Métodos ópticos
método de calcular el índice de
Los métodos ópticos de análisis
químico se definen como aquellos
que miden la radiación
electromagnética que emana o
interactúa con la materia. Estos
métodos, tienen como objeto, la
medida de la radiación que es
emitida, absorbida, o transmitida al
interactuar el campo eléctrico o
magnético de la radiación con los
campos eléctricos o magnéticos de la
materia; o bien la medida de la
radiación que es reflejada, refractada,
difractada, polarizada o dispersada
cuando interactúa con la materia.
Los métodos ópticos se dividen en
espectroscópicos y no
espectroscópicos.
Los métodos espectroscópicos,
miden la radiación absorbida y
emitida por átomos, moléculas o
iones y se conocen como métodos
espectroscópicos de absorción o
emisión según sea el caso. Estos
métodos se caracterizan porque
existe intercambio de energía entre la
radiación electromagnética y la
materia, además se producen
transiciones entre distintos niveles
energéticos
Los métodos no espectroscópicos
miden cambios en la dirección de la
propagación de la luz, se caracterizan
porque no tiene lugar intercambio de
energía como consecuencia de la
interacción materia-radiación
electromagnética, son cambios en la
dirección o en las propiedades físicas
de la radiación electromagnética.
Refractometría
Se denomina refractometría al
refracción (una propiedad física
fundamental de cualquier sustancia)
de una muestra para conocer su
composición o pureza.
Cambio en la velocidad y dirección de
propagación debido a que pasa de un
medio a otro
Involucra la determinación de:
· El Índice de refracción de una
sustancia (n)
· El porcentaje de Sólidos Solubles
Principio de refracción
Basado en un rayo de luz que pasa
oblicuamente desde un medio hacia
otro de diferente densidad, cambia su
dirección cuando traspasa la
superficie. Este cambio en la
dirección se denomina refracción.
Cuando el segundo medio es más
denso que el primero el rayo se
aproxima a la perpendicular trazada
sobre la superficie divisoria en el
punto de incidencia. La causa
fundamental de este cambio en la
dirección se debe al cambio en la
velocidad de la luz que se hace más
lenta cuanto más denso sea el medio
por el que pasa el haz.
El ángulo formado entre el rayo en el
primer medio y la perpendicular se
llama ángulo de incidencia, i,
mientras que el correspondiente
ángulo en el segundo medio se
denomina ángulo de refracción, r.
Índice de refracción
Se define como el cociente entre el
seno del ángulo de incidencia (sen i)
y el seno del ángulo de refracción
(sen r) de la luz monocromática, al
pasar de un medio menos denso
generalmente aire a un medio más
denso.
El índice de refracción depende
fuertemente de la composición de la
muestra, de la temperatura y de la
longitud de onda de la luz utilizada.
Aplicaciones de la Refractometría:
1. Cualitativamente:
Para describir (Identificar y
Caracterizar) una especie química
por ejemplo aceites y grasas
En la identificación de compuestos
puros, correlacionado con los puntos
de ebullición y fusión
2. Cuantitativamente:
Identifica productos
Determina purezas de muestras
Evaluación de calidad en grasas y
aceites
Determinación de sólidos solubles en
frutas y productos de frutas como
mermeladas, néctares, pulpas, etc.
Mide concentraciones de azúcar
presentes en el producto a analizar.
Determinación de sólidos totales en
productos de tomates, jugos cítricos,
proteínas, huevos, leche, y productos
lácteos, cerveza, vinagre, alcohol.
REFRACCIÓN DE LENTES
Antiguamente se sabía que la luz
solar, al pasar por cristales
transparentes o joyas, como el
brillante, producía luces de colores.
Fue Newton quien demostró que la
luz blanca, al pasar por un prisma, se
descompone en diferentes colores y
que la función de éste es separar la
luz, refractándola en diferentes
colores.
A este fenómeno de esparcimiento
angular de todos los colores se le
llama dispersión de la luz, y a los
colores producidos espectro.
Cuando los medios en donde se
produce la refracción tienen sus
superficies curvas se llaman lentes,
las cuales son utilizadas para la
construcción de diferentes aparatos
ópticos, tales como microscopios,
telescopios, cámaras fotográficas o
proyectores de cine; o bien los
simples pero importantes lentes para
corregir los defectos de la vista de los
seres humanos.
Las lentes se clasifican en cóncavas
o divergentes y convexas o
convergentes.
Las lupas son las lentes
convergentes más conocidas, cuando
los rayos de luz se refractan, inciden
en un punto llamado foco principal,
dentro de las lentes convergentes
existen algunos elementos
importantes para la formación de
imágenes, y son el eje principal, el
centro óptico y los ejes secundarios;
cuando los rayos se refractan, se
interceptan en un punto; dando origen
1
a la imagen que puede ser real o
virtual.
La imagen real es aquélla que puede
ser proyectada en una pantalla, y la
virtual es la que se forma del mismo
lado del objeto. Un ejemplo de
imagen real es la que se obtiene al
proyectarse una película en pantalla,
y el de una virtual es la que se
observa con una lupa.
En las lentes divergentes existen los
mismos elementos que en las
convergentes, y el tipo de imagen que
se forma es virtual, siempre de menor
tamaño, lo mismo sucede con el foco,
que es virtual.
Refractómetro
Instrumento que se utiliza en el
laboratorio para medir el índice de
refracción de distintas sustancias
líquidas
Tipos de refractómetros:
a) Los que se basan en la medición
del ángulo crítico
b) Los basados en la determinación
del desplazamiento de una imagen
Refractómetro de Ángulo Crítico:
Son los instrumentos más usados
El ángulo crítico se forma, cuando el
ángulo del rayo incidente se
encuentra a un nivel tal que el ángulo
de refracción llega a ser de 90°, es
decir la radiación no pasa del medio 1
al medio 2, pero viaja a lo largo de la
superficie de la división perpendicular
a la normal, en forma rasante a la
superficie. En otras palabras es el
ángulo para el cual el ángulo de
refracción es de 90°, y tras el cual la
reflexión total es obtenida.
Refractómetro portátil
El prisma queda sumergido en la
muestra y sobre la cara del prisma se
refleja la luz blanca procedente de un
espejo. Posee un solo prisma Amici el
cual es un compensador que permite
el uso de radiación de una fuente de
tungsteno, ya que compensa la luz
dispersada en luz blanca en función
de la línea D del sodio. (Figura 4) las
características del Refractómetro de
Inmersión son:
1.1. Es el más sencillo de los
Refractómetros de ángulo crítico
1.2 Rango de n = 1.32 a 1.54
1.3. Apreciación de 0.0002 unidades
1.4. Dificultad para mantener
constante la temperatura
1.5. Usado extensamente en análisis
cuantitativo de soluciones acuosas
Refractómetro de ABBE
Es el más cómodo y más usado, la
muestra queda contenida como una
capa delgada de 0.01mm entre dos
prismas. El prisma superior puede
rotar ya que presenta un punto de
apoyo, el inferior forma bisagra con el
superior para permitir su limpieza e
introducción de la muestra (Figura 5)
2
2.1. Versátil, práctico Cada sustancia ópticamente activa
tiene su propia rotación específica,
2.2. Más generalizado determinada por la siguiente ecuación

