Cuantificación rápida de proteínas de la leche bovina que emplean proteínas externas

espectroscopía láser en cascada de cuántica cavidad

Palabras clave:
Cavidad externa-láser de cascada cuántica (EC-QCL), Proteina total, Caseína, β-lactoglobulin,
Análisis de leche bovina, Quimiometría

El análisis de las proteínas en la leche bovina suele abordarse mediante enfoques analíticos que
requieren mucho tiempo procedimientos químicos de limpieza de muestras en varios pasos. El
uso de láser de cascada cuántica externa (EC-QCL) la espectroscopía IR basada se evaluó como
una herramienta de detección alternativa para la cuantificación directa y simultánea de proteínas
individuales (es decir, caseína y β-lactoglobulina) y contenido total de proteínas en la leche bovina
comercial muestras. Los espectros Mid-IR de las mezclas estándar de proteínas se usaron para
construir mínimos cuadrados parciales (PLS) gression modelos. Un conjunto de muestra que
comprende diferentes tipos de leche (pasteurizada, estante extendido procesado de manera
diferente vida, ESL; temperatura ultra alta, UHT) y se compararon los resultados con los métodos
de referencia. Los valores de concentración del enfoque de espectroscopía QCL-IR obtenidos en
varios minutos están en buen estado acuerdo con métodos de referencia que implican múltiples
pasos de preparación de muestras. La posible aplicación como una se demuestra un método de
detección rápida para estimar la carga de calor aplicada a la leche líquida.

1. Introducción
La leche es considerada uno de los alimentos más completos nutricionalmente disponible con un
volumen de producción registrado de 700 × 10 6 toneladas por año, de los cuales alrededor del
84% son bovinos ( O'Mahony & Fox, 2014 ). Es compuesto principalmente de agua, lípidos,
lactosa y proteínas, y su cantidades variables varían ampliamente entre especies, por ejemplo, el
rango porcentual de las proteínas van de 10 a 200gL -1 , con un contenido de proteína total de ~32
g L -1 para la leche bovina. Las proteínas caseína (Cas) representan aproximadamente el 80% del
contenido total de proteína en la leche bovina, y la el 20% restante pertenece a las proteínas del
suero ( Haug, Høstmark, & Harstad, 2007 ). Las dos proteínas más prominentes y abundantes en
la leche son caseína y β-lactoglobulina (β-LG) con concentraciones de ~ 25 g L -1 (fracción de
caseína completa) y ~3.8 g L -1 ( Fox, Uniacke-Lowe, McSweeney, y O'Mahony, 2015 ). El
consumo de leche y productos lácteos es recomendado por la mayoría de sociedades tritionales
porque proporcionan una combinación de nutrientes clave como calcio, potasio y proteína (
Rozenberg et al., 2016 ) los tres tipos de leche comercializados más extendidos son
leche pasteurizada, leche de larga duración (ESL) y leche ultra alta la leche de temperatura (UHT),
sometida a diferentes tratamientos térmicos sulting en la vida útil variable y se acompañan de
sabor y nu degradación del planeta ( Hougaard, Vestergaard, Varming, Bredie, & Ipsen, 2011 )
La leche pasteurizada recibe el tratamiento térmico más suave (p. Ej. 15 s a 72 ° C) y se puede
almacenar durante 10 días en almacenamiento en frío. A diferencia de, La leche UHT se puede
almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses después de ser sometido a calentamiento a una
temperatura de al menos 135 ° C por no menos de 1s ( Rysstad y Kolstad, 2006 ), que pueden
introducir una percepción Gusto "cocinado". La leche ESL ha ganado una amplia aceptación
recientemente como proporciona un tiempo de almacenamiento más prolongado que la leche
pasteurizada (21-24 días bajo condiciones frías), manteniendo calidad fresca y no cocida sabor (
Schmidt, Kaufmann, Kulozik, Scherer y Wenning, 2012 ) Los métodos actualmente empleados
