Determinación de a movilidad bacteriana.

Introducción.

La determinación de la movilidad bacteriana es uno de los parámetros que se

utilizan en la identificación de las bacterias. Esta capacidad usualmente se debe a
la presencia de flagelos; sin embargo, algunas bacterias no flageladas son
capaces de moverse a lo largo de las superficies solidas por deslizamiento
asociado a fibras polares muy largas, también, algunas bacterias acuáticas (las
cianobacterias) pueden regular su posición y moverse mediante vesículas de gas.
En cualquier caso, la movilidad capacita a la célula bacteriana para alcanzar
diferentes regiones en su microambiente, lo que representa una ventaja, pero ese
desplazamiento tiene un costo energético.

Para evaluar la movilidad bacteriana en el laboratorio es necesario proveer

condiciones que favorezcan; los medios más adecuados son líquidos o
semisólidos, con suficiente fuente de energía.

El movimiento usual debido a la presencia de flagelos, se puede determinar con el

movimiento browniano, que es un movimiento vibratorio, originado por choques
de moléculas del líquido contra las bacterias, que provoca vibraciones sin
desplazamiento. (Evel Rodriguez, 2005)

Marco Teórico.

Movilidad en cultivo

La determinación de la movilidad en medios semisólidos es utilizada cuando no se

dispone del cultivo joven en medio liquido o cuando se sospecha que la bacteria a
examinar es patógena, debido a que el riesgo para el operador cuando se inocula
la bacteria es un medio semisólido, además es un método seguro para determinar
movilidad, pues permite a las bacterias de cultivo viejos que pudieran haber
perdido sus flagelos, se renueven y los manifiesten durante su crecimiento,
presenta una desventaja, es necesario esperar el periodo de incubación para
obtener resultados

La inoculación se hace con la aguja bacteriológica, al introducirla y sacarla en

línea recta en 2 tercios del medio, de manera que el fondo de tubo quede inocular
y sirva como control de turbiedad. Esto se conoce como “inoculación por
picadura”. Si las bacterias no son móviles lograran desplazarse a partir de esta
línea, enturbiando el medio de cultivo, sin que sea muy aparente la línea de
inoculación. Si las bacterias son móviles y no son fermentadoras, el crecimiento se
concentrara en la superficie del medio. (Evel Rodriguez, 2005)

Staphylococcus aureus.

es un microorganismo que se encuentra ampliamente diseminado en el ambiente

ya que posee características particulares de virulencia y resistencia contra
antibióticos, lo cual representa un grave problema de salud, esto es, gracias a que
su distribución se extiende a nivel mundial y el impacto en la morbimortalidad es
considerable a nivel comunitario e intrahospitalario. En los humanos, causa una
amplia variedad de enfermedades infecciosas y su principal impacto es
ocasionado por las cepas de S. aureus, que son sumamente resistentes a la
meticilina (MRSA) y otros antibióticos que antes eran eficaces contra el
tratamiento de las infecciones. Desde el punto de vista genómico, la resistencia se
produce por selección natural a través de mutaciones producidas al azar; sin
embargo, también se pueden inducir artificialmente mediante la aplicación de una
presión selectiva a una población, como sería el abuso o la utilización de
antibióticos; asimismo, S. aureus tiene características genéticas que le han
permitido convertirse en una de las bacterias más importantes en la clínica y en
las enfermedades transmitidas por alimentos. Se mencionan también algunas
características principales para el aislamiento y el estudio del patógeno, utilizando
procedimientos microbiológicos (Harris LG y col., 2002).

Staphylococcus aureus es importante no solo porque ocasiona infecciones en

diversas partes del organismo humano, sino porque es una de las principales
bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Tales
enfermedades son causadas por diversas acciones, incluyendo la capacidad del
patógeno de producir toxinas, siendo esto relativamente común en determinados
sectores de la población y en algunas regiones geográficas desfavorecidas por la
falta de sistemas de salud y de control de infecciones adecuados. (Tibavizco D y
col., 2007)