2.3. Requiere muestras pequeñas [α](t,λ) =α(t,λ) / cI

2.4. Rango de n de 1.3 a 1.7 Dónde:

[α] =Rotación específica a una
2.5. Precisión 0.001, °Brix 0.5 determinada longitud de onda,
unidades
α =rotación óptica, c = concentración,
2.6. Más usado en alimentos I = paso óptico a través de la
muestra, t = temperatura, λ = longitud
2.7. Sistema comparador formado por de onda
2 prismas Amici
La luz polarizada se obtiene cuando
Polarimetría se logra que la radiación vibre en un
solo plano con respecto al haz de la
Es un método de análisis químico que trayectoria (Figura 1). La vibración se
nos permite medir el cambio que da en un solo plano en el espacio. La
sufre el plano de luz polarizada luz polarizada se obtiene por reflexión
cuando atraviesa un medio y por refracción.
transparente formado por sustancias
ópticamente activas ¿Qué es un La luz polarizada linealmente se
compuesto ópticamente activo? Un obtiene a partir de la luz natural,
compuesto es considerado cuando con los dispositivos ópticos
ópticamente activo si la luz adecuados (por ejemplo prismas de
linealmente polarizada sufre una Nicol, filtros de polarización) se
rotación cuando pasa a través de una eliminan todos aquellos componentes
muestra de dicho compuesto. cuyas vibraciones no se producen en
una determinada superficie, el
La actividad óptica rotatoria de una denominado plano de polarización
sustancia, tiene su origen en la
asimetría estructural de las Principios de la polarimetría La luz
moléculas. polarizada es aquella que ha pasado
a través de un “polarizador”, que
Rotación óptica: Es una técnica no fuerza ondas electromagnéticas
destructiva consistente en medir la aleatorizadas hacia un plano. Cuando
actividad óptica de compuestos tanto esta luz polarizada en un plano pasa
orgánicos como inorgánicos, puede a través de una sustancia
darse tanto en sólidos, como en ópticamente activa, el plano de
líquidos y soluciones. La rotación polarización se gira en una cantidad
óptica viene determinada por la que es característica de la sustancia
estructura molecular y la examinada. Los polarímetros
concentración de moléculas quirales detectan la posición del plano y la
comparan con su posición original
siendo la diferencia la rotación, que
3
se expresa normalmente en grados
angulares (ºA).
Actividad óptica
Medida de la capacidad de ciertas
sustancias de hacer girar la luz
polarizada plana.
En el polarímetro se trabaja con
sustancias ópticamente activas que
se clasifican en:
Dextrógiras: Desvían la luz hacia
la derecha
Levógiras: Desvían la luz
polarizada hacia la izquierda
Los azucares son compuestos
ópticamente activos, algunos como la
fructosa (ver tabla 1) son
levorrotatorios (giran la luz hacia la
izquierda) y otros son dextrorotatorios
(glucosa, sacarosa) cada azúcar tiene
una rotación específica característica.
Rotación
La rotación de radiación
polarizada plana puede variar
desde varios cientos de grados
hasta unas pocas centésimas
de grado, las variables
experimentales que pueden
influir son:
1. Concentración de la disolución a
medir
2. La naturaleza del solvente usado
(generalmente se emplea agua)
3. La temperatura: es casi
lineal
Aplicación:
1. Cualitativo:
1.1. La rotación óptica de un
compuesto puro es una constante
física útil para fines de identificación
junto con la medida de otras
propiedades físicas.
1.2. Para identificar ciertos líquidos o
soluciones como aminoácidos,
esteroides, alcaloides y carbohidratos
2. Cuantitativo:
2.1. Para medir la concentración de
compuestos que son ópticamente
activos por ej.: carbohidratos como
sacarosa, azúcar invertido y glucosa
o almidón (medición cuantitativa de
hidratos de carbono) o medir el grado
de conversión de ellos en procesos
químicos o enzimáticos.
2.2. Análisis del azúcar de la
remolacha.
2.3. Análisis de otros azucares
comerciales como la dextrosa, la
lactosa y la maltosa y productos que
contienen estos azucares
2.4. Se utiliza la rotación óptica para
la valoración de sustancias que son
ópticamente activas
2.5. Se pueden realizar curvas que
relacionan la rotación óptica con la
concentración. Estas pueden ser
lineales, parabólicas sin embargo el
uso más extenso de la Polarimetria
es en la industria de azúcar, para
4
determinar la concentración de
sacarosa. Si ella está sola en una
solución la rotación óptica es
directamente proporcional a la
concentración. Si están presentes
otros materiales ópticamente activos
el procedimiento es más complejo, Se
tiene que hacer una inversión del
azúcar entonces la concentración
será proporcional a la diferencia de la
rotación óptica antes y después de la
inversión.
Instrumentación
El instrumento empleado es el
polarímetro y sacarímetro cuyos
componentes básicos son: una fuente
de luz monocromática, un prisma
polarizador producir radiación
polarizada, un tubo de muestra, un
prisma analizador con escala circular
y un detector como se observa en la
figura 2.
TECNICA DEL MANEJO DE
MUESTRAS PROBLEMA
1. Ponga en cero grados el
analizador y encienda la
fuente.
2. Mire la energía luminosa de la
fuente a través del analizador y
rote el polarizador hasta que la
intensidad de la luz que
observe sea mínima.
3. Llene el tubo porta-soluciones
con agua destilada y colóquelo
entre los dos elementos
polarizantes. Observe la luz de
la fuente a través del
analizador y determine si el
agua le produjo un cambio
notable a la intensidad
luminosa, si no es así.
4. Vacíe el tubo porta-soluciones
y llénelo de la muestra que
contiene el líquido (solución) a
examinar de más baja
concentración. Observe la luz
de la fuente a través del
analizador y determine si se
presentó algún cambio en la
intensidad luminosa como
producto de la solución que se
colocó.
5. 4. Mirando la fuente a través
del analizador, rótelo en el
sentido de las manecillas del
reloj hasta que vuelva a
establecer el mínimo de
intensidad. Establecido dicho
estado, mida y anote el ángulo
que roto el analizador. Esa
cantidad son los grados que
esa concentración de la
solución giró el plano de
polarización del campo
eléctrico.
6. 5. Vacíe el tubo porta-
soluciones y coloque en él un
poco de la muestra siguiente.
Agite el líquido y luego tírelo. A
continuación, llénelo de la
misma solución y coloque el
tubo en el lugar indicado.
Observe la luz de la fuente a
través del analizador y
determine si se presentó algún
cambio en la intensidad
luminosa.
7. 6. Cada vez que trabaje con
una nueva solución o
sustancia, repita el paso 6 para
eliminar los residuos de la
anterior y no se provoque un
error experimental.
Polarímetro
Las partes fundamentales de la
operación de un polarímetro son:
5
1) Una fuente de luz (por lo general
una lámpara sodio)
2) Un polarizador
3) Un tubo para mantener la
substancia (o solución) ópticamente
activa en el rayo luminoso
4) Un analizador
5) Una escala para medir el número
de grados que el plano de la luz
polarizada ha girado.
Componentes:
1. Fuente: Como la rotación óptica
varía con la longitud de onda, se
emplea la luz monocromática. Por lo
general una lampara de vapor de
sodio lampara de mercurio
2. Polarizador Analizador: Es la pieza
central de un polarímetro llamado
frecuentemente prisma de Nicol o de
Glan-thompson, que trabajan con el
principio de doble refracción y que
sirven paras seleccionar el rayo
polarizado linealmente (el rayo de luz
Extraordinario) el polarizador mas
alejado de la fuente de luz (por lo
general la línea D del sodio) se
denomina analizador
Si se ajustan ambos prismas a una
porción cruzada en ausencia de
muestra se observa un mínimo de
intensidad de luz, al colocar la
muestra la rotación del haz causa un
aumento de la intensidad de luz que
es contrarrestada por rotación del
prisma analizador. Este cambio
angular requerido para reducir al
mínimo la intensidad corresponde a la
potencia rotatora de la muestra. La
posición de intensidad mínima no
puede determinarse con seguridad
por el ojo por lo que se dispone de
dispositivos de media sombra, un
pequeño prisma de nicol llamado
prisma Lippich. Este dispositivo
intercepta la mitad del haz que sale
del polarizador, entonces si se ajusta
a 90° el prisma polarizador con
respecto al analizador, se observa un
campo claramente dividido, en una
porción oscura y otra iluminada. La
porción iluminada corresponde a la
mitad del haz que ha sido girado por
el prisma auxiliar y la porción oscura
corresponde al haz no obstruido. (Por
motivos prácticos, los aparatos más
utilizados trabajan de modo visual,
llamados polarímetros de
semisombra en ellos el campo visual
aparece partido en dos mitades
diferenciadas que durante la medida
se comparan para ver si son igual de
oscuras.
3. Tubos de muestra: Tubos
cilíndricos de 10 a 20 cm construidos
de vidrio
4. Sacarímetro: Sacarosa y azucares
comerciales. Este instrumento es más
comúnmente utilizado en análisis de
azúcar que el polarímetro. Las
diferencias entre un polarímetro y un
sacarímetro, es que el polarímetro
emplea luz monocromática y da
lecturas del ángulo de rotación,
mientras que el sacarímetro emplea
luz blanca y una cuña de cuarzo
compensadora además da lecturas
del porcentaje de azúcar
directamente.
Microscopio
El microscopio en un instrumento que
permite observar objetos no
perceptibles a simple vista. Esto se
6
logra mediante un sistema óptico
compuesto por lentes, que forman y
amplifican la imagen del objeto en
observación.
Existen dos tipos de microscopios
que emplean la luz como fuente de
energía para formar imágenes
aumentadas y detalladas de objetos
que a simple vista no es posible
observar:
a) Microscopio fotónico simple o lupa.
b) Microscopio fotónico compuesto.
El microscopio simple o lupa es un
instrumento de amplificación de
imágenes que consiste en la
utilización de una o más lentes
convergentes en un solo sistema
óptico.
Los microscopios fotónico
compuestos se denominan
compuestos porque la imagen se
forma mediante la utilización de tres
sistemas de lentes, cada uno de ellos
constituidos por lentes convergentes
y divergentes.
En la actualidad, el microscopio
fotónico es un instrumento de uso
cotidiano en los laboratorios de
investigación y de diagnóstico así
como en las aulas de enseñanza de
Biología, Embriología, Histología,
Microbiología y Patología.
COMPONENTES DEL
MICROSCOPIO FOTÓNICO. El
microscopio fotónico compuesto está
integrado por tres tipos de
componentes:
a) COMPONENTES MECÁNICOS:
Son aquellos que sirven de sostén,
movimiento y sujeción de los
sistemas ópticos y de iluminación así
como de los objetos que se van a
observar.
• Base o pie. Es un soporte
metálico, amplio y sólido en donde se
apoyan y sostienen los otros
componentes del microscopio.
• Brazo, estativo o columna.
Permite la sujeción y traslado del
microscopio. Soporta al tubo óptico, a
la platina y el revolver.
• Platina. Superficie plana de
posición horizontal que posee una
perforación circular central. En ella se
apoya la preparación (lámina
portaobjetos que contiene a la
muestra que se va a examinar) que
se sujeta a la platina mediante pinzas
o con un carrito o charriot que,
mediante mandos especiales facilitan
el movimiento de la preparación de
derecha a izquierda y de adelante
hacia atrás.
• Tubo óptico. Consiste en un
cilindro metálico que suele medir
160mm o 170 mm de longitud
(dependiendo del fabricante del
microscopio) el cual en un extremo,
está conectado al revolver o porta
objetivos y en el otro se relaciona con
el (los) ocular(es).
• Revolver o porta objetivos. Es un
componente que gira alrededor de un
eje con la finalidad que los objetivos
que sostiene coincidan de manera
perpendicular con la perforación
central de la platina. En su superficie
inferior posee varios agujeros donde
se atornillan los objetivos.
7
 • Tornillos macrométrico
micrométrico. Generalmente están
situados en la parte inferior del brazo
o columna. Pueden estar separados
(en los 2 microscopios antiguos) o el
tornillo micrométrico está incorporado
en la circunferencia del tornillo
macrométrico (microscopios
actuales). Ambos tornillos permiten el
desplazamiento de la platina hacia
arriba y hacia abajo con la finalidad
de acercar o alejar la preparación
hacia los objetivos y así conseguir un
enfoque óptimo de la imagen.
• Engranajes y cremallera.
Constituyen mecanismos de
desplazamientos de las diferentes
partes del microscopio.
• Cabezal. Es un componente
situado en relación con el tubo del
microscopio que alberga
principalmente prismas o espejos que
sirven para acondicionar en él dos o
más oculares, o sistemas mecánicos
que soportan cámaras fotográficas,
de vídeo o sistemas de proyección de
la imagen.
B) COMPONENTES ÓPTICOS: Son
los objetivos, los oculares, el
condensador y los prismas. Los tres
primeros están constituidos por
sistemas de lentes positivos y
negativos.
• Condensador: Es el componente
óptico que tiene como función
principal concentrar y regular los
rayos luminosos que provienen de la
fuente luminosa
• Objetivos. Los objetivos están
considerados los elementos más
importantes en la formación de la
imagen microscópica, ya que estos
y sistemas de lentes establecen la
calidad de la imagen en cuanto a su
nitidez y la capacidad que tiene para
captar los detalles de la misma.
• Ocular: Es otro componente óptico
del microscopio, debe su nombre
porque la imagen final se observa a
través de él acercando el ojo a la
lente “ocular” del componente.
• Prismas: Estructuras transparentes
que, en el caso de los microscopios
monoculares, sirven para desviar los
rayos luminosos de la trayectoria
rectilínea del eje óptico del objetivo y
dirigirlos hacia el tubo óptico
ligeramente inclinado y luego hacia el
ocular.
C) COMPONENTES DE
ILUMINACIÓN: Se consideran dentro
de este grupo a los instrumentos que
proporcionan energía luminosa al
microscopio. Las fuentes de energía
luminosa son de dos tipos natural y
artificial.
La luz natural, emitida por el sol, se
obtiene de manera indirecta mediante
un espejo que posee una superficie
plana y otra cóncava. El espejo está
situado en la superficie superior de la
base o pie. Un mecanismo especial
permite orientarlo hacia un lugar
iluminado indirectamente por el sol
(una ventana, por ejemplo) y luego
dirigir el haz luminoso hacia la lente
del condensador.
La luz artificial se genera a través de
una lámpara de bajo voltaje
(generalmente de 6 voltios) que,
mediante un reóstato regula la
emisión y la intensidad de luz. Al igual
que el espejo, este sistema de
8
iluminación se inserta en la base o
pie del microscopio.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
FOTÓNICOS. Las características
descritas, de los componentes del
microscopio fotónico, así como la
formación de las imágenes de los
objetos observados corresponden al
microscopio fotónico de mayor uso en
los ámbitos académicos docentes y
de investigación el denominado:
Microscopio de transparencia o de
campo claro: Este microscopio se
caracteriza porque emplea luz natural
o luz artificial como energía luminosa
para formar las imágenes del objeto
que se observa.
Microscopio de campo oscuro: Se
denomina así porque la imagen que
se forma está constituida por una
serie de estructuras brillantes sobre
un fondo oscuro.
Microscopio de contraste de fases: Es
el microscopio fotónico más utilizado
para observar objetos o estructuras
transparentes sin teñir. Al igual que el
microscopio de campo oscuro facilita
la observación de células vivas para
distinguir y analizar sus componentes
morfológicos y ciertas funciones que
ellas puedan desarrollar
Microscopio electrónico: Utiliza
electrones en lugar de fotones o luz
visible para formar imágenes de
objetos diminutos, consigue una
capacidad de aumento superior al
microscopio convencional.
CROMATOGRAFIA
Tswett, un científico ruso, informó en
1906 acerca de la separación de los
componentes de diferentes colores
procedentes de hojas al hacer pasar
un extracto de éstas a través de una
columna de carbonato de calcio,
alúmina y sacarosa. Acuñó el término
cromatografía con las palabras
griegas que significan “color” y
“escribir”.
¿Qué es la cromatografía?
La Cromatografía es una técnica de
separación en la que los
componentes de una muestra se
separan en dos fases: una fase
estacionaria de gran área superficial,
y una fase móvil. El objetivo de la
fase estacionaria es retrasar el paso
de los componentes de la muestra.
Cuando los componentes pasan a
través del sistema a diferentes
velocidades, estos se separan en
determinados tiempos. Cada
componente tiene un tiempo de paso
característico a través del sistema,
llamado tiempo de retención. La
separación cromatográfica se logra
cuando el tiempo de retención del
analito difiere del resto de
componentes de la muestra.
Según IUPAC:
La Unión Internacional de Química
Pura y Aplicada (IUPAC) ha
propuesto una definición de
cromatografía: “cromatografía es un
método físico de separación, en el
que los componentes a separar se
9
distribuyen entre dos fases, una cuya superficie se
estacionaria (fase estacionaria) y otra separan
que se mueve (fase móvil) en una las sustancias.
dirección definida” Fase móvil Fase que se está
moviendo en una
dirección
determinada. Puede
Conceptos en la Cromatografía ser un líquido o
gas. La fase móvil
Concepto Definición se mueve a través
Analito Es la sustancia de una columna que
producto de un lleva la muestra a
proceso separar.
cromatográfico.
Cromatografía Se utiliza para
Analítica determinar la
presencia y
concentración de Tipos de Cromatografía
analito en la
muestra. Aunque hay muchas y variadas
Cromatografía Se utiliza para la técnicas cromatográficas, el objetivo
Preparativa purificación de de todas es separar las sustancias
sustancias con fines que forman una mezcla y enviarlas
específicos (para el secuencialmente a un detector para
análisis). que las determine y cuantifique.
Cromatogram Es una
a representación Todas se basan en el mismo
visual de los fenómeno: permitir que las sustancias
resultados del que forman una mezcla entren en
proceso contacto con dos fases (un líquido y
cromatográfico. Cad un gas, un sólido y un líquido, etc.).
a sustancia Una de las fases es estática (no se
corresponde a un mueve) y tenderá a retener las
cierto pico en el sustancias en mayor o menor grado;
cromatograma. la otra, fase móvil, tenderá a
Cromatógrafo Instrumento para la arrastrarlas. Cada sustancia química
realización de la tiene distinta tendencia a ser retenida
cromatografía.
y a ser arrastrada.
Tiempo de Tiempo durante el
retención cual el analito pasa
a través del sistema
cromatográfico en Dependiendo de la naturaleza de la
ciertas condiciones. fase estática y de la fase móvil se
Fase Sustancia que se pueden distinguir distintos tipos
estacionaria fija a la columna o de cromatografía:
en el panel, sobre