para producir leche de ESL son la microfiltración, tratamiento térmico directo (HTST - corto
tiempo de alta temperatura) mediante inyección o infusión (por ejemplo, 127 ° C durante 2-3 s),
o en muchos casos también calor indirecto tratamiento (por ejemplo, 125 ° C durante 2 s) ( Rysstad
& Kolstad, 2006 ) Se sabe que el procesamiento intensivo del calor induce organolépticos y nu-
cambios tritionales Análisis de especies específicas que se ven afectadas por el calor
tratamiento (formación o degradación) permite la evaluación cuantitativa de el impacto de la carga de calor sin el
conocimiento de la térmica anterior historia ( Claeys, Smout, Van Loey y Hendrickx, 2004 ). Desnaturalización de β-LG
comienza a aprox. 60 ° C, por lo que esta proteína se ha propuesto como indicador de tratamiento a baja temperatura
y la concentración restante de se puede emplear β-LG soluble en ácido no desnaturalizado para distinguir entre leche
pasteurizada y UHT ( Boitz, Fiechter, Seifried, y Mayer, 2015 ). La Federación Internacional de Lechería (IDF) propuso
un mínimo β-LG contenido de 2.6gL -1 para leche pasteurizada, de 2.0gL -1 para alto-pas- leche teurizada, y de 0.05 g
L -1 para leche UHT ( Mayer, Raba, Meier, & Schmid, 2010 ). Para leche ESL líquida, los límites de umbral actualmente
no son obligatorio, a diferencia de la leche pasteurizada / UHT. La técnica analítica de referencia para la determinación
del total el contenido de proteína en la leche sigue siendo el método histórico de Kjeldahl para terminación de
nitrógeno orgánico en alimentos y bebidas, a pesar de ser una rutina química húmeda bastante laboriosa con bajo
rendimiento ( Ribadeau-Dumas & Grappin, 1989) ) Para la cuantificación de individuos proteínas lácteas incluyendo
Cas y β-LG, varios métodos basados en chro- matográficos ( Bordin, Cordeiro Raposo, de la Calle, y Rodríguez, 2001;
Mayer et al., 2010; Strange, Malin, Van Hekken, y Basch, 1992 ) y electroforético ( Strange et al., 1992) ) se informaron
acercamientos, que todavía implica pasos de preparación de muestras químicas húmedas que requieren mucho
tiempo. La aplicación de la espectroscopia de infrarrojo medio (IR) se ha adoptado para análisis rápido y no destructivo
de la calidad y composición de productos lácteos debido a su capacidad de alto rendimiento, bajo costo y simplicidad
( Aernouts, Polshin, Saeys, y Lammertyn, 2011; Etzion, Linker, Cogan, y Shmulevich, 2004; Mazurek, Szostak, Czaja, y
Zachwieja, 2015 ). Además, una técnica basada en espectroscopía IR tiene aceptado por la Asociación de Químicos
Analíticos Oficiales (AOAC) Internacional) para el análisis de leche líquida, que condujo al desarrollo de varios
analizadores de leche FTIR disponibles comercialmente para determinación del contenido total de proteína y caseína,
entre otros parámetros ( Kaylegian, Lynch, Houghton, Fleming y Barbano, 2006 ). La espectroscopía Mid-IR detecta las
vibraciones fundamentales de las sustancias covalentes enlaces en las moléculas y proporciona información cualitativa
y cuantitativa formación de los constituyentes que absorben la radiación IR media. Para la estructura análisis de
proteínas, la amida I (1600-1700 cm) -1 ) y amida II (1500-1600 cm -1 ) las bandas son las más utilizadas. La banda de
amida I ha demostrado ser particularmente sensible a la proteína secundaria estructura ( Barth, 2007 ) La
espectroscopía IR ha sido intensamente utilizada para el análisis de diferentes parámetros en la leche ( Gondim,
Junqueira, de Souza, Ruisanchez y Callao, 2017; Jaiswal, Jha, Kaur, y Borah, 2017; Justino, Rocha-Santos y Duarte, 2010
), y en particular para la proteína análisis en leche. Para el análisis cuantitativo del contenido de proteína total, la
mayoría comúnmente, la banda de amida II se emplea a una longitud de camino de ~ 50 μm para mediciones de
transmisión, generalmente en combinación con calibración variable ( Aernouts et al., 2011; Etzion et al., 2004; Luinge,
Hop, Lutz, Vanhemert y Dejong, 1993; Moore, DeVries, Lipp, Griffiths, & Abernethy, 2010 ) Discriminación entre
proteínas basada en sec- la estructura secundaria se realiza preferentemente evaluando la amida I banda. Sin
embargo, el desarrollo de aplicaciones basadas en FTIR en 1600-1700 cm -1 región espectral es problemática debido
a la baja emisión energía de las fuentes de luz térmica en el espectro FTIR convencional metros y la fuerte absorbancia
de H 2 O centrada en 1645 cm -1 . Estafa- en consecuencia, las longitudes de camino adecuadas están restringidas a
<10 μm, para evitar absorción total de IR en esta región, lo que compromete los niveles de sensibilidad necesario para
el estudio de concentraciones biológicamente relevantes y considerablemente menoscabar la robustez de la
aplicación. Como alternativa a la espectroscopia FTIR convencional, configuraciones personalizadas basadas en los
láseres en cascada cuánticos han ganado numerosas aplicaciones en mediados de IR espectroscopia ( Schwaighofer,
Brandstetter y Lendl, 2017 ) Ha sido demostrado que al emplear un láser de cascada cuántica externo de cavidad (EC-
QCL) fuente de luz con intensidades de emisión significativamente más altas, la trayectoria óptica se puede aumentar
a 38 μm para mediciones IR medias en soluciones acuosas que cubren la región espectral de amida I ( Alcaráz et al.,
2015 ). Las mediciones de transmisión IR basadas en EC-QCL
logrado con éxito para el análisis de estructuras secundarias de proteínas tura ( Alcaráz, Schwaighofer, Goicoechea, y
Lendl, 2016; Schwaighofer, Alcaraz, Araman, Goicoechea y Lendl, 2016 ). Más recientemente, el fea sibilidad de
discriminación y cuantificación de proteínas en muestras de leche de vid se han demostrado por espectroscopía QCL-
IR y evaluación de la banda de amida I utilizando modelos de mínimos cuadrados parciales (PLS) elling ( Kuligowski et
al., 2017) ) El objetivo de este trabajo es validar la cuantificación rápida y directa de proteína individual (es decir,
caseína y β-LG) y proteína total de leche bovina contenido que utiliza una configuración EC-QCL mediante el análisis
de un conjunto de muestras que comprende diferentes tipos de leche y comparación con un método ference La leche
bovina comercial ha sido elegida como subproducto objeto de nuestra investigación, ya que plantea un alimento
importante con consumo y alto valor nutricional. Porque varios tratamientos térmicos cambios en el contenido de
ciertos nutrientes clave (por ejemplo, vitaminas, amino ácidos), la diferenciación rápida entre tipos de leche
procesados de manera diferente es de crucial importancia para el control de calidad de la leche de consumo comercial.
La posible aplicación del método presentado como una detección rápida método para estimar la carga de calor
aplicada a la leche líquida comercial muestras se demuestra. 2. Materiales y métodos 2.1. Estándares y reactivos Etanol
(96% v / v, EtOH), hidróxido sódico acuoso (NaOH) so- lution (50%), ácido clorhídrico 37% (HCl) reactivo ACS, α-lactosa
monohidrato (≥99%, α-Lac), polvo liofilizado de β-LG (≥90%) y La sal de cas sodio, ambas de leche bovina, se obtuvieron
de Sigma- Aldrich (Steinheim, Alemania). Dihidrato monobásico de fosfato de sodio pa (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) se adquirió
de Fluka (Buchs, Suiza). Una purificación de agua Milli-Q de Merck Millipore (Darmstadt, Alemania) sistema fue