Análisis microbiológico

Para la identificación de S. aureus es necesario utilizar algunas pruebas

bioquímicas y medios de cultivo especiales que permitan su fácil determinación.
Esta identificación se basa en las enzimas y las toxinas que produce el
microorganismo. Aprovechando estas características se han diseñado medios
para aislar esta bacteria, que son Baird-Parker, agar salado manitol, agar
estafilococos N° 110, agar DNAsa.
Agar Baird-Parker

Es un medio excelente para el recuento de Staphylococcus aureus, incluso,

aunque se trate de células que sufrieron un daño subletal. Además, es el medio
moderadamente selectivo más corrientemente usado. Su composición consta de
piruvato sódico el cual ayuda a recuperar las bacterias lesionadas; su poder
selectivo se debe a la presencia de telurito, cloruro de litio y glicina. En el medio,
Vol. 25, No. 3, septiembre-diciembre de 2014 la característica positiva de la
presencia de Staphylococcus aureus es la presencia de un aspecto negro, debido
a la reducción del telurito, con un halo transparente que revela la actividad
lipolítica sobre la yema de huevo; sin embargo, las colonias deben confirmarse
mediante un examen de frotis teñido con coloración de Gram (Fernández-Escartín
E., 2000).

Agar Salado Manitol

Se emplea para el aislamiento selectivo de Staphylococcus aureus. El agar sal

manitol contiene una concentración de cloruro sódico de 7.5%, el cual es el agente
activo del medio e inhibe parcial o completamente a los organismos bacterianos
diferentes de los estafilococos. Los estafilococos coagulasa (+) (Staphylococcus
aureus) producen colonias de color amarillo y un medio circundante de color
amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen
colonias de color rojo y no provocan cambios en el color del indicador rojo fenol
(Chapman GH., 2000).

Agar estafilococos N° 110

Es un medio selectivo para aislar estafilococos patógenos a partir de muestras

clínicas y no clínicas, basado en la fermentación de manitol, la formación de
pigmento y la actividad gelatinasa. Este medio también se utiliza para el
aislamiento de estafilococos que contaminan una amplia variedad de alimentos y
producen una intoxicación alimentaria. Los estafilococos coagulasa (+) patógenos
crecen en altas concentraciones de NaCl y forman colonias amarillas y doradas.
Por otra parte, la fermentación de manitol se detecta por medio de la adición de
unas gotas de azul de bromotimol a la placa, buscando las colonias con un halo
amarillento alrededor. Los estafilococos licúan la gelatina produciendo zonas
claras alrededor de las colonias. Para esta prueba, se le agrega a la caja Petri 5
ml de una solución saturada de sulfato de amonio o adicionando una gota de ácido
sulfosalicílico al 20% e incubando 12 minutos para observar la hidrólisis de la
gelatina. Una zona clara-transparente alrededor de la colonia constituye una
hidrólisis (+) (Stone’s reaction) (Chapman GH., 2000).
Agar DNAsa

Es utilizado para identificar estafilococos potencialmente patógenos; manifiesta la

actividad de la desoxirribonucleasa, la cual es indicadora de su patogenicidad.
Asimismo, se investiga la capacidad del microorganismo de producir enzimas que
hidrolicen el ADN. La aparición de halos transparentes alrededor del área de
crecimiento se considera resultado positivo, ya que estas corresponden a zonas
de hidrólisis del ADN. La prueba es considerada negativa en caso de que los halos
característicos no estén presentes (Silva-García MC y col., 2006).

Catalasa

Se utiliza para probar la capacidad del microorganismo para producir la enzima

catalasa, la cual facilita la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno, siendo de utilidad para evitar la formación de radicales tóxicos por el
sistema de la mieloperoxidasa en las células fagocíticas. La prueba es positiva
cuando la bacteria reacciona produciendo la liberación de burbujas, que es la
característica dada por la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno (Núñez-Martínez JP, 2007).

Coagulasa

Esta prueba se emplea para determinar y diferenciar especies dentro del género
Staphylococcus, así como para probar la existencia de Staphylococcus aureus.
Dicho microorganismo tiene la capacidad de coagular dicha enzima. La coagulasa
es un factor de agregación y constituye una prueba muy sensible y específica para
esta bacteria. Esta proteínarepresenta un importante factor de virulencia. La
coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual
tiende a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse. La prueba
puede hacerse de dos maneras: en portaobjeto, en la cual la solución se ha
tratado previamente con ácido etilendinitrilo tetraacético (EDTA) y plasma de
conejo. Por otra parte, la prueba se puede realizar en tubo, para lo cual se
inoculan 0.5 ml de una dilución de plasma de conejo con la colonia sospechosa
(Núñez-Martínez JP, 2007).