10
 a) Cromatografía sólido-líquido: La
fase estática o estacionaria es un
sólido y la móvil un líquido.
b) Cromatografía líquido-líquido: La
fase estática o estacionaria es un
líquido anclado a un soporte sólido.
c) Cromatografía líquido-gas: La fase
estática o estacionaria es un líquido
no volátil impregnado en un sólido y
la fase móvil es un gas.
d) Cromatografía sólido-gas: La fase
estacionaria es un sólido y la móvil un
gas.
Según el tipo de interacción que se
establece entre los componentes
de la mezcla y la fase móvil y
estacionaria podemos distinguir
entre:
a) Cromatografía de adsorción:
La fase estacionaria es un sólido
polar capaz de adsorber a los
componentes de la mezcla mediante
interacciones de tipo polar.
La fase estacionaria es un sólido
sobre el que se adsorben los
componentes de la muestra. La fase
móvil puede ser un líquido
(cromatografía líquido-sólido) o un
gas (cromatografía gas-sólido); los
componentes se distribuyen entre las
dos fases por una combinación de
procesos de sorción y desorción. La
cromatografía en capa delgada (TLC,
thin-layer chromatography) es un
ejemplo especial de cromatografía de
adsorción donde la fase estacionaria
es un plano en la forma de un sólido
soportado sobre una placa inerte, y la
fase móvil es un líquido.
b) Cromatografía de partición:
La separación se basa en las
diferencias de solubilidad de los
componentes de la mezcla en las
fases estacionaria y móvil, que son
ambas líquidas.
La fase estacionaria en la
cromatografía de partición es un
líquido soportado en un sólido inerte.
Aquí la fase móvil también puede ser
un líquido (cromatografía de partición
líquido-líquido) o un gas
(cromatografía gas-líquido, GLC). En
el modo normal de operaciones de la
partición líquido-líquido se usa una
fase estacionaria polar (como
metanol sobre sílice) con una fase
móvil no polar (como hexano). Esto
favorece la retención de compuestos
polares y la elución de compuestos
no polares, y se denomina
cromatografía de fase normal. Si se
usa una fase estacionaria no polar y
una fase móvil polar, entonces se
retienen más los solutos no polares y
los solutos polares se eluyen con
mayor facilidad. A esto se le llama
cromatografía de fase inversa o
reversa, y en realidad es la más
común.
En la cromatografía de fase normal
se separan los componentes polares
estacionaria polar. En la
cromatografía de fase inversa, los
11
compuestos no polares se separan
en una fase estacionaria no polar.
¡Esta última es más común!
c) Cromatografía de intercambio
iónico:
La fase estacionaria es un sólido que
lleva anclados grupos funcionales
ionizables cuya carga se puede
intercambiar por aquellos iones
presentes en la fase móvil.
En la cromatografía de intercambio
iónico se usa una resina de
intercambio iónico como fase
estacionaria. El mecanismo de
separación se basa en equilibrios de
intercambio iónico. En la
cromatografía de exclusión de
tamaño se separan moléculas
solvatadas de acuerdo con su tamaño
gracias a su facilidad de penetrar en
una estructura como la de una criba
(la fase estacionaria).
Cromatografía en columna:
En la cromatografía en columna, la
columna puede empacarse con
partículas pequeñas que constituyen
la fase estacionaria (cromatografía de
adsorción), o recubierta con una capa
delgada de fase líquida
(cromatografía de partición).
La separación de esos componentes
en una columna cromatográfica. Se
coloca un pequeño volumen de la
muestra en la parte superior de la
columna, llena con partículas
cromatográficas (fase estacionaria) y
disolvente. Se agrega la fase móvil de
disolvente a la columna y se deja que
salga lentamente por su parte inferior.
Un soluto está en equilibrio entre una
fase móvil y una estacionaria. Cuanto
más interactúe con la fase
estacionaria, más lentamente se
moverá a través de una columna.
Cromatografía líquida:
La fase móvil es un disolvente o
mezcla de disolventes y la fase
estacionaria un sólido que interactúa
con las sustancias que se desea
separar (cromatografía líquido-
sólido), o bien un líquido inmiscible
con la fase móvil, depositado en la
superficie de un sólido (cromatografía
líquido-líquido). Esta forma de
cromatografía puede realizarse con
diferentes arreglos experimentales:
en columna, en capa delgada o en
papel. En el primer caso, la fase
estacionaria se encuentra rellenando
un tubo; en el segundo, se dispersa
sobre una lámina de vidrio o aluminio
formando un lecho de espesor
uniforme; en la cromatografía en
papel, la fase estacionaria es la
solución acuosa contenida en el
interior de las celdas formadas por las
fibras de la celulosa, y es por tanto
una forma de cromatografía líquido-
líquido.
Cromatografía de gases:
En este caso la fase móvil es un gas
inerte (helio o nitrógeno) y la fase
12
estacionaria es un sólido
(cromatografía gas-sólido) o un
líquido “sostenido” por un sólido
inerte (cromatografía gas-líquido).
Este tipo de cromatografía siempre es
en columna, ya que es la única
manera de que la fase móvil gaseosa
se mantenga fluyendo, confinada
dentro del sistema. La columna
puede estar rellena con la fase
estacionaria, en forma semejante a la
cromatografía líquida, o bien la fase
estacionaria puede depositarse sobre
las paredes de un tubo muy delgado
(0.25mm de diámetro) y largo (hasta
100m). Este tipo de columnas se
conocen como columnas capilares y
proporcionan la mayor capacidad de
separación. De acuerdo con el
mecanismo de retención, la
cromatografía se puede clasificar en
los siguientes tipos:
 Adsorción (normal, de fase
reversa)
 Partición líquido-líquido
 Intercambio iónico
 De afinidad
Las áreas de aplicación son muy
diversas y abarcan prácticamente
todas las actividades en las que
interviene la química, por ejemplo: se
emplea en: El análisis de drogas y
fármacos en fluidos biológicos como
la saliva, la sangre, la orina; Seguir la
transformación de las sustancias
responsables de la transmisión
neurológica; Determinar la presencia
de contaminantes en el medio
ambiente; Descifrar la composición
de los combustibles fósiles; Realizar
el control de calidad de los productos
químicos y farmacéuticos
manufacturados; en fin, la lista de
ejemplos es interminable.
Cromatografía en Papel:
La cromatografía en papel es un
proceso muy utilizado en los
laboratorios para realizar análisis
cualitativos ya que pese a no ser una
técnica potente no requiere de ningún
tipo de equipamiento. La fase
estacionaria está constituida
simplemente por una tira de papel de
filtro. La muestra se deposita en un
extremo colocando pequeñas gotas
de la disolución y evaporando el
disolvente. Luego el disolvente
empleado como fase móvil se hace
ascender por capilaridad. La
separación se realiza en función de la
afinidad de los solutos con las dos
fases, las más solubles en agua se
quedarán cerca del punto donde se
aplicó la muestra, y las menos
solubles en agua y más solubles en el
disolvente llegarán más lejos.
La cromatografía en papel es una
técnica utilizada para análisis
inorgánico cualitativo, permite llevar a
cabo la separación e identificación de
iones, trabajando con cantidades
mínimas de sustancia. Pertenece al
tipo de “Cromatografía de partición”
se fundamenta en que las sustancias
problema, pueden tener diferentes
coeficientes de reparto en dos
disolventes de inmiscibilidad limitada,
uno permanece fijo en la superficie
del papel “fase estacionaria”
13
generalmente en agua, la fase móvil
constituida generalmente por una
mezcla de disolventes parcialmente
miscibles en ella. Hay varios tipos de
cromatografía, la ascendente (papel
hacia arriba), descendente (papel
invertido), radial y de separación de
zonas y sectores.
Cromatografía en capa fina:
Se basa en la preparación de una
capa, uniforme, de un adsorbente
mantenido sobre una placa de vidrio
u otro soporte. Los requisitos
esenciales son, pues, un adsorbente,
placas de vidrio, un dispositivo que
mantenga las placas durante la
extensión, otro para aplicar la capa
de adsorbente, y una cámara en la
que se desarrollen las placas
cubiertas. Es preciso también poder
guardar con facilidad las placas
preparadas y una estufa para
activarlas. La fase móvil es líquida y
la fase estacionaria consiste en un
sólido. La fase estacionaria será un
componente polar y el eluyente será
por lo general menos polar que la
fase estacionaria, de forma que los
componentes que se desplacen con
mayor velocidad serán los menos
polares. Polaridad de los compuestos
orgánicos en orden creciente.
Hidrocarburos < olefinas < flúor <
cloro < nitro < aldehído aldehído <
ester < alcohol < cetonas < aminas <
ácidos < amidas
Generalmente se utiliza como
reactivo revelador yodo, el cual forma
complejos coloreados con los
componentes orgánicos (con tonos
amarillo-marrón), pero las manchas
desaparecen con el tiempo con lo que
es conveniente señalar las manchas
aparecidas. Otro reactivo revelador
bastante utilizado es el ácido
sulfúrico, que reacciona con los
componentes orgánicos produciendo
manchas negras. Sin embargo debe
tenerse en cuenta que el tamaño de
las manchas no está relacionado con
la cantidad de componente separado
Cromatografía en intercambio
iónico:
La cromatografía de intercambio
iónico se lleva a cabo con empaques
de columna que tiene grupos
funcionales cargados unidos a una
matriz polimérica. Los grupos
funcionales enlazados
permanentemente y asociados con
contra iones de carga opuesta. El
mecanismo de retención más común
es el intercambio simple de los iones
de la muestra y de la fase móvil con
el grupo cargado de la fase
estacionaria. En el caso de
empaques cargados negativamente
sirven para intercambiar especies
catiónicas.
Aplicaciones de intercambio
catiónico: Los cationes inorgánicos
se pueden determinar en alimentos,
tales como los alimentos dietéticos
bajos en sodio, y en muestras de
orina.
Aplicaciones de intercambio
aniónico: Se pueden separar los
ácidos HCN, carbónico, silícico y
14
bórico de los ácidos fosfórico,
sulfúrico y clorhídrico. Los metales
que forman complejos cloruro y
floruro
Cromatografía de fluidos
supercríticos:
La temperatura crítica de una
sustancia es la temperatura por
encima de la cual no puede existir en
la fase líquida independientemente de
la presión. La presión crítica es la
presión de vapor de una sustancia a
su temperatura crítica. Una sustancia
a temperaturas y presiones por
encima de su temperatura y de su
presión crítica (punto crítico) se
denomina fluido supercrítico. Los
fluidos supercríticos tienen
densidades, viscosidades y otras
propiedades que son intermedias
entre las características de esa
sustancia en estado gaseoso y en
estado líquido.
La ventaja de los fluidos supercríticos
es que son baratos, inocuos y no son
sustancias tóxicas, por lo que se
pueden dejar evaporar libremente en
la atmósfera sin efectos ambientales
dañinos.
Los equipos instrumentales para la
cromatografía de fluidos supercríticos
son bastante parecidos en lo
referente a los componentes
instrumentales a los equipos de
HPLC. Existen, sin embargo, dos
diferencias importantes: (1) Es
necesario un horno, similar para
mantener la columna termostatizada
y además proporcionar un control
preciso de la temperatura de la fase
móvil; (2) un restrictor o un dispositivo
de contrapresión, que se utiliza para
mantener la presión en la columna en
el nivel deseado y para convertir el
fluyente, de fluido supercrítico en un
gas, y arrastrarlo al detector.
La cromatografía de fluidos
supercríticos se ha aplicado a la
separación de un amplio conjunto de
sustancias, entre los que se cuentan
productos naturales, fármacos,
alimentos, pesticidas y herbicidas,
tensoactivos, polímeros, aditivos de
polímeros, combustibles fósiles y
explosivos y propelentes.
Cromatografía de afinidad:
La cromatografía de afinidad separa
las proteínas (analitos) en función de
su especificidad de fijación de
ligandos. Los ligandos de afinidad
son moléculas poliméricas que sirven
de soporte porque están unidas
covalentemente sobre la columna
cromatográfica o matriz inerte que
debe de tener una estructura de poro
abierta y estabilidad en condiciones
de cambio de pH, detergentes y
agentes disociantes, para así, retener
y adsorber específicamente a las
proteínas, la fase estacionaria es
sólida.
La cromatografía de afinidad tiene la
ventaja de ser altamente selectiva
para la retención de proteínas afines
a la columna, para ello, emplea
sistemas de baja presión, columnas
cortas y un campo restringido para la
separación.
15
Esquema de cromatografía de
afinidad: En el primer vaso, se
encuentra una mezcla de proteínas
que se añaden a la columna, la cual
contiene un ligando específico ligado
al polímero, para la proteína de
interés. En el segundo matraz se
encuentra una solución de ligando, el
cual se añade a una probeta para que
eluya a la proteína de interés. La
bureta de en medio indica que las
proteínas deseadas se lavan a través
de la columna. Los puntos rojos
representan la proteína de interés, los
negros, el ligando y las bolas beige
unidas a los puntos negros,
representan el ligando acoplado con
el polímero.
Cromatografía de líquidos de alta
resolución:
La cromatografía de líquidos de alta
eficacia es la técnica analítica de
separación más ampliamente
utilizada. Las razones son la
sensibilidad, su fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas
exactas, es ideal para la separación
de especies no volátiles o - Para el estudio de mezclas
termolábiles y por su gran
aplicabilidad a sustancias que son de
interés en la industria. Algunos
ejemplos son: aminoácidos,
proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos,
fármacos, terpenoides, plaguicidas,
ELECTROFORESIS
1. ¿QUÉ ES?
Técnica para la separación de
moléculas según la movilidad de
antibióticos, esteroides, especies
organometálicas y gran variedad de
sustancias inorgánicas. La fase móvil
es un líquido y la fase estacionaria es
una columna que puede ser de acero
inoxidable.
Aplicaciones de la cromatografía
en la vida diaria:
- Se suele usar para tomar pruebas
de la escena de un crimen (el análisis
de muestras de sangre o de telas).
- Verificación de incendios
provocados (identificación de las
sustancias químicas responsables de
un fuego).
- Análisis de sangre después de la
muerte o en vida para determinar los
niveles de alcohol, drogas o
sustancias venenosas en el cuerpo.
- También se utiliza para determinar
la composición de los alimentos.
- Para mirar los niveles de
contaminación, por ejemplo, del agua
o del aire.
complejas en cosas tales como
alimentos, perfumes, petroquímica, y
producción farmacéutica.
estas en un campo eléctrico a través
de una matriz porosa, la cual las
separa por tamaños moleculares y
carga positiva.
2. APLICACIONES
16
  Determinación de la masa
muscular.
 Determinación del punto
isoeléctrico.
 Isoenzimas.
 Mapas de restricción.
 Secuenciación de ácidos
nucleicos.
 3. CONCEPTOS BÁSICOS
3.1 Electroforesis capilar
Técnica de separación que se ha
desarrollado gracias a los avances de
la cromatografía líquida de alta
eficacia.
Permite separa biomoléculas, donde
la cromatografía liquida se muestra
menos eficaz, y compuestos de
pequeña masa molecular.
3.2 Métodos de Detección.
Se mide intensidad de la luz que pasa
a través del capilar en una pequeña
zona en la que se ha eliminado el
revestimiento opaco.
Detección por fluorescencia resulta
mas sensible si se emplea una fuente
laser muy intensa.
4. MODOS DE DISPOSICIÓN DE
SOPORTE
4.1 Horizontal.
 En papel para aminoácidos u
otras moléculas pequeñas.
 En gel de almidón o agarosa
para proteínas y ácidos
nucleicos.
4.2 Vertical.
 Casi exclusivamente con gel
de poliacrilamida para
proteínas y ácidos nucleicos
de pequeño tamaño.
 Gel: electroforesis continua (un
solo tipo de gel) y
electroforesis discontinua (2
tramos de gel de composición
ligeramente diferente.
5. TÉCNICAS
ELECTROFORÉTICAS
5.1 Electroforesis capilar en zona o
en disolución libre (CZE)
Procedimiento de electroforesis más
habitual, en el cual el capilar es
recorrido por el electrolito a través de
un medio buffer que puede ser ácido
(fosfato o citrato), básico (borato), o
anfótero (carácter ácido y básico). El
flujo electroosmótico crece con el pH
del medio electroforético.
5.2 Electroforesis capilar
electrocinética micelar (MEKC)
En esta variante del procedimiento
anterior se añade a la fase móvil un
compuesto catiónico o aniónico para
formar micelas cargadas. Estas
pequeñas gotas inmiscibles con la
disolución retienen a los compuestos
neutros de un modo más o menos
eficaz, por afinidad hidrófilahidrófoba.
Se puede utilizar este tipo de
electroforesis para moléculas que
tienen tendencia a migrar sin
17
separación, como es el caso de 5.4 Isoelectroenfoque capilar
algunos enantiomeros. (CIEF)
Esta técnica, también conocida como
electroforesis en soporte, consiste
5.3 Electroforesis capilar en gel
en crear un gradiente de pH lineal en
(CGE)
un capilar con pared tratada que
Esta es la transposición de la contiene un anfótero. Cada
electroforesis en gel de poliacrilamida compuesto migra y se enfoca al pH
o de agarosa. El capilar está relleno que tenga igual valor que su punto
con un electrolito que contiene al gel. isoeléctrico (al pI su carga neta es
Se produce un efecto de filtración que nula). Seguidamente, bajo el efecto
ralentiza a las grandes moléculas y de una presión hidrostática y
que minimiza los fenómenos de manteniendo el campo eléctrico, se
convección o de difusión. Los desplazan las especies separadas
oligonucleótidos, poco frágiles, se hacia el detector. Las altas eficiencias
pueden separar de este modo. obtenidas con este procedimiento
permiten separar péptidos con pI que
apenas difieren entre sí 0.02
unidades de Ph
atómica y para
espectroscopia de masa
Sistemas para la introducción de
atómica. Existen dos
muestras.
opciones: plasmas
 ATOMIZADORES acoplados
CONTINUOS: inductivamente o
1. Fuentes de plasma: corriente directa (cd).
disponibles en el 2. Atomizadores de
mercado desde 1970, flama: consiste en un
es una mescla gaseosa nebulizador neumático,
conductora que el cual convierte la
contiene una disolución de la muestra
concentración en una neblina, o
significativa de iones y aerosol, que es
electrones. Ha sido introducido en un
utilizada para emisión incinerador. El
atómica, fluorescencia nebulizador concéntrico

