PRÁCTICA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Objetivo
 Reconocer las técnicas de preparación de los diferentes medios de cultivo.
Fundamentos
Un medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. La composición dependerá de la especie que se quiera cultivar,
debido a las necesidades nutricionales.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
 Agar: utilizado como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene
de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
 Azúcares: son una fuente de carbono para los microorganismos, los más
empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
 Extractos: preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales
obtenidos con agua y calor.
 Peptonas: proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
 Fluidos corporales: sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son añadidos a los medios para el cultivo de algunos
microorganismos patógenos.
 Sistemas amortiguadores: sales que se añaden para mantener el pH dentro
del rango óptimo de crecimiento bacteriano.
 Indicadores de pH: indicadores ácido-base que se añaden para detectar los
cambios de pH del medio.
 Agentes reductores: sustancias que se añaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o
anaerobios.
 Agentes selectivos: sustancias como el cristal violeta, las sales biliares, etc.,
que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes
selectivos.
Metodología
1. Caldo nutritivo (CN). Es un medio líquido complejo de uso general para el
cultivo de bacterias.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína 5.0
Cloruro de sodio 8.0
Extracto de carne 3.0
pH 6.5-7.0
a) Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado
b) Ajustar el pH
c) Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min

2. Agar nutritivo (AN). Es un medio sólido complejo de uso general para el

cultivo de bacterias exigentes.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína 5.0
Cloruro de sodio 8.0
Extracto de carne 3.0
Agar 15.0
pH 6.5-7.0

a) Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado

b) Ajustar el pH
c) Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min
e) Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas Petri en condiciones
asépticas

3. Medio Mínimo de Sales (MM). Es un medio químicamente definido de uso

general para el cultivo de bacterias poco exigentes.
Ingredientes (g/L)
Glucosa 10.0
Sulfato de amonio 5.0
Sulfato de magnesio heptahidratado 2.0
Fosfato dipotásico 2.0
Sulfato ferroso heptahidratado 0.1
pH 6.5-7.0

a) Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la

glucosa.
b) La glucosa deberá disolverse en recipiente separado de las sales
c) Agregar el agar (15 g/L) y calentar a ebullición durante 1 minuto
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos las dos soluciones
e) Dejar enfriar a 40°C y cerca del mechero mezclar las soluciones
f) Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas Petri en condiciones
asépticas.
4. Agar de Eosina azul de metileno (EMB-agar). Es un medio de cultivo
comercial utilizado para identificación y diferenciación de enterobacterias.
Ingredientes (g/L)
Peptona de gelatina 10.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Fosfato dipotásico 2.0
Eosina 0.4
Azul de metileno 0.065
Agar 13.5

a) Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco

b) Calentar a ebullición durante 1 minuto
c) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
d) Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas Petri en condiciones
asépticas.

5. Agar para estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el

aislamiento e identificación de estafilococos.
Ingredientes (g/L)
Extracto de levadura 2.5
Peptona de caseína 10.0
Gelatina 30.0
Lactosa 2.0
D-Manitol 10.0
Cloruro de sodio 75.0
Fosfato dipotásico 5.0
Agar 15.0
pH final 7.0

a) Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco

b) Calentar a ebullición durante 1 minuto
c) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
d) Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas Petri en condiciones
asépticas

6. Papa-Dextrosa Agar (PDA). Es un medio sólido comercial de uso general

para el cultivo de hongos.
Ingredientes (g/L)
 Glucosa 20.0
Extracto de papa 4.0
Agar 15.0
pH 5.6

a) Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco

b) Ajustar el pH
c) Calentar a ebullición durante 1 minuto
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
e) Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas Petri en condiciones
asépticas

7. Papa Dextrosa Agar rosa de bengala. Es un medio sólido complejo de uso

general para el aislamiento de hongos.
Ingredientes (g/L)
Glucosa 20.0
Extracto de papa 4.0
Rosa de bengala 0.03
Agar 15.0
pH 5.6

a) Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco

b) Ajustar el pH
c) Calentar a ebullición durante 1 minuto
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
e) Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas Petri en condiciones
asépticas

8. Czapek-Dox Agar (CDA). Es un medio de sales, de uso general para el

cultivo de hongos poco exigentes.
Ingredientes (g/L)
Sacarosa 30.0
Nitrato de sodio 2.0
Fosfato dipotásico 1.0
Sulfato de magnesio heptahidratado 0.5
Cloruro de potasio 0.5
Sulfato ferroso heptahidratado 0.01
Agar 15.0
pH 5.6
 a) Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco
b) Ajustar el pH
c) Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
e) Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas Petri en condiciones
asépticas