Perfil bioquímico para el aislamiento y la caracterización de Staphylococcus

aureus.

Para el estudio del patógeno es necesario hacer una serie de comparaciones que
permitan identificar concretamente la presencia de la bacteria en la muestra que
se analiza, ya sea de procedencia clínica o de alimentos.
Salmonella typhi

El estudio de los mecanismos por los cuales una bacteria como Salmonella typhi
puede causar la fiebre tifoidea en el humano, implica comprender cómo este
patógeno invade las células, se multiplica y evade la respuesta inmune en el
hospedante y, a su vez, cómo el humano responde a esta infección.. Todo ello, no
sólo provee información básica sobre procesos biológicos fundamentales a nivel
molecular y celular, sino que puede aportar herramientas para el diseño de
mejores métodos de diagnóstico y prevención de esta y otras enfermedades de
origen bacteriano (Romero C, Raúl, 2007).

Salmonella y su taxonomía

Las salmonellas son bacterias gram-negativas, lo cual significa que no se tiñen de

azul con el colorante aplicado en la prueba diseñada por Gram. Esto se debe a
que dicho colorante tiñe la pared celular, que en estos casos está cubierta por una
membrana externa. Es así que estas bacterias están envueltas por varias capas:
la membrana externa, la pared celular (que es diez veces más delgada que en las
bacterias gram-positivas), y la membrana interna. La membrana externa e interna
delimitan al periplasma. La apariencia de las bacterias en el microscopio es de
bacilos, o cilindros con puntas redondeadas. El género Salmonella fue descrito a
principios del siglo XX por el bacteriólogo estadounidense Theobald Smith,
recibiendo el nombre por su jefe David Salmon. Las salmonellas son bacterias
entéricas, o sea que se alojan en el intestino, y su taxonomía es compleja.
Actualmente, el género Salmonella consiste de una sola especie, que ha sido
denominada Salmonella enterica. Ésta, a su vez, está formada por siete
subespecies, dependiendo de su capacidad para realizar diferentes reacciones
bioquímicas. Esta subdivisión ha sido apoyada por varios método de hibridación
ADN/ADN y métodos serológicos. Cada subespecie, a su vez, está subdividida en
serotipos o serovares, de acuerdo al tipo de antígeno H u O. El antígeno H está
conformado por la proteína más abundante del flagelo, que es la estructura que
permite el movimiento. El antígeno O está conformado por una cadena repetida de
polisacáridos, que forma parte del lipopolisacárido (LPS), que se genera y
sobresale de la membrana externa y que actúa como una barrera de protección a
agentes externos. Es así que se han descrito más de 2,375 serovares de
Salmonella, que finalmente pertenecen al mismo género en base a su gran
identidad en el genoma, de 90% o más (Romero C, Raúl, 2007).
Salmonellosis

El género Salmonella es el agente causal de diferentes infecciones intestinales,

conocidas como salmonellosis. La salmonellosis humana puede dividirse en dos
síndromes.

1) La fiebre entérica, que incluye la fiebre tifoidea causada por S. typhi, y la fiebre
paratifoidea que es patológica y clínicamente similar a la tifoidea pero con
síntomas menos fuertes, causada por S. paratyphi A, B, o C. La fiebre entérica
implica una infección sistémica, debido a la invasividad de la bacteria.

2) La gastroenteritis o envenenamiento por alimentos, la cual es la más común de

las infecciones, causada por muchos serotipos. Este tipo de infecciones no es
acompañada de una infección sistémica. Los serotipos más comunes en la
salmonellosis no-tifoidéica son S. typhimurium y S. enteritidis.

Puede también ocurrir una invasión sistémica sin gastroenteritis, sobre todo en
individuos inmunocomprometidos, como en el caso de las infecciones intra-
hospitalarias. Asimismo, sobre todo para la fiebre tifoidea, puede establecerse la
condición de portador asintomático (Dr. Venzmer, 1967).