18
 es el más popular. En la 2.4.3 ESPECTROMETRÍA DE
mayoría de los ABSORCIÓN ATÓMICA.
atomizadores, el
2.4.3.1 PRINCIPIOS.
oxidante es un gas de
alta presión, con el
La solución de la muestra se aspira y
aerosol que contiene el
se introducen en una flama, como en
oxidante siendo
la espectrometría de emisión de
mezclado
flama; el elemento en la muestra se
posteriormente con el
convierte en vapor atómico. De esta
combustible. Los
manera, la flama contiene átomos del
incineradores utilizados
elemento; algunos son excitados
en espectroscopia de
térmicamente por la temperatura de
flama suelen ser los
la flama, pero casi todos permanecen
incineradores de flujo
en estado fundamental.
laminar previamente
mezclado. Estos átomos en estado fundamental
pueden absorber radiación de
 ATOMIZADORES
determinada longitud de onda
DISCRETOS:
producida en una fuente especial que
3. Atomizador electro
contenga ese mismo elemento. Las
térmico: disponibles
longitudes de onda de la radiación
desde 1970, ofrecen
emitida por la fuente son las mismas
una mayor sensibilidad
que absorben los átomos en la flama.
debido a que toda la
muestra es atomizada La absorción obedece la ley de Beer.
en un periodo corto y Esto es, la absorbencia es
porque el tiempo directamente proporcional a la
promedio de residencia longitud de trayectoria en la flama y a
de los átomos en la concentración de vapor atómico en
trayectoria óptica es de ella. Ambas variables son difíciles de
un segundo o más. determinar, pero se puede mantener
constante la longitud de trayectoria y

