SULFITOS TOTALES (SO2)

(Enzimático)
Prod Ref: R.30.K-ETSULPH MEGAZYME

Procedimiento de ensayo

Última revisión del fabricante: 02-15/Última revisión de INGENASA: 06-16

 SULFITOS TOTALES MEGAZYME
R.30.K-ETSULPH

COMPOSICIÓN DEL KIT

Reactivo
Uni. Vol.
Vial 1: Tampón (pH 8,0) más azida de sodio como conservante
1 28 mL
(0,02% p/V). Estable durante 2 años a 4ºC.
Vial 2: NADH. Polvo seco congelado. Estable durante 2 años a -
1
20ºC.
Vial 3: Suspensión de NADH peroxidasa. Estable durante 2 años
1 1,1 mL
a 4ºC.
Vial 4: Suspensión de sulfito oxidasa. Estable durante 2 años a
1 1,1 mL
4ºC.
Vial 5: Estándar de sulfito de sodio en polvo. Estable durante 5
1 5g
años a temperatura ambiente.

Los kits de Megazyme están preparados para la realización de 50 ensayos por kit en formato
manuel, 500 ensayos con Microplaca o 588 ensayos con Autoanalizador.
R3R. SULFITOS TOTALES MEGAZYME
R.30.K-ETSULPH

I. INTRODUCCIÓN:
El dióxido de azufre (SO2) se usa vino, y las restricciones legales sobre los
ampliamente como aditivo en varios niveles de SO2 en vino, para los productores
formatos, más comúnmente como sulfitos en de vino, la medida de los niveles de SO2 libre
vino, bebidas y empresas de alimentación y SO2 total se ha convertido en un dato muy
donde actúa principalmente como un valioso. Además, debido a la mayor
antimicrobiano y un conservante concienciación de los efectos adversos de los
antioxidante. sulfitos y la intolerancia de los mismos en
algunos individuos, los niveles de sulfitos en
En el proceso del vino, los sulfitos se usan alimentos y bebidas están estrictamente
como un aditivo esencial, normalmente en la regulados por varios organismos
fermentación post-maloláctica, en el control gubernamentales y por ello se requiere de
de la contaminación durante el una determinación precisa de los niveles de
envejecimiento por Brettanomyces y también sulfitos en alimentos, bebidas y vinos.
para proteger el vino de la “oxidación y
pardeamiento enzimático”. El SO2 es sólo El kit (K-ETSULPH) es adecuado para la
activo como un antimicrobiano y conservante medida específica de “Sulfitos Totales” como
antioxidante en su forma “libre” no enlazada. SO2 en vinos, bebidas, y alimentos, así como
Puesto que el SO2 llega a ser “inactivo” en otros materiales
cuando se une a los pigmentos de color del
II. PRINCIPIO:
En presencia de oxígeno, el sufito se oxida a sulfato por la enzima sulfito oxidasa (1).

(1) SO32-+ O2 + H2O – Sulfito Oxidasa SO42-+ H2O2

El peróxido de hidrógeno formado en la reacción anterior, se reduce en presencia de la enzima

NADH peroxidasa y NADH (2).

(2) H2O2 + NADH + H+ - NADH peroxidasa 2 H2O + NAD+

La cantidad de NAD+ formada en esta ruta es estequiométrica con la cantidad de sulfitos o

sulfito unido a aldehído. El consumo de este NADH se mide mediante el descenso de la
absorbancia a 340nm.

III. ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD, LINEARIDAD Y PRECISIÓN:

La sulfito oxidasa reaccionará con sulfitos,
isotiocianatos y tioglicósidos mientras que los
sulfatos, tiosulfatos, ácido sulfínico y sulfuros
no reaccionarán.
Los compuestos de ácido sulfónico pueden dar
lugar a reacciones acopladas bajo estas
condiciones.
La menor diferencia de absorbancia para el
ensayo es de 0,010 unidades de absorbancia.
Esto corresponde a una concentración de
sulfito de 3,4 mg/L de solución de muestra,
con un volumen de 0,1 mL. El Límite de
Detección es de 0,34 mg/L, que deriva de una
diferencia de absorbancia de 0,020 con un
volumen de muestra de 2,0 mL.
El ensayo es lineal en el intervalo de 1 a 50 µg
de sulfito por ensayo. Con un volumen de
muestra de 0,1 mL, corresponde a una
concentración aproximada de sulfitos entre 10
y 500 mg/L de solución de la muestra. En
determinaciones dobles utilizando una solución
de la muestra, se puede producir una
diferencia de absorbancia entre 0,005 a 0,010.
Con un volumen de muestra de 0,1 mL, esto
corresponde a una concentración de sulfitos
entre 1,7 y 3,4 mg/L de solución de la
muestra. Si durante la preparación de la
muestra, ésta se diluye, el resultado se
multiplica por el factor de dilución, F. Si en la
preparación de la muestra, la muestra se pesa
(por ejemplo 10 g/L), se puede esperar una
diferencia de 0,02 a 0,05g/100g.
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IV. INTERFERENCIAS:
La presencia de ácido L-ascórbico ralentizará
la reacción de la sulfito oxidasa, los niveles de
ácido L-ascórbico superiores a 50 µg por
ensayo manual deberán eliminarse durante la
preparación de la muestra.
Debido a la inestabilidad característica de los
sulfitos en muestras acuosas, los porcentajes
V. SEGURIDAD:
Deben seguirse las medidas de seguridad
que requieren todas las sustancias
químicas.
Para más información respecto uso seguro
y manejo de este producto, puede solicitar
VI. PREPARACIÓN DE REACTIVOS, SOLUCIONES/SUSPENSIONES:
1. Usar el contenido del vial 1 como se
suministra. Estable durante 2 años a 4ºC.
2. Disolver el contenido del vial 2 en 11
mL de agua destilada. Estable durante 1
año a 4ºC o estable durante 2 años a -
20ºC (evitar ciclos de
congelación/descongelación repetidos,
dividir en alícuotas de tamaño adecuado y
conservar en tubos de polipropileno).
3 y 4. Usar el contenido del vial 3 y 4 tal
como se suministra. Antes de abrir por
primera vez, agite el vial para eliminar
cualquier proteína que pueda haber
quedado en el tapón de goma.
Posteriormente, almacenar el vial en
posición vertical. Agite el vial para
mezclar el contenido antes de usar.
Estable durante 2 años a 4ºC.
5. Pesar 1 gramo de ácido cítrico en un
matraz aforado y diluir hasta 1 L con agua
destilada. Añadir de forma precisa 590 mg
VII. EQUIPAMIENTO (RECOMENDADO):
1. Matraz aforado (1L).
2. Cubetas de plástico o de vidrio
desechables (1 cm de paso óptico, 3mL).
3. Micropipetas, p.ej; Gilson Pipetman® (20
µL, 200 µL y 1 mL).
4. Pipeta dispensadora, p.ej; Eppendorf
Multipette®
de recuperación esperados serán menores del
100%. Esto está acorde con los valores
obtenidos con otros kits comerciales de
sulfitos disponibles.
las Hojas de Seguridad (SDS) a su
proveedor habitual.
de sulfito de sodio, disolver y usar
directamente en el ensayo. Esta solución
de sulfito es equivalente a 300 mg/L como
SO2. El sulfito en solución no es estable y
se perderá sobre un 2% del contenido de
sulfito por hora, por tanto, esta solución
debe prepararse el mismo día de su
uso.
Notas: 1) La solución estándar de sulfitos
sólo se ensaya cuándo exista alguna duda
sobre la precisión del espectrofotómetro o
cuándo se tenga sospecha de la inhibición
causada por sustancias de la muestra. La
concentración de sulfitos se determina
directamente a partir del coeficiente de
extinción del NADH. 2) Usar sólo agua
destilada nueva para cada ensayo.
Alternativamente, tratar 100 mL de agua
desmineralizada con 1 gramo de carbón
activo durante 5 minutos con agitación y
después filtrado.
-
con 25 mL Combitip® (para dispensar
alícuotas de 0,5 mL de tampón 1 y 0,2 mL
de alícuotas de solución de NADH).
5. Cronómetro.
6. Espectrofotómetro a 340 nm.
7. Agitador vortex (p.ej; IKA® Yellowline
Test Tube Shaker TTS2).
8. Baño de agua termostatizado.
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VIII. PROCEDIMIENTO MANUAL:

Longitud de onda 340 nm

Cubeta 1 cm de paso óptico (vidrio o plástico)

Temperatura ≈25ºC

Volumen final 3,34 mL

1,0-50 µg de sulfitos por cubeta (en 0,10-2,0 mL de
Solución de la muestra
volumen de muestra.
Leer frente al aire (sin cubeta en el paso óptico) o frente al agua.