9. Caldo rojo de fenol. Es un medio con diferentes azúcares para pruebas de

fermentación.
Ingredientes (g/L)
Azúcar 20.0
Fosfato monopotásico 9.1
Fosfato dipotásico 9.5
Extracto de levadura 0.1
Rojo de fenol 0.01
pH final 6.8-7

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Ajustar el ph
c) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
d) Colocar un tubo de Durham invertido
e) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

10. Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilización

de citrato en enterobacterias.
Ingredientes (g/L)
Citrato de sodio 2.0
Fosfato dipotásico 1.0
Fosfato monoamónico 1.0
Sulfato de magnesio heptahidratado 0.2
Cloruro de sodio 5.0
Sulfato ferroso 0.01
Agar 15.0
Azul de bromotimol 0.08
pH 7.0

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Ajustar el ph
c) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
d) Colocar un tubo de Durham invertido
e) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
f) Dejar solidificar el medio en forma inclinada

11. Caldo urea. Se emplea para la identificación de bacterias, particularmente

los miembros del género Proteus de Salmonella y Shigella.
Ingredientes (g/L)
Urea 20.0
Fosfato potásico 9.1
Fosfato dipotásico 9.5
Extracto de levadura 0.1
Rojo de fenol 0.01
pH final 6.8

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
c) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

12. Medio SIM. Medio semisólido usado rutinariamente en la diferenciación e

identificación de cultivos de Enterobacterias y que detecta la producción de
sulfuros, indol y movilidad de las mismas.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína 20.0
Peptona de carne 6.1
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Agar 3.5
pH final 7.3

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
c) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

13. Agar almidón. Para detectar actividad amilolítica

Ingredientes (g/L)
Almidón 10.0
Peptona de caseína 5.0
Cloruro de sodio 8.0
 Extracto de carne 3.0
Agar 15.0
pH 6.5-7.0

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Ajustar el pH
c) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar

microorganismos sobre la base de sus múltiples reacciones metabólicas en
un medio lácteo.
Ingredientes (g/L)
Leche descremada deshidratada 100
Polvo de tornasol 0.75

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
c) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

15. Agar de hierro y triple azúcar TSI. Medio comercial para identificar y
diferenciar enterobacterias. Se basa en la formación y fermentación de
glucosa, sacarosa y lactosa.
Ingredientes (g/L)
Mezcla de peptonas 20.0
Cloruro de sodio 5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Dextrosa 1.0
Sulfato de amonio férrico 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo fenol 0.025
Agar 13.0
pH final 7.3

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Calentar a ebullición durante 1 minuto
c) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
e) Dejar solidificar el medio en forma inclinada

16. Medio de gelatina. Medio comercial para determinar actividad de proteasas

Ingredientes (g/L)
Peptona de gelatina 5.0
Extracto de carne de res 3.0
Gelatina 120.0
pH final 6.8

a) Disolver cuidadosamente las sustancias

b) Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca
c) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

17. Medio de agar nutritivo blando. Es un medio semisólido complejo de uso

general para determinar movilidad de bacterias.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína 5.0
Cloruro de sodio 8.0
Extracto de carne 3.0
Agar 3.5
pH 6.5-7.0

a) Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado

b) Ajustar el pH
c) Calentar a ebullición durante 1 minuto
d) Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca
e) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano

probando diferentes concentraciones de sustrato carbonado (1-20 g/L)
Ingredientes (g/L)
Glucosa 10.0
Peptona de caseína 2.0
Extracto de levadura 0.5
Fosfato dipotásico 0.5
pH 6.5

a) Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado

b) Agregar la cantidad de glucosa correspondiente
c) Ajustar el pH
d) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos

19. Caldo microinoculación. Medio comercial para cultivar y preparar inóculos

de Lactobacilos y otros microorganismos utilizados en ensayos
microbiológicos.
Ingredientes (g/L)
Extracto de levadura 20.0
Mezcla de peptonas 5.0
Dextrosa 10.0
Fosfato monopotásico 2.0
Polisorbato 80 0.1
pH 6.5

a) Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado

b) Ajustar el pH
c) Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos