriana (Colorante primario), enjugar con agua
seguidamente.

4. Agregar yodo Gram durante 2 minutos que sirve como mordiente

(compuesto químico intensificador del color) e impide la salida del cristal violeta
por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. Enjuagar con agua seguidamente.

5. Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua inmediatamente 15 segundos

(decoloración, disuelve lípidos de la pared de Gram negativas). Esta mezcla de
alcohol acetona, deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma,
también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido
a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de
alcohol acetona.
6. Agregar safranina durante 15 segundos, enjuagar con agua seguidamente.
La safranina funciona como un colorante secundario o de contra tinción y sirve
para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta yodo.
 CONCLUSION

Las características fenotípicas que presentan algunas bacterias contribuyen a

su diagnóstico presuntivo:

 La observación de cocos Grampositivos dispuestos en racimos sugieren la

presencia de estafilococos.

 La disposición de cocos Grampositivos en cadena indica estreptococos.

 Diplococos Grampositivos en forma de lanceta o con extremos alargados son

característicos de S. pneumoniae cuando se observan en esputos.

 Diplococos Gram negativos arriñonados o reniformes son característicos de

las especies de Neisseria.

 Bacilos Grampositivos ordenados en letras chinas o empalizadas son típicos

del Corynebacterim Además de proveer al microbiólogo y al clínico las
características fenotípicas de la bacteria en cuanto a tamaño, forma,
agrupación y características tintoriales, esta tinción es importantísima ya que
en algunos casos permite la instauración del tratamiento rápido y oportuno.

BIBLIOGRAFÍA

1. Luis Esaú López-Jácome, Melissa Hernández-Durán, Claudia Adriana Colín-

Castro, Silvestre Ortega-Peña, Guillermo Cerón-González, Rafael Franco-
Cendejas. (marzo, 2014) Las tinciones básicas en el laboratorio de
microbiología. Obtenido de http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2014/ir141b.pdf

2. Revista Portales Médicos (15 de marzo, 2013) Artículo de revisión. La

coloración de gram y su importancia en el diagnóstico microbiológico. Obtenido
de http://www.revista-portalesmedicos.com/revista-medica/coloracion-
gramdiagnostico-microbiologico/