Salmonella typhi

La S. typhi es una bacteria anaeróbica facultativa, que puede en ocasiones

sobrevivir en bajas condiciones de oxígeno. Pertenece al serotipo 9,12, en base a
los epítopes de la tivelosa, el azúcar repetida en su antígeno O. El antígeno
flagelar "d" es el más preponderante, aunque algunas cepas de Indonesia poseen
otro antígeno denominado "z"; lo que significa que expresan un flagelo muy
diferente en secuencia de aminoácidos al encontrado en las cepas de otras
regiones del mundo. Además de los antígenos O y H, tiene en su exterior una
cápsula de polisacáridos denominada Vi (por antígeno de "virulencia"). Estos
bacilos no producen esporas. La mayoría de las cepas son móviles debido a que
poseen flagelos peritricos, que rodean a la célula. Interesantemente, existen cepas
no móviles en Indonesia, en donde la incidencia de la fiebre tifoidea es más alta.
La S. typhi produce ácido a partir de glucosa, maltosa y sorbitol, sin la producción
de gas; pero no fermenta la lactosa, sacarosa, la ramnosa y otros azúcares.
Produce nitrito a partir de nitrato y también produce ácido sulfhídrico. Su
temperatura óptima de crecimiento es de 37oC.(Romero C, Raúl, 2007).
Epidemiología

S. typhi causa la fiebre tifoidea en humanos, quienes son sus únicos hospedantes.
Esto abre importantes preguntas sobre qué genes determinan dicha especificidad,
las cuales se podrán abordar en vista de los recientes proyectos de secuenciación
del genoma de diferentes serotipos, incluyendo la S. typhi CT18 (con resistencia
múltiple a antibióticos proveniente de Vietnam); la S. typhimurium, que se postula
reproduce el mecanismo de la infección humana en el ratón; o la S. gallinarum que
produce una fiebre enterica en las gallinas. La fiebre tifoidea prevalece
principalmente en países en vías de desarrollo, donde normalmente significa un
reto a las autoridades en salud pública. Hay aproximadamente 17 millones de
casos anuales con casi 600,000 muertes, principalmente en Asia y África. Las más
altas incidencias se encuentran en Indonesia y en algunos puntos del sureste
asiático, como Papua Nueva Guinea, en donde puede alcanzar niveles de 103 por
cada 100,000 habitantes. En otros lugares en Asia la incidencia es menor.
Interesantemente, la mayoría de los casos en las regiones de mayor incidencia, se
encuentran en niños en edad escolar de 13 a 19 años de edad. En México, la
incidencia es cien veces menor a la de Indonesia, o sea de 10 por cada 100,000
habitantes. De hecho, de 1989 a 1993, la incidencia disminuyó a la mitad,
coincidiendo con las campañas del sector salud para la prevención del cólera. El
grupo etario más afectado es el de adultos jóvenes, de 19 a 44 años de edad.
Ciertamente, las diferencias en incidencia y en grupos de edad afectados son
problemas de interés para la epidemiología, cuya resolución involucra la mejor
comprensión de los modos de transmisión y sobrevivencia de la bacteria en el
ambiente, el conocimiento más profundo de la respuesta inmunológica del
hospedante y de las posibles variaciones genéticas entre los aislados clínicos de
S. typhi (Dr. Venzmer, 1967).

