UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUIA Nº 7

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE GLUCÓGENO

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

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OBJETIVOS

1. Extraer del tejido hepático o muscular el carbohidrato de reserva más importante en los mamíferos y
otros organismos.
2. Aplicar la hidrólisis del glucógeno como técnica in Vitro para obtener glucosa.
3. Cuantificar por el método de Antrona el glucógeno extraído de diferentes muestras biológicas y una
muestra problema.
4. Determinar el porcentaje de glucógeno presente en tejido hepático y muscular para diferentes
muestras biológicas.
5. Establecer que defectos enzimáticos producen valores aumentados o disminuidos de Glucógeno.

PREPARACIÓN PREVIA

1. Repase el proceso de la glucogenólisis y glucogénesis.

2. Lea el fundamento y el procedimiento de la practica.

INTRODUCCIÓN

El glucógeno es un homopolisacárido y fue aislado del hígado por primera vez por Claude Bernard en 1856.
Se ha encontrado en bacterias, algas, levaduras y también existe en animales inferiores como las ostras y
mejillones dándoles a estos alimentos una mayor consistencia y valor gastronómico.

El glucógeno es la reserva esencial de glucosa en los animales superiores; se sintetiza en todos los tejidos
animales, pero en mayor proporción en el citoplasma del hepatocito y miocito por la acción de dos enzimas la
glicógeno sintasa y la glucosil α (46) transferasa sobre un precursor de glucógeno (conformado por 8
residuos de glucosa) que esta unido a una proteína llamada glucogenina. La glicógeno sintasa permite la
unión secuencial de unidades de α D-glucosa provenientes de la UDP glucosa mediante enlaces lineales α
(1 4) y la glucosil α (46) transferasa forma puntos de ramificación por la transferencia de 7 residuos de
una rama interna hacia otra posición en la misma cadena o hacia otra cadena de glucógeno generando la
unión de dos residuos de glucosa con enlace α (1 6), esto hace que la estructura presente un aspecto
arborescente como la amilopectina. Las ramificaciones le dan al glucógeno un carácter compacto
permitiéndole ocupar una menor cantidad de espacio, como también permiten una alta solubilidad e
incremento de los extremos no reductores [1].

El peso molecular del glucógeno varía según su origen; es del orden de 1 a 5 x106, el hígado resulta de la
condensación de 30.000 unidades de glucosa. Su estructura molecular le confiere propiedades que se pueden
utilizar para aislarlo eficientemente, purificarlo y cuantificarlo mediante técnicas específicas.

PRINCIPIO
Para el análisis cuantitativo del glucógeno; el tejido es sometido a hidrólisis ácida con HCl para liberar
moléculas de glucógeno. El rompimiento del tejido también libera proteínas y otras sustancias que son
precipitadas por el ácido tricloroacético y el proceso de centrifugación. Las unidades de glucógeno liberadas
1
por el proceso de hidrólisis son solubles en el sobrenadante y son precipitadas al incubar éste con etanol en
frío. El glucógeno recuperado es hidrolizado para producir unidades de glucosa que en presencia de ácido
sulfúrico se deshidratan para producir furfurales que reaccionan con la Antrona generando un aumento de la
absorbancia que se lee a 625 nm contra una curva de calibración construida con estándares de glucógeno de
8 mg % -2 mg %.

MATERIAL DE PRUEBA

Hígado y músculo frescos (Estudiantes)

Ostras crudas. (Estudiantes)

PROCEDIMIENTO

PRIMERA PARTE EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO POR HIDRÓLISIS ACIDA:

1. Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos falcon de 15 ml y pese dos de estos con ayuda de un beaker o
espuma según sea el caso y guárdelos para el paso 10. Registre su peso en Tabla 1 análisis
cuantitativo Anexo 7.
2. Con ayuda de guantes y un bisturí corte un fragmento de la parte interna del tejido, asegurándose de
no tomar adipositos ni membranas.
3. Pese en balanza analítica entre 0.5- 1 g de tejido o una cuarta parte del tejido disponible y registre el
valor en la Tabla 1 análisis cuantitativo Anexo 7.
4. Homogenice en un mortero cada tejido con 0.5 g de arena lavada autoclavada mas 1 ml de ácido
clorhídrico 6 N hasta obtener una pasta de consistencia suave. Tenga cuidado de no esparcir el
tejido por todo el mortero, porque perderá tejido y por lo tanto analito.
5. Agregue 1 ml de solución salina fisiológica 0.85 % p/v.
6. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y transfiera la mayor parte del tejido macerado a un tubo de
15 ml.
7. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y recupere la mayor parte del tejido remanente que queda en
el mortero y la mano.
8. Equilibre y centrifugue por 6 minutos a 4.000 r.p.m.
9. Tome el sobrenadante con ayuda de una micropipeta y pase a los tubos de 15 ml que pesó y rotuló
en el numeral 1.
10. Agregue 2 ml de etanol absoluto y deje en nevera 12 horas a 4° C, compruebe que queden bien
tapados cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colóquelos en una gradilla, si no los va a
procesar al día siguiente guárdelos a -20 °C hasta su uso.