Pipetee en las cubetas Blanco Muestra

Agua destilada (a ≈25ºC) 2,60 mL 2,50 mL

Solución de la muestra - 0,10 mL

Solución 1 (Tampón) 0,50 mL 0,50 mL

Solución 2 (NADH) 0,20 mL 0,20 mL

Suspensión 3 (NADH
0,02 mL 0,02 mL
peroxidasa)
Mezclar1 y leer las absorbancias de las soluciones (A1) tras aproximadamente 4 min, y
empezar la reacción añadiendo:
Suspensión 4 (Sulfito
0,02 mL 0,02 mL
oxidasa)
Mezclar1 y leer las absorbancias de las soluciones (A2) al final de la reacción (30 min
aproximadamente). Si la reacción no se ha detenido pasados 30 minutos, continue leyendo las
absorbancias en intervalos de 10 minutos hasta que las absorbancias se mantengan estables
o decrezcan de forma constante durante unos 10 minutos2.
(1) Por ejemplo, con una espátula de plástico o girando suavemente tras cubrir la cubeta con la
tapa o Parafilm.

(2) Si el grado de “reacciones acopladas” es mayor en la muestra que en el blanco, extrapolar

las absorbancias (muestra y blanco) al momento de adición de la solución 4 (sulfito oxidasa).

NOTA: Debido al carácter inestable de los sulfitos en solución, las muestras deben
analizarse lo antes posible tras el paso de preparación de muestra.

IX. CÁLCULOS:
Determine la diferencia de absorbancia (A1 – A2) tanto para los blancos como para las muestras.
Restar la diferencia de absorbancia del blanco a la diferencia de absorbancia de la muestra
obteniendo ∆Asulfito. El valor de ∆Asulfitos debería ser al menos de 0,100 unidades de absorbancia
para alcanzar la suficiente precisión en los resultados. La concentración de SO2 puede calcularse
como sigue:
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c = (V x MW x ∆Asulfitos) / (ε x d x v) [g/L]
Donde: V=volumen final (mL); MW=Peso molecular de SO2 (g/mol); ε=coeficiente de extinción
molar del NADH a 340nm=6300(l x mol-1x cm-1), d=paso óptico (cm); v=volumen de muestra
(mL).

Para Sulfitos como SO2:

c = (3,34 x 64,06 x ∆Asulfitos) / (6300 x 1 x 0,1) = 0,3396 x ∆Asulfitos [g/L]

Si la muestra se ha diluido durante su preparación, los resultados deben multiplicarse por el

factor de dilución, F. Cuando se analizan muestras sólidas o semisólidas, que son pesadas para
su preparación, el contenido en g/100g se calcula a partir de la cantidad pesada como se indica
a continuación:

Contenido de sulfitos como SO2 = c [g/l solución de muestra]

sulfitos x 100 [g/100 g]
Peso muestra [g/l sol. muestra]

Nota: Estos cálculos pueden simplificarse usando Megazyme Mega-CalcTM. Consulte con
su proveedor

X. PROCEDIMIENTO CON AUTOANALIZADOR:

Notas:
1. El procedimiento con Autoanalizador para sulfitos puede realizarse usando un único
estándar o toda la curva de calibración.
2. Para cada tanda de muestras que se aplica a la determinación de sulfito, tanto el
punto estándar como la curva de calibración deben realizarse
simultáneamente utilizando el mismo lote de reactivos.

Preparación de R1:
Este kit es adecuado para la preparación de 162 mL de reactivo (equivalente a 588 reacciones
de 0,275 mL). La preparación de los reactivos se realiza de la siguiente manera:
Componente Volumen
Agua destilada (a ≈25ºC) 24,3 mL
Solución 1 (Tampón) 5,5 mL
2,2 mL (después de añadir 11 mL de H2O al
Solución 2 (NADH)
vial 2)
Suspensión 3 (NADPH-POD) 0,22 mL
Volumen total 32,22 mL

Preparación de R2:
Componente Volumen
Agua destilada (a ≈25ºC) 3 mL
Suspensión 4 (SO2-POD) 0.22 mL
Volumen total 3,22 mL

Ejemplo del método:

R1: 0,250 mL.
Muestra: ≈ 0,01 mL.
R2: 0,025 mL.
Tiempo de reacción: ≈ 30 min a 25ºC.
Longitud de onda: 340nm.
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Estabilidad de los reactivos preparados: >7 días en refrigeración.