Manifestaciones clínicas

El período de incubación para S. typhi abarca de una semana a un mes, siendo

principalmente de dos semanas, a partir de la ingesta de la bacteria proveniente
de alimentos o agua contaminada. Se presume que S. typhi invade a través de las
células M del intestino, las cuales forman parte del tejido linfoide o inmunológico.
Sin embargo, debido a que no se han podido cultivar las células M en el
laboratorio, los experimentos de invasividad de Salmonella se han realizado con
células epiteliales y macrófagos, los cuales, además, constituyen otros eslabones
en el proceso de invasión.No siempre ocurre la diarrea, pero generalmente hay
ulceración. S. typhi se multiplica en el epitelio de la submucosa, después de lo
cual entra el torrente circulatorio y se disemina por el cuerpo. La multiplicación
ocurre otra vez en el bazo y en el hígado, para que después la bacteria sea
liberada en grandes cantidades al torrente sanguíneo. Esta septicemia o invasión
generalizada puede confirmarse por el cultivo de la bacteria de la sangre, lo cual
refleja una bacteremia. Este estadio de la infección, que puede durar 2 a 3
semanas, se caracteriza por una tos seca, fiebre alta, e intenso dolor de cabeza.
La fiebre puede ser cíclica, es decir, la temperatura puede incrementarse por las
tardes, acompañada de escalofríos, convulsiones y delirio. De hecho, el nombre
de la enfermedad proviene del griego typhus, o "neblina o humo", que
probablemente se usó para describir enfermedades febriles que causan
alteraciones mentales.Desenlaces fatales por tifoidea ocurren primordialmente por
la ruptura de bazo, ocurriendo un choque séptico ocasionado por el LPS, que
estimula la liberación de agentes mediadores de la respuesta inmune como las
citocinas. Alternativamente, el 10% de los individuos afectados pueden desarrollar
el síndrome de portador sano, excretando continuamente las bacterias del bazo.
La hepatitis por S. typhi ha sido documentada. Sin embargo, no se cuenta con
información suficiente para describir en detalle los nichos de sobrevivencia y
multiplicación de la bacteria en el humano, excepto que se considera que invade
células epiteliales del intestino y, además, se han aislado macrófagos
hospedantes de la bacteria. Por otro lado, estudios de la patogénesis (o de los
mecanismos para generar enfermedad) de S. typhimurium en ratones, ha
conducido a la postulación de la sobrevivencia y multiplicación en ambientes
extracelulares. Preguntas fascinantes en este sentido y otras relacionadas a qué
factores del hospedante o de la bacteria determinan el cuadro clínico, esperan una
respuesta(Dr. Venzmer, 1967).

Diagnóstico, tratamiento y prevención

El diagnóstico de una infección por S. typhi se realiza a través del aislamiento de

la bacteria de sangre, heces, orina, aspirado de médula ósea y bilis. Estas
pruebas tardan dos a tres días en aportar los resultados, pues la muestra se diluye
en un medio de cultivo y, dado que se estima que un paciente con fiebre tifoidea
presenta, por ejemplo, 20 bacterias o menos por ml de sangre, se requiere esperar
a que se multiplique lo suficiente para ser observada por turbidez del medio. El
cultivo de la sangre es el método más frecuentemente usado para un diagnóstico
preciso, aunque su sensibilidad no es más del 90%, incluso cuando se toman tres
muestras consecutivas. El cultivo de aspirado de médula ósea es más sensible,
pero el procedimiento de extracción del aspirado es delicado y doloroso. Pruebas
bioquímicas y serológicas se realizan para confirmar el diagnóstico. El
serodiagnóstico de la infección por S. typhi, usando el ensayo de aglutinación de
Widal (reacciones febriles), se basa en la detección de anticuerpos en el suero de
los pacientes a los antígenos O (LPS), H (flagelar) y el Vi (antígeno capsular). La
limitante de este método es que pobladores sanos de áreas endémicas (en donde
la enfermedad es prevalente), presentan títulos (concentraciones) altos de
anticuerpos, dificultándose en ocasiones la distinción entre individuos afectados y
sanos. Varios otros inmunoensayos en el formato de ELISA, también se han
utilizado para la detección de antígenos o anticuerpos específicos en suero.
Asimismo, métodos moleculares como la hibridación con ARN ribosomal, con el
gen del antígeno Vi, o con la secuencia de inserción IS200, han sido usados. La
limitante principal con estos métodos es que requieren de una infraestructura
sofisticada de laboratorio y personal altamente especializado, además de que
pueden tomar de varias horas a varios días. Es así que métodos de detección más
rápidos, precisos y sencillos, son en extremo necesarios para ésta y otras
bacteremias. Ciertamente, la mejor caracterización de antígenos para pruebas
inmunológicas, o de genes de virulencia (que determinan la severidad y las
características de la enfermedad) para pruebas por amplificación específica de
material genético, como la reacción en cadena de la polimerasa o PCR por las
siglas en inglés, serán claves para avanzar en este rubro de impacto en salud
pública. La fiebre tifoidea se trata con antibióticos. Los regímenes típicos incluyen
amoxicilina, cotrimoxazol y cloranfenicol. Sin embargo, desafortunadamente, la
emergencia de cepas con resistencia múltiple a antibióticos se está convirtiendo
en un problema global serio. Algunas de las regiones donde estas cepas
resistentes se han multiplicado incluyen el subcontinente Indio, Vietnam,
Latinoamérica, y Egipto. A pesar de estas cepas resistentes, el cloranfenicol sigue
siendo el antibiótico de elección, por su capacidad de infiltración en los tejidos. Las
cefalosporinas y quinolonas de tercera generación, constituyen alternativas
interesantes. Las vacunas principales contra la fiebre tifoidea son la oral Ty21a y
la parenteral del polisacárido Vi. Ambas proveen una protección hasta del 65-70%,
con una inmunidad de 3 a 7 años. Es interesante que la Ty21a es una cepa
atenuada por mutagénesis química, por lo que tiene múltiples mutaciones, de las
cuales se desconoce las que determinan la atenuación. Ciertamente, una mejor
comprensión de los mecanismos básicos, a nivel molecular y celular, de la
interacción bacteria-hospedante, permitirá la generación de cepas atenuadas en
los genes clave, para obtener el balance apropiado entre la capacidad de generar
una respuesta inmune y la atenuación que evite una infección virulenta. De la
misma manera, la mejor caracterización de antígenos relevantes durante la fiebre
tifoidea, deberá permitir el diseño de mejores vacunas parenterales (Romero C,
Raúl, 2007).