utilizado para generar agua ultrapura. Disolventes usados para el análisis cromatográfico fue de calidad HPLC. Dieciséis
homogeneizados, muestras comerciales de leche bovina (cuatro marcas diferentes de pasteurizado, Filtrado de ESL,
tipo de ESL HTST y UHT cada uno) se obtuvieron de tiendas de comestibles. 2.2. Preparación de soluciones Soluciones
madre individuales de Cas y β-LG a concentraciones de 40 y 30 g L -1 , respectivamente, se prepararon por pesada
directa del cantidad correspondiente de polvo de proteína liofilizada en un volumen de 5 mL matraz métrico y se
disuelve con 45 mmol L -1 tampón de fosfato a pH 6.6. Se prepararon diez soluciones estándar que contenían mezclas
de proteínas por dilución de las soluciones madre correspondientes en 45 mmol L -1 fosfato tampón de Phate a pH
6,6, alcanzando concentraciones que oscilan entre 0 y 30 g L -1 para Cas, y 0 y 15gL -1 para β-LG. Conde de proteína
total las concentraciones resultaron de la suma de las concentraciones de proteínas individuales y varió entre 19 y 36
g L -1 ( Kuligowski et al., 2017 ). Se preparó una solución de α-Lac a una concentración de 48 g L -1 por pesar y disolver
la cantidad apropiada de α-Lac mono- hidratar en 45 mmol L -1 tampón de fosfato a pH 6,6
2.3. Configuración EC-QCL Una descripción detallada de la configuración EC-QCL personalizada puede ser encontrado
en otra parte ( Alcaráz et al., 2015 ). En pocas palabras, la configuración está equipada con un EC-QCL de Daylight
Solutions Inc. (San Diego, EE. UU.) con un rango de ajuste espectral de 1729.30 a 1565.06 cm -1 , una temperatura-
celda de flujo controlada de 38 μm de longitud de camino con ventanas de CaF 2 y detector de telururo de cadmio de
mercurio enfriado de manera eléctrica (-60 ° C) (MCT-7-TE3; D * = 4 × 10 9 cm Hz 0.5 W -1 a 9.2 μm) de Infrared As-
sociates Inc. (Stuart, FL, EE. UU.), ver Fig. 1 . El láser era termoeléctrico refrigerado térmicamente para mantener una
temperatura de la cabeza de 18 ° C y en modo pulsado a una velocidad de repetición de 100 kHz y un ancho de pulso
de 500 ns. Un espejo parabólico fuera del eje chapado en oro con una distancia focal de Se usaron 43 mm para enfocar
la luz IR media en el detector. La medida señal procesada fue procesada por un integrador de dos canales y digitalizado
por un convertidor analógico a digital NI DAQ 9239 de 24 bits de National Instruments Corp. (Austin, EE. UU.) A una
velocidad de muestreo de 16 kHz. La configuración se colocó en una carcasa de lámina de polietileno, que era
constantemente enjuagado con aire seco para reducir la influencia del agua vapor. Una interfaz gráfica de usuario
escrita en casa con servidor-cliente estructura del programa desarrollada en LabView (versión 11.0, National In-
struments Corp., Austin, EE. UU.) se utilizó para controlar toda la configuración. Espectros de haz único que
comprenden 24,000 puntos de datos fueron grabados durante el tiempo de ajuste de EC-QCL de 1.5 s, y se realizaron
un total de 100 exploraciones acumulado para el fondo y las mediciones de muestra que resultan en una tiempo de
adquisición total de ~8.3 min. Para mediciones IR de leche bovina, agua desionizada se utilizó como fondo, mientras
que 45mmolL -1 tampón de fosfato pH 6,6 se utilizó como fondo para el estándar de proteína soluciones. Después de
cada medición, la celda de flujo se limpió con 2 ml de EtOH, NaOH diluido, HCl y agua destilada. Todas las soluciones
fueron inyectado manualmente en la celda de flujo empleando una jeringa
2.4. Procesamiento de datos El procesamiento de datos se realizó en MATLAB 2013b (Mathworks Inc., Nattick, EE.
UU.) Utilizando rutinas escritas tanto internas como internas, así PLS Toolbox 8.0 de Eigenvector Research Inc.