PRIMERA PARTE EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO POR HIDRÓLISIS BASICA:

1. Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos de 1.5 ml (dos para músculo y dos para hígado), pese dos de
estos con ayuda de una espuma y guárdelos para el paso 5. Registre su peso en Tabla 2 análisis
cuantitativo Anexo 7.
2. Corte un fragmento de la parte interna del tejido con ayuda de guantes y un bisturí, asegurándose de
no tomar adipositos ni membranas para los diferentes tejidos y pese para cada uno entre 10- 60 mg en
la balanza analítica sobre un papel aluminio. Registre el valor que tomó en la Tabla 2 del Anexo 7.

2
 3. Ponga cada uno de los tejidos en el tubo correspondiente que no peso, agregue 50 mg de arena
lavada autoclavada mas 60 μl de KOH 6 N y homogenice el tejido con ayuda de una varilla de
vidrio de punta roma hasta obtener una pasta de consistencia suave.
4. Agregue 600 µl de H2O fría, homogenice mediante agitación por vortex y centrifugue a 10.000
r.p.m por 2 min.
5. Recupere cada sobrenadante a los tubos que peso en el numeral 1 y adicione 200 µl de etanol al
80%. Asegúrese que estén bien tapados, cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colóquelos
en una gradilla, si no los va a procesar al día siguiente guárdelos a -20 °C hasta su uso.

SEGUNDA PARTE CUANTIFICACIÓN DE GLUCÓGENO :

1. Programe el baño de María hasta que alcance la temperatura de ebullición.

2. Centrifugue los tubos de 15 ml y 1.5 ml a 4000 r.p.m por 5 min a 4 ° C, si hay lípidos elimine la
capa de grasa con ayuda de una micropipeta y vuelva a centrifugar. Asegúrese de que el pellet este
fuertemente unido para no perderlo.
3. Descarte el sobrenadante por inversión rápida del tubo y coloque sobre el tubo invertido una tolla
secante para eliminar la mayor cantidad de etanol posible.
4. Deje que cada muestra se evapore totalmente a temperatura ambiente en cámara de flujo laminar ó
con corriente de aire y establezca el peso del pellet recuperado (glucógeno), determine el factor de
dilución aproximado que debe aplicar para que las muestras entren en la curva de calibración (0.02
mg/ml-0.08 mg/ml), exprese el peso en mg /mL.
5. Resuspenda el precipitado en agua destilada mediante agitación por vortex y evite que queden
grumos sin disolver, si el peso obtenido es húmedo divida por 3 ó aplique la siguiente relación
verificando que su calculo entra en la curva de calibración, por ejemplo:
a. mg de Hígado /1-5 ml H2O
b. mg de Músculo / 0.5 -1 ml H2O
6. Tenga en cuenta la capacidad del baño de María antes de iniciar el procedimiento.
7. Encendida la cabina de extracción y dentro de ésta procese los estándares y las muestras de acuerdo
a los volumenes indicados en Tabla 1 (para los espectrofotómetros análogo y digital). Trabaje la
mitad del volumen para los colorímetros y el espectrofotómetro Perkin Elmer.
8. Realice el procedimiento en una secuencia rápida, tape la parte superior de cada tubo con papel
parafilm o vinilpel y ábrale un pequeño orificio con un lápiz a cada uno. Esto se realiza para puedan
salir los vapores del ácido y de impedir que en el proceso de incubación dentro del baño de María
entren gotas de agua caliente producto de la condensación del vapor agua sobre el ácido y así
evitar accidentes.

Tabla 1. Metodología para cuantificación de glucógeno.