Taxonomía molecular

Se ha utilizado la electroforesis multilocus de enzimas para caracterizar diferentes

cepas bacterianas, incluyendo las de S. typhi. En este método se separan por
electroforesis los componentes de un extracto celular, bajo condiciones que
permiten el ensayo de la actividad de una batería de enzimas. Así, la actividad de
veinte o más enzimas se asocia a la banda de la proteína respectiva, que migra en
el gel de acuerdo a su carga y tamaño. Las variaciones en el genoma de la
bacteria pueden reflejarse en alteraciones en la migración de alguna o más
enzimas (que representan varios loci o genes), por lo que pueden obtenerse
electroferotipos, o patrones de migración específicos que permiten distinguir una
cepa de otra. De esta manera, se ha concluido que S. typhi es de naturaleza
clonal, es decir que ha variado poco en la evolución, al menos con respecto a una
serie de enzimas básicas de su metabolismo. Otras bacterias muestran más
variación, incluyendo otros serotipos de Salmonella. Otra manera de clasificar a
las bacterias es por electroforesis en geles pulsados. En este método, se digiere el
genoma de la bacteria con una enzima de restricción que corta poco frecuente, es
decir, que produce fragmentos grandes de ADN (mayores a 20 kb o 20,000 pares
de bases). Estos fragmentos se separan por electroforesis en gel bajo un campo
eléctrico pulsado, lo que hace que el ADN tome diferentes orientaciones alternas
durante la migración. Interesantemente, esta metodología mostró que el
cromosoma de S. typhi es mucho más variable de lo que se pensaba bajo el
concepto de cepas clonales, habiéndose identificado patrones de migración
electroforética comunes para cepas correlacionadas geográficamente. También se
observó que el cromosoma fluctúa en tamaño entre 3.96 y 4.92 Mb, o millones de
pares de bases, es decir, alrededor del 20% . Sin embargo, hasta la fecha, no se
ha podido correlacionar estos tamaños con un fenotipo en particular: dicho de otra
forma, la S. typhi se comporta de manera clonal en cuanto a su especificidad de
hospedante y virulencia. Sin embargo, recientemente, se han descrito casos
severos de tifoidea en Papua Nueva Guinea, pero no se ha determinado todavía si
la bacteria posee características particulares. De nueva cuenta, hay preguntas
interesantes por resolver en cuanto a la relación entre el tamaño y la plasticidad
del genoma y la habilidad de la bacteria para sobrevivir en diferentes ambientes y
causar enfermedad. El análisis de plásmidos o moléculas circulares de ADN con
replicación autónoma al cromosoma, que se transfieren de manera horizontal
entre bacterias, y que codifican para resistencia a antibióticos o factores de
virulencia, ha revelado que la gran mayoría de las cepas de S. typhi carecen de
ellos. Solamente las cepas con resistencia múltiple a antibióticos las poseen, y
éstas han aparecido esporádicamente aunque su presencia se ha incrementado
en los últimos años. Otros serotipos de Salmonella poseen plásmidos con
frecuencia variable, aunque también hay plásmidos que son específicos de cada
serovar. De esta manera, no hay un método general de tipificación de Salmonella
por perfil de plásmidos. Las huellas genéticas de las bacterias, y de las
salmonellas en particular, se han generado por la hibridación de fragmentos de
ADN con sondas de regiones o genes repetidos en el genoma, marcadas
radioactivamente. Los fragmentos de ADN se obtienen por el corte con enzimas
de restricción, se separan por electroforesis a través de un gel y se transfieren a
un papel filtro. De esta manera, se producen columnas con bandas de diferentes
tamaños (o posición en la columna) que distinguen a una cepa en particular; en un
formato similar a una barra de identificación en los productos del supermercado.
Para este propósito se han utilizado genes ribosomales, de los cuales hay siete
copias, o de la secuencia de inserción IS200, de la cual hay convenientemente
más de quince copias en el genoma de S. typhi, aunque otros serotipos tienen un
número menor de copias. De manera similar, se han utilizado genes no repetidos
para tipificar cepas de Salmonella sp. y S. typhi, los cuales han incluido genes del
flagelo (fli), de invasividad (inv), del antígeno capsular (via), del LPS (rfb), de
antígenos de superficie (omp), de proteínas de estrés (groEL), o de islas de
patogenicidad (SPI-1 y SPI-2). De hecho, estos estudios y la caracterización de la
secuencia nucleotídica de éstos y otros genes, ha permitido determinar que las
salmonellas pertenecen a un solo género, S. enterica, por su alto grado de
conservación genética (Bravo Perez y col., 2007).

