Biología Celular Molecular.

Escuela de Bioquímica
Universidad Austral de Chile.

Sesión Microscopia.
Sesión n° 2 de Practico BIOQ221.

Nombres: Daniel Gatica Rodriguez

Sebastián González Albacete
 1. Ensayo de Inmunofluorescencia realizado en sesión anterior de Practico.

En la sesión de practico anterior, se usaron 3 fluoroforos, los cuales son los

siguientes:
a. Alexa 488, la cual esta conjugada con un anticuerpo anti- IgG de ratón
(obtenido de cabra), permitiendo la visualización de los microtúbulos (el
anticuerpo primario esta dirigido contra la α-tubulina)
b. Alexa 647, conjugado a un anticuerpo anti- IgG de conejo (obtenido de
burro), que permite en términos generales del Aparato de Golgi (el
anticuerpo primario esta dirigido contra GM130, una proteína presente en
el aparato de Golgi).
c. Hoechst 3342 (Invitrogen), el cual se encuentra en la solución de montaje
y permite la visualización del núcleo.

Los espectros de excitación (o absorción) y de emisión de estos tres

fluoroforos se obtuvieron mediante SpectraViewer, tal como se observa en la
siguiente imagen:

Figura 1. Espectros de Excitación y Emisión.

Se observan los espectros de excitación y emisión de los fluoroforos Alexa 488, Alexa
647 y Hoechst 33342, obtenido por SpectraViewer.

Para poder visualizar la muestra, se escogieron las siguientes longitudes de onda

para el láser: 405 nm, 515 nm y 647 nm. Estas longitudes fueron escogidas de
acuerdo con las especificaciones del equipo (dadas en las instrucciones) y a la
aplicación SpectraViewer, tal como se observa en las siguientes imágenes.
Figura 2. Espectros de Absorción y emisión con las longitudes de onda del láser.
Se observan los espectros de emisión y absorción, con las longitudes de onda escogidas para
el láser: 405 nm, 515 nm y 647 nm. La imagen fue obtenida por SpectraViewer.

Los filtros fueron escogidos de acuerdo con las especificaciones del equipo
dadas en las instrucciones y al análisis de los espectros de emisión de los fluoróforos
realizado por SpectraViewer. Los rangos de longitudes de onda de los filtros son: 465-
495 nm, 535-565 nm y 655-755 nm. En la siguiente imagen se observa los espectros
de absorción y de emisión de los tres fluoroforos, con las longitudes de onda
escogidas para el láser y los filtros.

Figura 3. Espectros de Emisión y excitación, con longitudes de ondas de láser y

filtros.
En la siguiente imagen se observa los espectros de emisión y excitación, con las longitudes
de onda de para el laser y los filtros de emisión, para cada fluoroforo.

Con respecto a los espejos dicroicos, se escogieron los siguientes: 490 nm

para el primer espejo y 560 para el segundo. Estos fueron escogidos de acuerdo con
los espectros de absorción de los fluoróforos y de las especificaciones dadas en las
instrucciones sobre el equipo. En el siguiente esquema, se representa el sistema de
detección del equipo para este experimento.

Laser:
405 nm Espejo Dicroico:560 nm
515 nm. Pinhole Espejo Dicroico:490 nm
647 nm

465-495 535-565 655- 755 nm Filtros

nm nm
Fotomultiplicadores
PM1 PM2 PM3

Figura 8. Sistema de detección de microscopio confocal.

Se observa un esquema que representa el sistema de detección del microscopio
confocal, de acuerdo con las longitudes de onda para el láser, los filtros y los
espejos dicroicos escogidos, para este ensayo.

2. Ensayo de Inmunofluorescencia realizado para células Hela

Para este ensayo se usaron 3 fluoroforos, los cuales son los siguientes:
a. Alexa 647, conjugado a un anticuerpo anti- IgG de conejo (obtenido de
burro), que permite la visualización de calnexina.
b. Alexa 488, el cual esta conjugado a un anticuerpo anti-IgG de ratón
(obtenido de cabra), que permite la visualización de LAMPI.
c. DAPI, el cual está en el medio de montaje y permite visualizar el núcleo
celular.