Patrones Glucógeno Muestras

Reactivo Blanco 1 2 3 Músculo Músculo Hígado
2 mg/dl 4 mg/dl 8 mg/dl 1/5 1/25 1/200
Agua 0,6 ml 0.45 ml 0.3 ml
Patrón de 0.15 ml 0.3ml 0,6 ml - - -
glucógeno 8
mg/ dL
Muestra H 0,6 ml
Muestra M - - - 0,6 ml 0,6 ml
Antrona 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml
3
 9. Incube en un baño de María en ebullición durante 10 minutos exactos.
10. Pare la reacción sumergiendo la base de los tubos en agua fría y lea contra el blanco de reactivos a
625 nm.
11. Descarte los residuos en el colector correspondiente, teniendo precaución de voltear la cara para
evitar accidentes en sus ojos y rostro.

CALCULOS

1. Calcule los mg de glucógeno recuperado por los dos métodos de acuerdo a los datos que proceso en
su Tabla 1 Anexo 7.
2. Registre los valores de la curva de calibración en la Tabla 2 Anexo 7 y estime los valores de
intercepto, pendiente, coeficiente de correlación y la concentración de glucógeno en las muestras
analizadas.

Tabla 2. Datos de la curva calibración de glucógeno y valores de glucógeno en muestras problema por
el método de la antrona.

Volumen
Glucógeno Concentración
Grupo Resuspendido Fd mg/dL Abs
mg mg/dL
ml
Blanco reactivos − − − −
1 Estándar − − − 2.5
2 Estándar − − − 5
3 Estándar − − − 10
4 Hígado
5 Musculo
6 Hígado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf
a
b
r

3. Exponga el resultado en porcentaje de glucógeno por peso de tejido húmedo o seco según sea el caso.

INVESTIGACIÓN PARA SU ARTÍCULO

1. ¿Qué otras moléculas precipitan con TCA al 10%?

2. ¿De qué esta conformado el pellet que se descartó?
3. ¿Por qué el etanol precipita el glucógeno?
4. ¿Cuáles métodos colorimétricos se pueden utilizar para cuantificar el glucógeno?
5. ¿Qué diferencia(s) hay en la síntesis de glucógeno para plantas (amiloplastos) y bacterias?
6. ¿Cuál es el método mas avanzado para cuantificar glucógeno?
7. ¿Cuál es la composición y el mecanismo de acción del lugol para producir colores característicos
con: el glucógeno, la amilosa, la amilopectina, la celulosa y el almidón? Elabore una tabla
comparativa.

4
RESULTADOS

1. Describa las diferencias y semejanzas entre el almidón y el glucógeno mediante estructuras.

2. Determine que reacciones que se llevaron a cabo en la práctica.
3. Procese la Tabla 1- 2 del Anexo 7 para músculo e hígado y calcule el porcentaje de glucógeno
hepático y muscular observado.
4. Anexe la curva de calibración e interpole las muestras analizadas, adjunte la Tabla 2 del Anexo 7
con la corrección por mínimos cuadrados (valores de coeficiente de correlación, pendiente e
intercepto), factores de dilución que aplicó a sus muestras y despeje la concentración de estas de los
datos obtenidos por corrección de mínimos cuadrados.
5. Determine el porcentaje de error de glucógeno en las diferentes muestras del valor obtenido al
despejar su concentración en mg/dL de los datos obtenidos por mínimos cuadrados teniendo en
cuenta que el porcentaje de glucógeno esperado en humanos para hígado es de 6% y para músculo
1-2%.
6. Discuta que ocurre a nivel metabólico con la cantidad de glucógeno hallado en las diferentes
muestras biológicas analizadas.
7. Determine con los análisis cuantitativos si la muestra problema analizada es normal o hay un defecto
enzimático, de ser así discuta a que problema(s) metabólico(s) podría corresponder y soporte sus
hallazgos con un artículo.
8. Elabore una tabla que resuma las enfermedades que se originan por defectos en glucogénesis y
glucogenólisis, esta debe describir la enzima deficiente; el tejido (hígado / músculo); características
de la enfermedad; estructura del glucógeno normal, similar a almidón, amilopectina, dextrina,
dextrina límite etc; concentración de glucógeno normal, aumentada, disminuida etc y tratamiento.