Organización del genomas

El genoma de S. typhi CT18 está constituido por un cromosoma circular de

4,809,036 pb, con un contenido de G+C de 52.09 %, más dos plásmidos: el
pHCM1 de 218,160 pb, que codifica para resistencia múltiple a antibióticos, y
pHCM2 de 106,516 pb, que es críptico o de función desconocida. Al igual que E.
coli, contiene más de cuatro mil genes. S. typhi constituye una excepción a la
conservación del orden cromosómico, porque presenta rearreglos mayores
observados entre diferentes aislados clínicos. Existen inversiones y
transposiciones de grandes segmentos, posiblemente promovidos por
recombinación homóloga entre genes ribosomales (rrn), y no se observan
pérdidas, inserciones, o duplicaciones de regiones cromosómicas. El significado
biológico de estas particularidades en el genoma de S. typhi permanece un
misterio y, ciertamente, será el tema de futuras investigaciones. En general,
parece haber menor conservación del orden cromosómico en cepas de Salmonella
que infectan hospedantes específicos. Por ejemplo, el orden de los fragmentos
grandes obtenidos con la enzima I-CeuI, y analizados por electroforesis de
campos pulsados, es de ABCDEFG en S. typhimurium LT2, E. coli K-12, y en
especies de Salmonella que crecen en diferentes hospedantes. Sin embargo, en
S. typhi, S. paratyphi C, S. gallinarum, y S. pullorum, las cuales son hospedante-
específicas (la última también para aves), estos fragmentos están rearreglados.
Otras variantes entre los genomas de las salmonellas incluyen la presencia o
ausencia de diferentes islas de patogenicidad y de operones para fimbrias
(descritos en las siguientes secciones). Asimismo, recientemente, se ha reforzado
el concepto de la transferencia horizontal de genes de patogenia a través de fagos
temperados, o virus bacterianos que pueden alojarse en el cromosoma de la
bacteria, acarreando genes pasajeros de diferentes partes del genoma de otra
bacteria (Bravo Perez y col., 2007).