19
entonces la concentración del vapor
atómico será directamente
proporcional a la concentración del
analito en la solución que se aspira.
El procedimiento se puede utilizar
para preparar una curva
calibración --de concentración en la
solución-- en función de
absorbencia. La desventaja principal
de hacer mediciones por absorción
atómica es que para cada elemento
se requiere una fuente diferente.
2.4.3.2 DESCRIPCIÓN DE
TÉCNICA.
Como en la espectrometría normal de
absorción, las necesidades para la
espectrometría de absorción atómica
son una fuente luminosa, una celda
(la flama), un monocromador y un
detector. La flama se sitúa entre la
fuente y el monocromador.
Se trata de un instrumento de Haz
doble. El haz de la fuente se envía de
manera alternada a través de la flama
y en otra trayectoria que no pasa por
ella mediante un espejo de sector que
lo divide. El detector mide esta
alternancia y despliega el logaritmo
de la relación. El amplificador del
detector se ajusta para sólo recibir
radiación modulada a la frecuencia
del espejo de sector y entonces se
discrimina contra la emisión emitida
por la flama.
de
2.4.3.3 INSTRUMENTACIÓN.
la
Se requieren instrumentos de doble
haz para la corrección de fondo si se
usan lámparas continuas de deuterio.
No obstante, el divisor de haz para
obtener el haz doble reduce la
LA
energía radiante y causa mayores
niveles de ruido (disminuye las
relaciones de señal a ruido). Se
encuentran disponibles instrumentos
de un solo haz de fuente de alta
energía que usan correcciones de
fondo basados en una línea (miden la
absorción del fondo con una línea
cercana a la línea del analito); estos
equipos proporcionan buenas
relaciones de señal a ruido y son más
pequeños e incluso más portátiles.
1.Fuentes. Se requiere una fuente de
líneas nítidas en absorción atómica
porque el ancho de la línea de
absorción es muy estrecho --de unas
milésimas a una centésima de
20
nanómetro, cuando mucho--. Por ser se desprenda y se evapore. El metal
una línea de absorción tan angosta, vaporizado se excita a niveles
sólo se absorbe una pequeña electrónicos más altos debido a las
fracción de la radiación producida en continuas colisiones con los iones
una fuente continua que pasa por la gaseosos de alta energía; cuando los
rendija y llega al detector. electrones regresan al estado
fundamental emiten las líneas
La fuente que se usa casi
características de ese elemento
exclusivamente es una lámpara de
metálico. También se emiten las
cátodo hueco (HCL, hollow-cathode
líneas del gas de relleno, pero en lo
lamp). Se trata de una fuente de
general no están lo suficientemente
líneas definidas que emite longitudes
cerca de las del elemento como para
de onda específicas (en esencia,
interferir.
monocromáticas).
Estas líneas emitidas por la lámpara
Consiste en un cátodo cilíndrico
de cátodo hueco atraviesan la flama y
hueco hecho del elemento que se va
pueden ser absorbidas por el
a determinar o alguna aleación del
elemento que se analiza debido a que
mismo y un ánodo de tungsteno.
poseen exactamente la energía
Ambos están encerrados en un tubo
necesaria (la longitud de onda
de vidrio que suele tener una ventana
adecuada) para producir transiciones
de cuarzo, porque con frecuencia las
electrónicas discretas. Con frecuencia
líneas de interés están en la región
la línea que se absorbe más
ultravioleta. El tubo se encuentra a
intensamente es la que corresponde
presión reducida relleno con un gas
a la transición electrónica más
inerte como argón o neón.
probable en general del estado
Entre los electrodos se aplica un alto fundamental al estado excitado más
voltaje que causa la ionización de los bajo. Ésta se denomina línea de
átomos del gas en el ánodo. Estos resonancia.
iones positivos son acelerados hacia
Las líneas de una lámpara de cátodo
el cátodo negativo, y cuando lo
hueco son más estrechas que las de
bombardean hace que algo del metal