Cálculos: Punto final.
Dirección de la reacción: Descendente.
Linealidad: 10-500 mg/L de sulfito como SO2 usando 0,01 mL de volumen de muestra.
XI. PROCEDIMIENTO CON MICROPLACA:

Notas:
1. El procedimiento con Microplaca para sulfitos puede ser realizado usando un único
estándar o toda la curva de calibración.
2. Para cada tanda de muestras que se aplica a la determinación de sulfito, tanto el
punto estándar como la curva de calibración deben realizarse
simultáneamente utilizando el mismo lote de reactivos.

Longitud de onda 340 nm.

96 pocillos (ej. de fondo claro y plano; de vidrio o

Microplaca
plástico).
Temperatura ≈25ºC.

Volumen final 0,334 mL.

0,1-5 µg de sulfitos por cubeta (en un volumen de 0.01-
Solución de la muestra
0,2 mL de muestra).

Pipetee en las cubetas Blanco Muestra Estándar

Agua destilada (a ≈25ºC) 0,260 mL 0,250 mL 0,250 mL

Solución de la muestra - 0,010 mL -

Solución estándar - - 0,010 mL

Solución 1 (Tampón) 0,050 mL 0,050 mL 0,050 mL

Solución 2 (NADH) 0,020 mL 0,020 mL 0,020 mL

Suspensión 3 (NADH peroxidasa) 0,002 mL 0,002 mL 0,002 mL

Mezclar1 y leer las absorbancias de las soluciones (A1) tras aprox. 4 min, y empezar la reacción
añadiendo:
Suspensión 4 (Sulfito oxidasa) 0,002 mL 0,002 mL 0,002 mL
Mezclar1 y leer las absorbancias de las soluciones (A2) al final de la reacción (30 min
aproximadamente). Si la reacción no se ha detenido pasados 30 minutos, continue leyendo las
absorbancias en intervalos de 10 minutos hasta que las absorbancias se mantengan estables o
decrezcan constantemente durante unos 10 minutos.
(1) Por ejemplo, el uso del agitador de microplacas, modo de agitación en el lector de
microplacas o mediante aspiración repetida (p.ej: usando un dispensador de 50-100 µL).
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CÁLCULOS (Procedimiento con microplaca):

g/L = (∆A muestra/∆A estándar) x g/L estándar x F
Si la muestra se diluye durante la preparación, el resultado debe multiplicarse por el factor de
dilución, F.

XII. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:

NOTA: Debido al carácter inestable de los sulfitos en solución, las muestras deben
analizarse lo antes posible tras el paso de preparación de muestra.
1. Dilución de la muestra.
La cantidad de sulfito presente en la cubeta (es decir; en los 0,1 mL de muestra analizada) debe
estar en un rango entre 1 y 50 µg. Por tanto, la muestra debe diluirse lo suficiente para obtener
una concentración de sulfitos entre 10 y 500 mg/L.
Tabla de diluciones:
Concentración Factor
Dilución
estimada de de
con
sulfitos Dilución
agua
(mg/L) (F)
No se
<500 requiere 1
dilución
500-5000 1+9 10
>5000 1+99 100
Si el valor de ∆Asulfito es demasiado bajo (p.ej; <0,100), pese más muestra o diluya en menor
medida. Alternativamente, el volumen de muestra que se debe verter en la cubeta se puede
aumentar hasta 2,00 mL asegurándose de que la suma de la muestra y agua destilada en la
reacción es de 2,60mL. Utilizar el nuevo volumen de la muestra en la ecuación.

2. Consideraciones generales:
(a) Muestras líquidas: Clara, ligeramente
coloreada y aproximadamente neutra,
las muestras líquidas pueden usarse
directamente en el ensayo.
(b) Muestras ácidas: Si >0,1 mL de una
muestra ácida se va a usar sin diluir, el
pH de la solución debe incrementarse
hasta aproximadamente 8,0 usando
NaOH 2M a temperatura ambiente
durante 30 minutos.
(c) Dióxido de carbono: Muestras que
contienen una cantidad significativa de
dióxido de carbono deben desgasificarse
incrementando el pH a 8,0 con NaOH
2M, agitando suavemente o con una
varilla de vidrio.
(d) Muestras fuertemente coloreadas: Si
se utilizan sin diluir, las muestras con
colores intensos deben ser tratadas
mediante la adición de PVPP 0,2g/10mL
de muestra. Agitar los tubos
vigorosamente durante 5 minutos y
luego filtrar a través de filtros de papel
Whatman No.1. Filtrar con papel o
centrifugar a 4000 x g durante 10
minutos.
(e) Muestras sólidas: Homogeneizar o
triturar las muestras sólidas en agua
destilada y filtrar si fuera necesario.
(f) Muestras que contengan grasas:
Extraer con agua caliente a una
temperatura superior al punto de fusión
de las grasas (p. ej., en un matraz
aforado de 100 mL a 60ºC). Ajustar a
temperatura ambiente y rellenar el
matraz aforado hasta la marca. Conserve
en hielo o en nevera unos 15-30 minutos