Los espectros de excitación y de emisión de estos tres fluoroforos fueron

obtenidos gracias a la aplicación SpectraViewer.
 Figura 5. Espectros de Excitación y Emisión.
Se observan los espectros de excitación y emisión de los fluoroforos Alexa 488, Alexa
647 y DAPI, obtenido por SpectraViewer.

Para poder visualizar la muestra, se escogieron las siguientes longitudes de onda

para el láser: 405 nm, 515 nm y 647 nm. Las longitudes fueron escogidas por análisis
de los espectros de excitación por SpectraViewer, y por las especificaciones del
equipo (dadas en las instrucciones), tal como se observa en las siguientes imágenes.

A)

B)
 C)

Figura 6. Espectros de Absorción y emisión con las longitudes de onda del láser.
Se observan los espectros de emisión y absorción, con las longitudes de onda escogidas para
el láser: A) 515 nm, junto al espectro de emisión normalizado del fluoroforo Alexa 488. B) 647
nm, junto al espectro de emisión normalizado del fluoroforo Alexa 647 C) 405 nm, junto al
espectro de emisión normalizado del fluoroforo DAPI. Las imágenes fueron obtenidas por
SpectraViewer.

Los filtros fueron escogidos de acuerdo con las especificaciones del equipo
dadas en las instrucciones y al análisis de los espectros de emisión de los fluoróforos
realizado por SpectraViewer. Los rangos de longitudes de onda de los filtros son: 430-
470 nm, 535-565 nm y 655-755 nm. En la siguiente imagen se observa los espectros
de absorción y de emisión de los tres fluoroforos, con las longitudes de onda
escogidas para el láser y los filtros.
Figura 7. Espectros de Emisión y excitación, con longitudes de ondas de láser y
filtros.
En la siguiente imagen se observa los espectros de emisión y excitación, con las longitudes
de onda de para el láser y los filtros de emisión, para cada fluoroforo.

Con respecto a los espejos dicroicos, se escogieron los siguientes: 490 nm

para el primer espejo y 560 para el segundo. Estos fueron escogidos de acuerdo con
los espectros de absorción de los fluoroforos y de las especificaciones dadas en las
instrucciones sobre el equipo. En el siguiente esquema se visualiza el sistema de
detección para este ensayo.

Laser:
405 nm
Pinhole Espejo Dicroico:490 nm Espejo Dicroico:560 nm
515 nm.
647 nm

430-470 nm 655- 755 nm Filtros

535-565 nm

Fotomultiplicadores
PM1 PM2 PM3

Figura 8. Sistema de detección de microscopio confocal.

Se observa un esquema que representa el sistema de detección del microscopio
confocal, de acuerdo con las longitudes de onda para el láser, los filtros y los
espejos dicroicos escogidos, para este ensayo.
Con respecto al formato de escáner para ambos ensayos, e escogió que este
fuese secuencial y bidireccional. Esto debido a que, el escaneo secuencial
permite la obtención de imágenes completas en cada longitud de onda. Además,
permite utilizar el tiempo de exposición en función de las longitudes de onda,
optimizando la señal ruido, en situaciones donde la sensibilidad varía en el rango
espectral (). Con respecto, al escaneo bidireccional, este trascurre en menor
tiempo, y se evita la problemática de la foto blanqueamiento, el cual conllevaría a
la inutilización de la imagen obtenida. Con respecto al número de pixeles por
cuadro, se escogió que sea 512x512, de acuerdo con los datos encontrados del
equipo.

Referencias.
Levenson, R. M., & Mansfield, J. R. (2006). Multispectral imaging in biology and
medicine: slices of life. Cytometry part A, 69(8), 748-758.