21
absorción del elemento en la flama; a la volatilización selectiva
este ensanchamiento de la línea de (“destilación”) de uno de los
absorción es consecuencia de la elementos del cátodo, el cual se
mayor temperatura y presión de la condensa en las paredes de la
flama. De esta manera, se absorbe lámpara.
todo el ancho de la línea de la fuente.
2.Quemadores. El quemador qué se
La mayor especificidad también se usa en la mayor parte de los
debe a que, mientras en una fuente instrumentos comerciales es el
continua un elemento que tuviera una quemador con cámara de
línea de absorción en cualquier lugar premezcla, que a veces se llama
del ancho de la rendija absorbería quemador de flujo laminar. El
sólo parte de toda la radiación de esa combustible y los gases de soporte
fuente, las emisiones de una fuente se mezclan en una cámara antes de
de líneas no se absorberán a menos entrar a la cabeza del quemador (a
que las líneas de absorción del través de una rendija), donde se
elemento coincidan con ellas. Hay queman.
muy pocos casos en los que sí hay
La solución de la muestra se aspira a
traslape de líneas de diferentes
través de un capilar gracias a un
elementos
efecto Venturi creado con el gas de
A veces es posible usar una aleación soporte para la aspiración, que suele
de varios elementos para fabricar el ser aire. El aire crea un vacío parcial
cátodo hueco y con esas lámparas se al final del capilar y succiona la
emiten las líneas de todos los muestra por este. La muestra se
elementos; se trata de las divide y forma una aspersión fina en
denominadas lámparas la punta o proceso normal de
multielementos de cátodo hueco, y nebulización.
pueden usarse normalmente como
Las gotas más grandes del aerosol
fuente para dos o tres elementos.
que se produce se condensan y
Tienen menor vida útil que las
drenan de la cámara. Las restantes
lámparas de un solo elemento debido
se mezclan con los gases de

22
combustión y entran a la flama. Hasta muestran en la siguiente tabla, con
90% de las gotitas se condensan y sus temperaturas máximas de
salen, y sólo 10% entra a la flama. combustión:

En general los quemadores de

premezcla se limitan a flamas con
Las flamas que más se usan para
rapidez de quemado relativamente
absorción atómica son la flama de
baja. Aunque una gran parte de la
aire-acetileno y la de óxido nitroso-
muestra aspirada se pierde en la
acetileno. Esta última, de alta
cámara, la “eficencia de atomización”,
temperatura, no se requiere e incluso
qué es la eficencia de producción de
puede ser perjudicial para muchos
vapor atómico de la parte de la
casos en absorción atómica debido a
muestra que llega la flama, es alta
que causa la ionización de los átomos
porque las gotitas son más finas.
gaseosos. Sin embargo, es útil para
También la longitud de la trayectoria elementos que tienden a formar
es grande. La combustión con óxidos termoestables en la flama de
quemadores de premezcla es muy aire-acetileno (los “elementos
relajada. Una versión popular de los refractarios”).
quemadores de premezcla es el
La Flama de aire acetileno y de otros
quemador Boling. Se trata de un
hidrocarburos absorbe una gran
quemador de cabeza con 3 ranuras
fracción de la radiación a longitudes
que produce una flama más amplia y
de onda menores a 200 nm, y para
causa menor distorsión de la
esa región del espectro se prefiere
radiación cuando atraviesa las orillas
una flama de argón-hidrógeno con
de esta. Sin embargo, este quemador
admisión de aire para tener la
se deforma con mayor facilidad que
máxima capacidad de detección. Se
otros y se debe tener cuidado para no
trata de una flama incolora, y el gas
sobrecalentarlo.
oxidante real es el aire. Se usa para
3.Flamas. Las principales flamas que elementos como el arsénico
se usan en espectrometría de (193.5nm) y el selenio (197.0nm)
absorción y emisión atómica se cuando se separan de sus soluciones

23
por volatilización en forma de hidruros se prefiere una flama “fría” de aire-
(AsH3, H2Se, etc.) y van a la lama propano o similar debido a la menor
como tales. ionización de estos elementos.

Lo anterior es necesario porque esta 2.4.3.4 APLICACIONES.

flama fría es más propensa a tener
más interferencias químicas que otras  Se utiliza para analizar
flamas. Una flama de óxido nitroso- muestras de aleaciones: fierro
acetileno ofrece una ventaja en esta (Fe), plomo (Pb), níquel (Ni),
región del espectro cuándo existe el cromo (Cr), manganeso (Mn),
peligro de interferencia molecular; la cobalto (Co), antimonio (Sb),
absorción de la flama es etc.
relativamente pequeña a longitudes  Estimación de contaminantes
de onda corta. por oligoelementos.
 Determinación de composición
En espectrometría de emisión de
cárnica de embutidos y
flama se requiere una flama caliente
conservas.
para analizar una gran cantidad de
elementos, y por ello se recurre a la  Estudios de citotoxicidad de

de óxido nitroso-acetileno. La flama conservantes y aditivos.

de oxiacetileno tiene gran rapidez del  Análisis de elementos

quemado y no se puede usar con un químicos en vinos y aceites.

quemador de premezcla  Discriminación Ca/Sr en los

convencional. Sin embargo, la de mecanismos de absorción

óxido nitroso-acetileno si se puede intestinal.

usar con quemadores de premezcla.  Los efectos del plomo (Pb) en

biosíntesis del grupo Hemo.
Debido a sus altas temperaturas debe
 Elementos en el fluido
usarse una cabeza de quemador de
cerebroespinal (fisiopatología).
acero inoxidable especial y gruesa.
 Determinación de sustancias
En el caso de la espectrometría de
contaminantes a nivel de
emisión de flama de los elementos
trazas, en particular de
sodio y potasio, fácilmente excitables,
metales pesados.
24
  Análisis de muestras de suelo. correspondiente señal
 Análisis forense, presencia de eléctrica.
radicales, nitratos, nitritos,
plomo, cobre, antimonio, y A.Ionización de la muestra (Oriol,
bario provenientes de pólvora, 1998, 312-313): La ionización de la
muestra se consigue por bombardeo
proyectil y fulminante. mediante electrones (e-) según el
proceso:
2.4.4 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS M + e- à M+ + 2e-