para permitir la separación de las grasas,
y filtre. Deseche los primeros mL del
filtrado y utilice el sobrenadante claro (el
cual puede estar ligeramente
opalescente), para el ensayo.
(g) Muestras que contengan proteínas:
Desproteinice las muestras que
contienen proteína mediante la adición
XIII. EJEMPLO DE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:
(a) Determinación de sulfitos en vino
blanco.
La concentración de sulfitos en vino blanco
puede determinarse sin ningún tratamiento
de la muestra excepto la dilución (si fuera
necesario). Generalmente se usa un
volumen de muestra de 0,1 mL.
(b) Determinación de sulfitos en vino
tinto.
Ajustar el pH a 8,0 para 25 mL de vino
tinto y diluir dos veces con agua destilada.
Usar por lo general un volumen de
muestra de 0,1 mL.
Alternativamente, para 25 mL de vino
tinto, ajustar el pH a 8.0 y luego añadir
0,5 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP).
Agitar el tubo vigorosamente durante 5
minutos y luego filtrar con papel de filtro
Whatman Nº1. Filtrar con papel o
centrifugar a 4000 x g durante 10 minutos.
Diluir el filtrado/sobrenadante 2 veces con
agua destilada y usar directamente en el
ensayo. Usar por lo general un volumen de
muestra de 0,1 mL.
(c) Determinación de sulfitos en
cervezas.
Filtrar la muestra de cerveza
inmediatamente a través del papel de filtro
Whatman Nº1 y luego añadir 0,7 gramos
de bentonita a 10 mL de cerveza en un
vaso de precipitados de 50 mL con
agitación durante 1 minutos. Filtrar a
través del papel de filtro Whatman Nº 1.
Filtrar con papel y usar el filtrado en el
ensayo. Usar por lo general un volumen de
muestra de 0,5 mL-1,0 mL.
(d) Determinación de sulfitos en
zumos de frutas.
Clarificar la turbidez del zumo por filtración
a través de papel de filtro Whatman Nº 1 ó
centrifugar a 4000 x g durante 10 minutos.
SULFITOS TOTALES MEGAZYME
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de ácido perclórico 1 M en hielo, a un
volumen igual que el de la muestra.
Filtrar o centrifugar a 1500 g durante 10
min y neutralizar el sobrenadante con
KOH 1M. Usar el sobrenadante en el
ensayo después de una dilución
apropiada.
El ácido ascórbico debe eliminarse de las
muestras si está presente en
concentraciones >100 mg/L. Ajustar a 6,0
el pH de 2 mL de zumo clarificado, con
NaOH 2M (el volumen de NaOH usado
debe ser considerado en el factor de
dilución final de la muestra). Añadir
aproximadamente 20U de ascorbato
oxidasa e incubar durante 10 minutos.
Ajustar el pH de la muestra a 8,0 con
NaOH 2M.
Para zumos coloreados, añadir 0,1 gramos
de polivinilpolipirrolidona (PVPP), agitar el
tubo vigorosamente durante 2 minutos y
filtrar a través del papel de filtro Nº 1 o
centrifugar a 4000 x g durante 10 minutos.
Usar el filtrado/sobrenadante claro,
ligeramente coloreado en el ensayo. Usar
por lo general un volumen de muestra de
0,1 mL.
(e) Determinación de sulfitos en
patatas.
Pesar con precisión aproximadamente 5
gramos de patatas secas y homogenizar
usando un mortero o una batidora.
Transferir la muestra a un matraz aforado
de 100 mL y añadir aproximadamente 60
mL de agua destilada caliente (≈70ºC) con
agitación vigorosa durante 5 minutos.
Conservar en hielo o en refrigeración
durante 15-30 minutos. Rellenar hasta la
marca con agua destilada, mezclar
conciezudamente y filtrar a través de papel
de filtro Whatman Nº1 o centrifugar
aproximadamente a 4000 x g durante 10
minutos. Usar el filtrado/sobrenadante en
el ensayo después de una dilución
apropiada (si fuera necesario).
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XV. REFERENCIAS

Beutler, H. -O. (1988). Sulphite, In Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.), 3rd
ed., Vol. VII, pp. 5, VCH Publishers (UK) Ltd, Cambridge, UK.
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