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sustancias ambientales normalmente no peligrosas, como los ácaros del polvo, la caspa
de mascotas, el polen o el moho, y la incidencia de alergias en todo el mundo está
aumentando 1 , 2 . Los anticuerpos IgE son fundamentales para la mayoría de las
reacciones alérgicas y se unen a los receptores de alta afinidad (FcɛRI) presentes en los
mastocitos y los basófilos, sensibilizando estas células para responder a los
alérgenos. FcɛRI se expresa como un trímero con una cadena α y dos cadenas γ o como
un tetrámero con una cadena β adicional 3 . La cadena α de FcɛRI (FcɛRIα) se une a IgE
con afinidad subnanomolar 4 , 5, y las células que expresan FcɛRI están precargadas con
IgE y preparadas para la activación. Un segundo receptor IgE (CD23) se expresa en
células adicionales, incluidos los linfocitos B, donde se cree que desempeñan un papel
en la presentación del antígeno mediada por IgE y la regulación de retroalimentación de
la producción de anticuerpos IgE 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
La región IgE-Fc contiene tres dominios (Cɛ2-4). Los tres dominios afectan la unión al
receptor de IgE, aunque el fragmento Cɛ3-4 se une independientemente a FcɛRI y CD23
y contiene los residuos implicados en las interacciones del receptor de
IgE 13 , 14 , 15 ( figura 1a). La IgE-Fc homodimérica se une a FcɛRIα asimétricamente,
formando dos contactos no equivalentes con FcɛRIα en la parte superior de cada
dominio Cɛ3 denominado sitio 1 y sitio 2 ( Fig. 1b ) (referencia 5 ). Los reajustes
conformacionales entre los estados abierto y cerrado dentro del fragmento Cɛ3-4,
estabilizados por la unión de FcɛRIα y CD23, respectivamente, permiten que FcɛRI y
CD23 funcionen como inhibidores alostéricos recíprocos ( Fig. 1b ) (refs 14, 15 ). Por el
contrario, los dominios Cɛ2 no hacen un contacto extenso con los receptores IgE, sino
que forman contactos intramoleculares dentro de IgE, estabilizando una conformación
asimétrica 'doblada' de la molécula de longitud completa ( Fig. 1c ). El papel principal
del dominio Cɛ2 es contribuir a la disociación lenta de IgE de FcɛRIα (ref. 13 ).
( a ) IgE y las ubicaciones relativas de los sitios de unión FcɛRIα- (púrpura) y CD23
(naranja). ( b ) Una representación de conformaciones abiertas y cerradas de
los dominios IgE-Fc 3-4 (incluido el mutante IgE-G335C-Fc 3-4 bloqueado en una
conformación cerrada), y una representación de la inhibición alostérica recíproca
por FcɛRIα (púrpura ) y CD23 (naranja). ( c ) Un esquema de la conformación doblada
de IgE y la posición relativa de los dominios Cɛ2.
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IgE ha sido un objetivo para el desarrollo terapéutico debido a su papel central en la
respuesta alérgica. El anticuerpo monoclonal anti-IgE omalizumab está actualmente
indicado para el tratamiento del asma persistente de moderada a grave y de la urticaria
idiopática crónica. Omalizumab ha demostrado una eficacia clínica sólida 16 , 17 ,18 y
promete una amplia gama de otras afecciones alérgicas, incluidos los regímenes de
desensibilización de alérgenos alimentarios orales 19. Omalizumab actúa principalmente
neutralizando la IgE sérica libre. Por lo tanto, también reduce los niveles de IgE en las
células que expresan FcɛRI, incluidos los mastocitos y los basófilos 20 , 21.. A medida
que los niveles de IgE en la superficie disminuyen en estas células efectoras alérgicas,
pierden la capacidad de unirse al alérgeno y experimentar una activación dependiente de
IgE.
Omalizumab recibió la aprobación de la FDA hace más de una década; sin embargo, no
se ha determinado ninguna estructura del complejo omalizumab: IgE. Para comprender
la base estructural de las interacciones omalizumab: IgE y su capacidad para inhibir la
unión a FcɛRI y CD23, determinamos la estructura del fab omalizumab unido a un
mutante del enlace disulfuro del fragmento IgE-Fc Cɛ3-Cɛ4 (IgE-G335C-Fc 3-4 ) a 2.5 Å
( Tabla 1 ). Omalizumab se une a los dominios de IgE Cɛ3 fuera del sitio de unión a
FcɛRI, similar a la proteína de repetición de Anykyrin diseñada para anti - IgE
(DARPin) E2_79, en buen acuerdo con estudios de mapeo previos del
epítope 22 , 23 , 24.. La estructura compleja aclara cómo omalizumab bloquea las
interacciones de IgE con los receptores de alta y baja afinidad. A pesar de la similitud
en omalizumab y sitios de unión a E2_79 en IgE, E2_79 es un inhibidor perturbador que
puede acelerar la disociación de complejos IgE: FcɛRI, mientras que omalizumab
tiene actividad disruptiva pobre ( ~ 1.000 veces más débil) 23 , 25 . La comparación de
los complejos omalizumab y E2_79 IgE proporciona información sobre el mecanismo
de inhibición disruptiva, que podría ayudar en el desarrollo de anticuerpos anti-IgE con
capacidades disruptivas mejoradas.
Resultados
Estructura del complejo IgE-omalizumab
Anteriormente describimos un mutante IgE-Fc 3-4 (IgE-G335C-Fc 3-4), que contiene un
enlace disulfuro modificado en la posición 335 que atrapa el dominio IgE-Fc 3-4 en una
conformación cerrada con flexibilidad conformacional reducida 33 ( Fig. 1b ). Esta
variante conserva la unión de alta afinidad a omalizumab, pero no a FcɛRIα ( Figuras
complementarias 1 y 2 ). Empleando esta variante restringida IgE-Fc 3-4 , cristalizamos
el complejo IgE-G335C-Fc 3-4 : omalizumab-Fab (posteriormente denominado complejo
IgE: omalizumab). El complejo purificado ( Fig. 3a, b ) cristalizado en el P2 1grupo
espacial, rayos X difractados a 2,5 Å ( Tabla 1 ), y la estructura se resolvió mediante
reemplazo molecular utilizando las estructuras existentes IgE-G335C-Fc 3-
4 (referencia 33 ) y omalizumab-Fab 34 . La unidad asimétrica contiene dos copias de