2.4.4.1 DESCRIPCIÓN DE LA B.Aceleración de los iones por un

TÉCNICA.
Hoy en día, esta técnica continúa
teniendo los mismos fundamentos
que en su origen, aunque
espectrómetro de hoy en día poco
tenga que ver con su predecesor. La
espectrometría de masas
fundamenta en la separación de
partículas moleculares o atómicas por
su diferente masa. El proceso de la
espectrometría de masas comprende
básicamente cuatro etapas:
 Ionización de la muestra.
 Aceleración de los iones por
un campo eléctrico.
 Dispersión de los iones según
su masa/carga.
campo eléctrico (Oriol, 1998, 313):
Convertimos una fracción significativa
de los átomos formados en la etapa 1
en un flujo de iones, generalmente
el positivos y de carga única. La
velocidad que adquieren viene regida
por la fórmula:
se
v = [2eV/m] ½
Donde V es el potencial aplicado, “e”
la carga del electrón y “m” la masa.
Cuando las partículas aceleradas se
someten a la acción de un campo
magnético (H) describen una
trayectoria circular de radio r
alrededor de este campo,
desarrollando una fuerza centrífuga
mv2/r, la cual es igual a la fuerza de
atracción del campo Hev.
De esto deducimos que el radio es
igual a:

 Detección de los iones y r = (2Vm/H2e) ½

producción de la

25
C.Dispersión de los iones según su Básicamente un espectrómetro de
relación masa/carga (Oriol, 1998, masas costa esencialmente de las
315): Basándonos en la ecuación siguientes partes:
anterior podemos calcular la relación
1. Sistema de entrada de
m/e que es:
muestras.

m/e = H2.r2/2V 2. Cámara de ionización.

3. Acelerador.
Dado que la mayoría de los iones
4. Analizadores.
formados en la segunda etapa tienen
5. Detector.
una sola carga y que el resto de
parámetros se mantienen constantes, 1.Sistema de entrada de muestras.
la relación m/e suele ser la masa del En el sistema de entrada de
ión. muestras, un micromol o menos de
La utilidad analítica de un muestra se convierte al estado
espectrómetro de masas depende de gaseoso por calentamiento a unos
la resolución del instrumento, o 400ºC y se introduce lentamente en la
capacidad del mismo para separar cámara de ionización.
dos partículas de diferente masa. La finalidad del sistema de entrada es
permitir la introducción de una
D.Detección de los iones y
muestra representativa en la fuente
producción de la correspondiente
de iones con la mínima perdida de
señal eléctrica (Oriol, 1998, 317): El
vacío. En los espectrómetros de
ordenador al que está conectado el
masas más modernos encontramos
aparato recoge las distintas señales y
diferentes tipos de sistemas de
las reproduce en forma de
entrada:
espectrograma, formato de fácil
interpretación.  Sistemas indirectos de
entrada: es el sistema más
clásico y el más simple, en el
cual la muestra se volatiliza
externamente y se introduce
2.4.4.2 INSTRUMENTACION. en la región de ionización que
26
 está a baja presión. El sistema capilar que permiten la
de entrada es normalmente de separación y determinación de
vidrio para evitar posibles los componentes de mezclas
pérdidas por adsorción. complejas.
 Entrada por sonda
2.Cámara de ionización.
indirecta: los líquidos y los
sólidos no volátiles se pueden Las fuentes de iones de los

introducir en la región de espectrómetros de masas, tienen

ionización mediante un soporte todas unas características comunes,

para muestra o sonda, el cual pese a la variabilidad de tipos

se inserta a través de un cierre existente y es que todas transforman

de vacío. El sistema de cierre los componentes de una muestra en

se utiliza para controlar la iones.

cantidad de aire que entra En muchos casos el sistema de

después de la inserción de la entrada y la fuente de iones están
sonda en la región de combinados en un único componente.
ionización. Las sondas En todos los casos, se obtiene un haz
también se usan cuando la de iones positivos o negativos
cantidad de muestra es (normalmente positivos) que
limitada ya que se pierde posteriormente se acelera hacia el
mucha menos cantidad. interior del analizador de masas o
 Sistemas de entrada sistema separador a través del
cromatrográficos y de acelerador.
electroforesis capilar : es un
La formación de iones del analito es
tipo de sistema de entrada
el punto de arranque de arranque de
especial, está indicado su uso
un análisis por espectrometría de
cuando al espectrómetro de
masas. El aspecto de los espectros
masa va acoplado un sistema
de masas para distintas especies
de cromatografía de gases o
moleculares, depende en gran
de líquidos de alta eficacia o a
medida del método utilizado para la
columnas de electroforesis
formación de los iones. Estos
27
métodos los podemos dividir en dos masa. Además, los analizadores
categorías: deberían de permitir el paso del
número suficiente para producir
 Fuentes de fase gaseosa: en
corrientes iónicas fáciles de medir.
estas primero se volatiliza la
muestra y luego se ioniza. Al igual que sucede con los
 Fuentes de desorción: es estas monocromadores ópticos, a los que
la muestra en estado sólido o los analizadores son análogos, estas
líquido, se transforman dos propiedades no son compatibles
directamente en iones y se debe de llegar a un equilibrio que
gaseosos. está regido por la resolución del
espectrómetro de masa. Existen
3.Sistema acelerador.
diferentes tipos de analizadores de
En el sistema acelerador las masas:
partículas ionizadas producidas por el
 Analizadores de sector
impacto de los electrones son
magnético.
obligados a atravesar una primera
 Espectrómetros de doble
ranura aceleradora por una pequeña
enfoque.
diferencia de potencial. Entre esta
 Espectrómetro de masa
primera y una segunda ranura existe
cuadrupolar.
una diferencia de potencial muy
 Analizadores de masas de
elevada que imprime a las partículas
tiempo de vuelo (TOF).
su velocidad final. Una tercera ranura
 Analizadores de trampa de
actúa como colimador del haz de
iones.
partículas.
 Transformada de Fourier (FT)
4.Analizadores de masa.
5. Detectores.
Para la separación de iones con
diferente relación m/e se dispone de Los iones procedentes del sistema

varios dispositivos. Lo ideal es que el acelerador llegan al detector el cual

analizador fuera capaz de distinguir generalmente está constituido por un

entre diferencias muy pequeñas de cátodo emisor que al recibir el

28
impacto producido por las partículas  Determinación del peso
cargadas emite electrones. Estos molecular de péptidos,
electrones son acelerados hacia un proteínas y oligonucleicos.
dínodo el cual emite varios electrones  Determinación de secuencias
más al recibir el impacto de cada de aminoácidos en muestras
electrón. de polipéptidos y proteínas.

Este proceso se repite varias veces  Identificación de drogas de

hasta obtenerse una cascada de abuso y sus metabolitos en

electrones que llega al colector sangre, orina y saliva.

lográndose una corriente fuertemente  Monitoreo de gases en el

amplificada, por un procedimiento aliento de un paciente durante

muy similar al que se utiliza en los una cirugía.

tubos fotomultiplicadores. La corriente  Pruebas para confirmar la

obtenida puede amplificarse de nuevo presencia de drogas en sangre

por procedimientos electrónicos y se de caballos de carreras y en

lleva a un sistema registrador. atletas olímpicos.

 Calculo de la antigüedad de
2.4.4.3 APLICACIONES. piezas arqueológicas.
 Análisis de partículas de
Las aplicaciones son tan numerosas
aerosoles.
y abarcan tantos campos que resulta
 Determinación de residuos de
complicado citarlas todas, a
pesticidas en alimentos.
continuación veremos las más
 Control de compuestos
características:
orgánicos volátiles en
 Elucidación de la estructura de suministros de agua.
moléculas orgánicas y
biológicas.