Pseudomonas

Son bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos. La mayoría son móviles
por un flagelo polar o por un mechón formado por dos o tres flagelos. Casi todas
las especies poseen fimbrias y pilis. Algunas especies forman una delgada
microcápsula compuesta por los azúcares. Su metabolismo es oxidativo de tipo
respiratorio, y son aerobios estrictos. Algunas cepas producen pigmentos. Casi
todas crecen en agar MacConkey con colonias lactosa negativa y algunas
especies pueden desarrollarse a 4°C, pero la mayoría son mesofilícas. Puede
instalarse en cualquier órgano o tejido, invadir el oído externo y colonizar las vías
urinarias, los pulmones, el endocardio, la córnea y los huesos. De una infección
localizada en alguno de esos tejidos, puede diseminarse por el torrente
circulatorio, producir septicemias de alta gravedad e instalarse en otros tejidos.
(Romero, 1999)

Escherichia coli

La bacteria Escherichia coli fue inicialmente aislada y descrita por el pediatra

alemán Escherich en 1885, quien demostró su existencia como huésped habitual
del intestino. La denominó Bacterium coli commune, que puede traducirse como
“bacteria común del colon”. Escherichia coli se caracteriza por poseer bacilos
Gram negativos, no esporulante, producción de indol a partir de triptófano, no
utilización de citrato como fuente de carbono y no producción de acetoína.
Además, fermenta la glucosa y la lactosa con producción de gas.

Como todas las bacteria Gram (-), la cubierta de Escherichia coli consta de tres
elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un
espacio periplásmico constituido por péptidoglucano. Esta última estructura
confiere a la bacteria su forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas
ambientales relativamente elevadas.

Escherichia coli es una bacteria mesófila, su óptimo de desarrollo se encuentra en

el entorno de la temperatura corporal de los animales de sangre caliente (35-43
ºC). La temperatura límite de crecimiento se sitúa alrededor de 7 ºC, lo que indica
que un control eficaz de la cadena de frío en las industrias alimentarias es esencial
para evitar el crecimiento de Escherichia coli en los alimentos. La congelación
tiene pocos efectos sobre la población de Escherichia coli en el alimento, y no
garantiza la destrucción de un número suficiente de bacterias viables para
asegurar su inocuidad. Sin embargo, Escherichia coli es sensible a temperaturas
superiores a 70 ºC, a partir de la cual son fácilmente eliminadas; por ello, es muy
importante la pasteurización de alimentos como la leche, zumos, etc., para
garantizar su eliminación. (Rodríguez et. al. 2009)

Objetivos

Objetivo general

El alumno observará algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología bacteriana, a la

vez aprenderá su utilización para la identificación de enterobacteria, para saber si es móvil e
inmóvil

Metodología

Material.

Cultivo de 18 a 24 hrs para Staphylococcus aerus en caldo

Cultivo de 18 a 24 hrs E. coli

Cultivo de 18 a 24 hrs Pseudomonas

Cultivo de 18 a 24 hrs Salmonella

Tubos de ensaye con rosca

Gradilla

Jeringas de 3 ml (aguja bacteriológica)

1. Con la aguja bacteriológica, inocular por picadura como se indicó antes,

cada cepa en un tubo de agar movilidad. Incubar los tubos a 37°C por 24
horas.
 Figura.1 tubo con aguja bactereologica.

2. Transcurrido el tiempo de incubación, observar los tubos inoculados y

compararlos. Si la prueba de movilidad es positiva se observara migración
de las bacterias a partir de la línea del inoculo, lo que se manifiesta como
turbiedad en el medio o concentración del crecimiento en la superficie. Si la
movilidad es negativa las bacterias crecerán a lo largo de la línea de
inoculación y el resto del tubo permanecerá sin turbiedad.

Resultados esperados.
Resultados obtenidos

Bacteria Produccion de Movilidad Nombre del

H2S alumno quien
Pseudomona negativo movil Sadra M.Gonzalez
aeruginosa
Salmonella typhy Positive movil Sofia Fiscal, Laura
Fiscal, Diana
Gutierrez
E.coli negativo movil Edith Santos
Stafilococus positivo inmovil ----------
aureus

Fig.2 Salmonella typhy S.F.F Fig.3 Salmonella typhy L.F.F

Fig.3. Salmonella typhy D.G.S

Fig.5 E.coli E.S.A Fig. 6 Pseudomona aeruginosa S.G.S

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