(Wenatchee, EE. UU.). los la rutina de preprocesamiento realizada para los datos en bruto EC-QCL tiene como objetivo
rectificar el desajuste espectral de escaneos sucesivos que es causado por cambios irregulares en la estructura fina de
la fuente de luz EC-QCL debido a imperfecciones mecánicas y problemas de activación y se basa en la algoritmo de
deformación optimizado de correlación ( Alcaráz et al., 2015 ). Para los espectros de leche bovina, antes de la
determinación de proteínas, el resta de la contribución espectral de la matriz de leche de la la señal IR global fue
necesaria. En consecuencia, la ciencia multivariada método de calibración basado (SBC) ( Marbach, 2010 ) se utilizó
para lograr un estimación confiable de la proporción de la matriz en espectros de muestras de leche reflejado en
variaciones en la intensidad de absorbancia de la banda de H 2 O en 1645 cm -1 debido al desplazamiento de agua
causado por la matriz de leche compuestos relativos a la H 2 O espectro de fondo. Para este fin, un α- Se utilizó el
espectro Lac como espectro de respuesta de la señal de la matriz y conjunto de 10 mezclas estándar de proteínas
terciarias sintéticas con una constante la concentración del componente de la matriz de cero se usó como matriz de
ruido para el cálculo del ruido espectral. La corrección de fondo procedimiento ha sido explicado en detalle en otra
parte ( Kuligowski et al., 2017 ). Una curva característica de operación del receptor univariante (ROC) ploying
concentraciones de β-LG y dos clases de carga de calor (baja y alta) se calculó empleando MetaboAnalyst 3.0 ( Xia,
Sinelnikov, Han, y Wishart, 2015
.5. Determinación del contenido de nitrógeno usando el método Kjeldahl El nitrógeno total (TN) se determinó
mediante el método Kjeldahl de acuerdo con la norma IDF / ISO correspondiente ( IDF / ISO, 2001a ), no caseína N
(NCN) según IDF / ISO ( IDF / ISO, 2004) ) y no proteico N (NPN) según IDF / ISO ( IDF / ISO, 2001b ) La proteína de suero
N era calculado a partir de la diferencia entre NCN y NPN, y caseína N de TN y NCN, respectivamente. Se calcularon
equivalentes de proteína a partir de datos de nitrógeno utilizando el factor 6.38. 2.6. Fase inversa: cromatografía
líquida de alta resolución (RP-HPLC) análisis de β- LG soluble en ácido Preparación de muestras para la determinación
de β-LG y RP- El análisis HPLC se llevó a cabo de acuerdo con la IDF / ISO correspondiente estándar ( IDF / ISO, 2005 )
y como se describió recientemente ( Boitz & Mayer, 2017; Mayer et al., 2010 ). Brevemente, caseínas y proteínas de
suero desnaturalizadas se precipitaron a pH 4,6 por adición gota a gota de HCl (2 mol L -1 ) El suero ácido que contiene
las proteínas de suero solubles en ácido fue separado por centrifugado y diluido (1:10, o 1: 5 en el caso de la leche
UHT) con solución tampón de fosfato de sodio (0,1 mol L -1 , pH 6.7). Las muestras fueron filtrado a través de filtros
Minisart RC de 0,20 μm (Sartorius, Goettingen, Alemania). RP-HPLC se realizó en un sistema de cromatografía Waters
usando un sistema de suministro multisolvente modelo 600E, un inyector Rheodyne 7725i, columna de protección
(Sentry Guard, Symmetry ™ C 18 , 3.5 μm, 2.1 × 10 mm) y una columna Symmetry ™ 300 C 18 (3.5 μm, 2.1 × 150 mm)
(Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.). Los eluidos de columna se controlaron en 205nm con Waters 2489 UV /
VIS Detector conectado a una PC ejecutando el software de cromatografía Waters Millennium para adquisición de
datos sición y gestión. La separación de gradiente se llevó a cabo dentro de los 18min, seguido de equilibrio de la
columna que conduce a intervalos de inyección de muestra de 35min ( Mayer et al., 2010 ). El solvente A consistía en
0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua ultrapura, disolvente B de TFA al 0,1% en acetonitrilo. Sol- respiraderos
para el análisis de HPLC se prepararon recientemente semanalmente y al vacío filtrado (Whatman ™, filtros de
membrana ME24ST blancos, 0.2μm, diámetro metro 47 mm) antes de su uso. La elución de gradiente fue realizada
por arrugando el disolvente B linealmente del 36% al 50% durante 14 minutos, seguido de aumentando a 100% B en
0,5 min, y finalmente manteniéndolo en 100% B para 3.5 min. La separación se realizó a una temperatura de columna
de 40 ° C con una velocidad de flujo de 0.35 mL min -1 y el volumen de inyección se estableció en 10 μL ( Mayer et al.,
2010 ).