BIBLIOGRAFÍA

1. NELSON, D. L., & COX, M. M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry. New York: Worth
Publishers 736-739.

BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTA

1. ALEMANY, M. Y FONT, S. Prácticas de Bioquímica. España: Alambra, 1983.

2. PLUMMER, R.D. Bioquímica Práctica. México: Mc Graw-Hill Latinoamérica, 1981.
3. RENDINA, G. Técnicas de Bioquímica Aplicada: México Interamericana, 1974.
4. WILBRAHAM, A.C. Y MATTA, M. S. Introducción a la Química Orgánica y Biológica. México:
Addison-Wesley. Iberoamericana, 1989.
5. WHITE, A. Y HANDLER, R. Principios de Bioquímica. Bogotá: Mc Graw-Hill, 1982.

5
 ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificación de Glucógeno
Tabla 1 Glucógeno recuperado por hidrólisis ácida, básica y sin hidrólisis
Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo
Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Musculo Musculo Musculo Musculo Musculo
Grupo Peso mg tubo Peso mg tubo 15 Peso mg glucógeno mg glucógeno % Error Peso mg tubo 15 Peso mg tubo 15 ml Peso mg mg glucógeno % Error
15 ml vacio ml con observado esperados ml vacio con glucógeno glucógeno esperados
glucógeno observados
1
2
3
4
5
6
7
8
Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo
Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Musculo Musculo Musculo Musculo Musculo
Grupo Peso mg tubo Peso mg tubo Peso mg glucógeno mg glucógeno % Error Peso mg tubo 1.5 Peso mg tubo 1.5 ml Peso mg mg glucógeno % Error
1.5 ml vacio 1.5 ml con observado esperados ml vacio con glucógeno glucógeno esperados
glucógeno observado
1
2
3
4
5
6
7
8

6
 ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificación de Glucógeno
Tabla 2. Datos de la curva calibración de glucógeno y valores de glucógeno en muestras problema por el método de la antrona.
Volumen
Glucógeno Concentración Glucógeno Volumen Concentración
Grupo 1 Resuspendido Fd mg/dL Abs Grupo 2 Fd mg/dL Abs
mg mg/dL mg Resuspendido ml mg/dL
ml
Blanco reactivos − − − − Blanco reactivos − − − −
1 Estándar − − − 2.5 1 Estándar − − − 2.5
2 Estándar − − − 5 2 Estándar − − − 5
3 Estándar − − − 10 3 Estándar − − − 10
4 Hígado 4 Hígado
5 Musculo 5 Musculo
6 Hígado Eppendorf 6 Hígado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf 7 Musculo Eppendorf
a a
b b
r r
Volumen
Glucógeno Concentración Glucógeno Volumen Concentración
Grupo 3 Resuspendido Fd mg/dL Abs Grupo 4 Fd mg/dL Abs
mg mg/dL mg Resuspendido ml mg/dL
ml
Blanco reactivos − − − − Blanco reactivos − − − −
1 Estándar − − − 2.5 1 Estándar − − − 2.5
2 Estándar − − − 5 2 Estándar − − − 5
3 Estándar − − − 10 3 Estándar − − − 10
4 Hígado 4 Hígado
5 Musculo 5 Musculo
6 Hígado Eppendorf 6 Hígado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf 7 Musculo Eppendorf
a a
b b
r r
Volumen
Glucógeno Concentración Glucógeno Volumen Concentración
Grupo 5 Resuspendido Fd mg/dL Abs Grupo 6 Fd mg/dL Abs
mg mg/dL mg Resuspendido ml mg/dL
ml
Blanco reactivos − − − − Blanco reactivos − − − −
1 Estándar − − − 2.5 1 Estándar − − − 2.5
2 Estándar − − − 5 2 Estándar − − − 5
3 Estándar − − − 10 3 Estándar − − − 10
4 Hígado 4 Hígado
5 Musculo 5 Musculo
6 Hígado Eppendorf 6 Hígado Eppendorf
7 Musculo Eppendorf 7 Musculo Eppendorf
a a
b b
r r

7
 Peso tejido Hígado y Musculo Esquelético

Cuantitativo H Cuantitativo M Cuantitativo H Cuantitativo M

Grupo Cualitativo H Cualitativo M
Hidrólisis Ácida Hidrólisis Ácida Hidrólisis Básica Hidrólisis Básica

1
2
3
4
5
6
7
8
9