29
PROTEINAS
Las proteínas son biomoléculas
formadas básicamente por carbono,
hidrógeno, oxígeno y nitrógeno.
Pueden además contener azufre y en
algunos tipos de proteínas, fósforo,
hierro, magnesio y cobre entre otros
elementos.
Por tanto, las proteínas son cadenas
de aminoácidos que se pliegan
adquiriendo una estructura
tridimensional que les permite llevar a
cabo miles de funciones. Las
proteínas están codificadas en el
material genético de cada organismo,
donde se especifica su secuencia de
aminoácidos, y luego son sintetizadas
por los ribosomas.
las proteínas desempeñan un papel
fundamental en los seres vivos y son
las biomoléculas más versátiles y
más diversas. Realizan una enorme
cantidad de funciones diferentes,
1
entre ellas funciones estructurales,
enzimáticas, transportadora.
Funciones y ejemplos de proteínas
Estructural
La función de resistencia o función
estructural de las proteínas también
es de gran importancia ya que las
proteínas forman tejidos de sostén y
relleno que confieren elasticidad y
resistencia a órganos y tejidos.
Ejemplo de ello es el colágeno del
tejido conjuntivo fibroso, reticulina y
elastina del tejido conjuntivo elástico.
Con este tipo de proteínas se forma
la estructura del organismo.
defensa
Las proteínas crean anticuerpos y
regulan factores contra agentes
extraños o infecciones. Toxinas
bacterianas, como venenos de
serpientes o la del botulismo son
proteínas generadas con funciones
defensivas.
transporte
Las proteínas realizan funciones de
transporte. Ejemplos de ello son la
hemoglobina y la mioglobina,
proteínas transportadoras del oxígeno
en la sangre en los organismos
vertebrados y en los músculos
respectivamente.
Enzimática
Las proteínas cuya función es
enzimática son las más
especializadas y numerosas. Actúan
como biocatalizadores acelerando las
reacciones químicas del
metabolismo.
Hormonal
Algunas hormonas son de naturaleza
proteica, como la insulina y el
glucagón que regulan los niveles de
glucosa en sangre
Reserva
Si fuera necesario, las proteínas
cumplen también una función
energética para el organismo
pudiendo aportar hasta 4 Kcal. de
energía por gramo. Ejemplos de la
función de reserva de las proteínas
son la lactoalbúmina de la leche o a
ovoalbúmina de la clara de huevo.
Reguladoras
Las proteínas tienen otras funciones
reguladoras puesto que de ellas
están formados los siguientes
compuestos: Hemoglobina, proteínas
1
plasmáticas, hormonas, jugos
digestivos, enzimas y vitaminas que
son causantes de las reacciones
químicas que suceden en el
organismo.
Cuantificación de proteínas.
• Para el estudio de la estructura
de una proteína, de la
actividad de una enzima o el
contenido proteico de un
alimento.
• Es necesario conocer
cuantitativamente la
concentración de las proteínas.
Cuantificación directa de
proteínas.
• Método de Bradford
Ensayo colorimétrico para la medición
de proteínas totales en una solución
dada.
La lectura se debe hacer en la
primera hora.
se emplea un colorante hidrofóbico
cuyas disoluciones acuosas en
presencia de ac. fosfórico tienen un
color pardo y que, al encontrarse en
el entorno hidrofóbico del interior de
una proteína, origina un color azul
intenso que se puede medir
fácilmente. Este método depende,
pues de la interacción relativamente
inespecífica entre un colorante
hidrofóbico y las proteínas.
METODO DE KJELDAHL
• Método más usado en la
actualidad
• PREPARACIÓN DE LA
MUESTRA (Ej. Carne)
• 1. Trituración y
homogenización
• 2. Pesar 1-5 g de la muestra
DIGESTIÓN
1. Añade 10-15 ml de Ácido Sulfúrico
96-98% y una Tableta (8mg) de
catalizador (Sulfato de cobre
pentahidratado)
2. Montar un sistema scrubber con
Carbonato de Sodio
DILUCIÓN
1.Sacar los tubos muestra del bloque
digestor y dejar enfriar a Tª ambiente.
2
2. Añadir unos 25ml de agua
destilada en cada tubo.
3. Para evitar pérdidas de nitrógeno y
reacciones violentas no introducir el
tubo todavía caliente al destilador.
DESTILACIÓN
1. Situar un Erlenmeyer de 250ml a
la salida del refrigerante con 50ml de
ácido Bórico y unas gotas de
indicador.
2. Programar una dosificación de 50
a 75 ml de NaOH.
3. Introducir el tubo con la muestra
en el destilador.
4. Destilar hasta recoger 250ml en el
Erlenmeyer (50ml Bórico + 200ml de
destilado).
Determinación total de
aminoácidos.
• Los aminoácidos son ácidos
carboxílicos que poseen un
grupo amino.
• Se clasifican en alfa, beta,
gama, etc, según la posición
del grupo amino
• Las proteínas son polipéptidos
naturales que contienen mas
de 50 unidades de
aminoácidos.
Aminoácidos en harinas
• Dejar a reflujo la muestra con
HCl 6N durante 24 horas.
Evaporar a sequedad en
evaporador rotatorio.
• Realizar el examen
cromatográfico de una solución
problema al 10% de la muestra
tratada en solución - acuosa
de isopropanol a 10%.
• Soporte papel Whatman nº1.
• Longitud del papel 50 cm.
LIPIDOS
INTRODUCCIÓN
La palabra lípido originalmente se
definía como ¨sustancia insoluble en
agua, pero soluble en disolventes
orgánicos como cloroformo, hexano y
éter de petróleo¨. Esa acepción
abarca las grasas, los aceites, los
terpenos, las vitaminas A, D, E y K y
pigmentos como los carotenoides.
En la actualidad se considera que los
lípidos forman un grupo muy amplio
de compuestos constituidos por
carbono, hidrogeno y oxigeno que
integran cadenas hidrocarbonadas
alifáticas o aromáticas, que también
contienen fosforo y nitrógeno. Así
pues, la concepción de lípidos implica
3
una gran variedad de sustancias que reacción de esterificación entre
se encuentran ampliamente el glicerol y una, dos o tres
distribuidas en la naturaleza y que moléculas de ácidos grasos en
cumplen diferentes funciones. las posiciones 1,2 y 3 del
Por ser los más abundantes, las glicerol. Su nomenclatura,
grasas y los aceites participan llamada numeración
directamente en la textura y estereoespecifica, se basa en
lubricación de los alimentos; otros que los sustituyentes de la
lípidos son pigmentos, hormonas o molécula se designan 1, 2 y 3,
vitaminas, algunos forman parte de y el 2 se representa a la
las membranas celulares y de los izquierda del plano de átomos
sistemas de transporte de de carbono.
nutrimentos, etc. o Fosfogliceridos o
fosfolípidos: Son
CLASIFICACIÓN:
diacilgliceridos cuyo glicerol
o Ácidos grasos: Están esta esterificado a una
constituidos exclusivamente molécula de ácido fosfórico
por triacilgliceridos, que, a su vez, se enlaza a una
comúnmente llamados basa nitrogenada, a la serina o
triglicéridos, que a su vez a un alcohol, como el inositol.
esteres de ácidos grasos con Por tener un átomo de carbono
glicerol, esos ácidos asimétrico son ópticamente
representan un gran activos, aunque la mayoría
porcentaje de la composición pertenece al enantiometro de
de los triacilgliceridos y en la serie a.
consecuencia de las grasas y o Ceras: Son esteres de un
aceites. Las grasas y los alcohol monohidroxilado en
aceites poseen diferencias de cadena larga con un ácido
estabilidad a la oxidación, de graso. Son muy resistentes al
plasticidad, de estado físico, hidrolisis, funcionan como
de patrón de cristalización, de agentes protectores en la
índice de yodo, de superficie de las hojas, los
temperaturas de solidificación tallos y los frutos, al igual que
y de fusión etc., que se deben en el pelo, la lana, las plumas
principalmente a sus ácidos de los animales y en los peces;
grasos. son sólidas con frio, pero
o Acilgliceridos: Son lípidos liquidas y moldeables en
simples, neutros o sin carga, caliente y su temperatura de
los más comunes en la fusión varia de 40 a 100C.
naturaleza, derivados de la Cubren la epidermis de las
frutas, regulan su
4
 transpiración, actúan como
barrera para gases
atmosféricos indeseables, son
repelentes al agua y las
protegen contra los insectos.
o Esteroides: Son sustancias
integradas por el grupo
perhidrociclopentanofanantren
o, una cadena hidrocarbonada
y un grupo alcohol y están
presentes tanto en el reino
vegetal como en el animal.
Reciben el nombre genérico de
fitoesteroles, entre los que
destaca el sitoesterol, seguido
del estigmasterol del
campesterol, del resvaterol y
de otros, en apariencia
funcionan de la misma manera
que el colesterol en el tejido
animal, es decir, estabilizan la
membrana y controlan su
permeabilidad.
ANALISIS FISICO Y QUIMICOS
En la producción de grasas y aceites
usados para fabricar mantecas,
aderezos, mayonesas, margarinas,
etc., se emplean los siguientes
análisis:
 Índices: EL más común es el
de acidez, que mide la
cantidad de ácidos grasos
libres de un aceite como
resultado de un hidrolisis de
los triacilgliceridos.
 Punto de fusión: Es la
temperatura a la que la fase
solida cambia a liquida, reflejo
de la fuerza de unión entre los
ácidos grasos de un cristal.
 Temperatura de formación
de humos o punto de
humeo: Es la temperatura la
que se le producen compuesto
de descomposición visibles,
que depende de los ácidos
grasos y de los mono y
diacilgliceridos libres de la
grasa.
 Prueba de frio: Sirve para
determinar la eficiencia de la
hibernación. El aceite se
mantiene a 0C y se mide el
tiempo que permanece
transparente; los
triacilgliceridos de alto punto
de fusión lo enturbian a bajas
temperaturas. Se considera de
buena calidad si el aceite se
conserva transparente durante
cinco horas y media para
usarse, por ejemplo, en
mayonesas.
 Plasticidad: El punto de fusión
mide la dureza de una grasa,
pero no su plasticidad o perfil
de solidos a distintas
temperaturas; las grasas son
semisólidos de triacilgliceridos
que forman una matriz
cristalina en la que queda
atrapado el aceite líquido,
como el agua en una esponja y
su plasticidad depende de su
relación solido/líquido a
diferentes temperaturas.
5
 Índice de solidos grasos
(ISG): Una grasa a -30C se
solidifica y a medida que se
calienta se induce la formación
de una mezcla de lípidos que
se encuentra en estado líquido
y solido en una relación que
depende de la temperatura.
Los componentes solidos se
dilatan de manera diferente a
como lo hacen los líquidos y la
máxima expansión de alcanza
cuando la grasa solida se
vuelve liquida.
 Resonancia Magnética
Nuclear: Se basa en la
absorción de ondas por parte
de los núcleos de moléculas
orgánicas, cuando estos se
ubican en un fuerte campo
magnético. La energía
administrada a los núcleos
cambia su orientación y las
señales generadas por el
hidrogeno en una grasa solida
son distintas a las producidas
por una grasa liquida, esta
diferencia se usa para medir el
porcentaje de grasa solida a
una determinada temperatura
y el resultado se reporta como
´´valores N´´