Nukleotidi i nukleinske kiseline

Uvod
Nukleinske kiseline, dezoksiribonukleinska kiselina i ribonukleinska kiselina,
su molekularni nosioci genetske informacije. Geni svih ćelija i mnogobrojnih
virusa izgrađeni su od DNA.Neki virusi, tzv. RNA ili retrovirusi, kao genetski
materijal sadrže ribonukleinske kiseline.
Struktura svakog proteina i svakog konstituenta ćelije, određena je
informacijom koja je sadržana u slijedu nukleotida, osnovnih gradivnih
jedinica ćelijskih nukleinskih kiselina.Svaka ćelija višećelijskih organizama
sadrži potpuno isti genetski materijal. DNA molekule su najveće
makromolekule u ćeliji i obično su upakovane u strukture koje se nazivaju
hromozomi.
Većina bakterija i virusa sadrži samo jedan hromozom dok eukariotske ćelije
sadrže više hromozoma.Jedan hromozom može sadržavati hiljade gena. Svi
ćelijski geni i intergenske DNA sekvence čine ćelijski genom. Hromozomske
DNA molekule često su za nekoliko redova veličine duže od vlastitih ćelija ili
virusa.

Proteinski omotačbakteriofaga T2 okružen

njegovom linearnom molekulom DNA.

Definicija gena mijenjala se i dopunjavala paralelno sa novim saznanjima o

strukturi i ulozi gena.Geni- segmenti DNA koji kodiraju ili određuju jedan
enzim.Geni-segmenti DNA koji su odgovorni za sintezu jednog
polipeptida.Geni koji kodiraju polipeptide i RNA molekule zovu se strukturni
geni.
Regulatorni geni obezbjeđuju signale za početak i kraj strukturnih gena,
učestvuju u aktiviranju i inaktiviranju transkripcije strukturnih gena ili
djeluju kao tačke započinjanja replikacije ili rekombinacije.Mnogi geni kod
eukariota i neki kod prokariota isprekidani su nekodirajućim segmentima
DNA koji se zovu intervencijski nizovi ili introni.
Koliko jedan hromozom sadrži gena zavisi od vrste organizma.Hromozom
E.coli je cirkularna DNA koja sadrži 4 638 858 baznih parova. Ovi bazni
parovi predstavljaju 4 300 gena za proteine i 115 gena za stabilne RNA
molekule. U čovječijem genomu oko 3 milijarde baznih parova kodira približno
40.000 gena koji su locirani u 24 različita hromozoma.

Gradivne jedinice nukleinskih kiselina

Nomeklatura nukleinskih kiselina

Gradivne jedinice nukleinskih kiselina

Fosfodiesterske veze

Kičme nukleinskih kiselina su hidrofilne i visoko polarne.Hidroksilne grupe

šećernih ostataka grade vodikove veze sa vodom.Fosfatne grupe pri pH 7 su
potpuno ionizovane i negativno nabijene.Njihovi negativni naboji se
neutraliziraju kroz ionsku interakciju sa pozitivnim nabojima proteina, ionima
metala i poliaminima.
Osobine nukleotidnih baza
Hidrofobne interakcije slaganja baza, pri kojima se dvije ili više baza slažu
tako da ravni njihovih prstenova budu paralelne, kombinirane sa van der
Waalsovim i dipol-dipol interakcijama važne su za stabiliziranje
trodimenzionalne strukture nukleinskih kiselina. Vodikove veze amino i
karbonilnih grupa su drugi važan vid interakcije među bazama u nukleinskim
kiselinama. Vodikove veze omogućavaju komplementarnu asocijaciju dva
(ponekad i tri ili četiri) lanca nukleinske kiseline
Krajem 19. vijeka Miescher izolirao “nuclein”.Avery, Mc
Leod i Mc Carty 1944. eksperimenti sa virulentnim i
nevirulentnim oblikom Streptococcus pneumoniae.1952.
eksperiment Hershey-Chase pokazao je da je DNA
ekskluzivni sastojak hromozomakoji nosi genetsku
informaciju.

1953. god. James Watson i Francis Circk pojasnili su trodomenzionalnu

strukturu DNA i na osnovu nje predložili mehanizam sinteze tj.replikacije
DNA. Ovaj rad je omogućio razumijevanje funkcije gena na molekularnoj
osnovi.Watson i Crick su analizirali fotografije DNA dobivene difrakcijom X-
zraka koje su snimili Rosalind Franklin i Maurice Wilkins.

Razrješenju trodimenzionalne strukture DNA mnogo su doprinijele i

Chargaffove postavke da je u svim molekulama DNA, bez obzira na vrstu,
broj ostataka adenina jednak broju ostataka timina (A=T), a da je broj
ostataka citozina jednak broju ostataka gvanina (C=G).Iz ovih odnosa može
se zaključiti da je zbir purinskih ostataka jednak broju ostataka pirimidina,
odnosno, A+G = C+T.

Watson-Crick model trodimenzionalne strukture

DNA:Dva polinukleotidna lanca, koja imaju strukturu
uzvojnice, svijeni su oko zajedničke ose gradeći desno
svijenu dvostruku uzvojnicu.Lanci se protežu u
suprotnim smjerovima.Purinske i pirimidinske baze
nalaze se u unutrašnjosti uzvojnice, dok se fosfatne i
deoksiribozne jedinice nalaze sa vanjske strane
uzvojnice.
Ravnine baza okomite su na osu heliksa. Ravnine šećera
nalaze se gotovo pod pravim uglom u odnosu na ravnine
baza.Dijametar uzvojnice je 2 nm. Susjedne baze
nalaze se na rastojanju od 0,34 nm dužose uzvojnice i
zarotirane su jedna u odnosu na drugu za
360.Struktura uzvojnice se ponavlja nakon svakih
deset ostataka u pojedinačnom lancu. To znači da
dužina jednog navoja uzvojnice iznosi 3.4 nm.
Dva lance drže se na okupu hidrogenskim vezama
između parova baza. Adenin je uvijek sparen s timinom
(T), a gvanin (G) s citozinom (C). AT bazne parove
pojačavaju dvije precizno usmjerene hidrogenske
veze, a GC par tri takve veze. Dvostruku uzvojnicu
stabiliziraju i interakcije između naslaganih baza
unutar jednog lanca heliksa.

Sekvenca baza u polinukleotidnom lancu nije ograničena ni

na koji način. Precizna sekvenca baza (redoslijed baza)
nosi genetsku informaciju.Sparivanjem baza nastaju
velika brazda i mala brazda na površini dvostruke
uzvojnice.
Dva antiparalelna lanca dvostruke uzvojnice nisu identična, već
su međusobno komplementarna. Ako se adenin nalazi u jednom,
timin se mora nalaziti u drugom lancu, i obratno. Glikozidne veze
koje pripadaju vezanom paru baza uvijek nalaze na istoj
udaljenosti od 1,085 nm.

Watson-Crickov model je sugerirao mehanizam za

prijenos genetske informacije. Bitna odlika modela
je komplementarnost dva lanca DNA. Kao što su
Watson i Crick i pretpostavili takva struktura se
može logično replicirati kroz (1) razdvajanje lanaca
i (2) sintezu komplementarnih lanaca za svaki od
originalnih lanaca.

DNA je veoma fleksibilna molekula.Moguća je

rotacija oko 7 veza u šećerno-fosfatnoj kičmi. te
rotacija oko C-1'-N-glikozidne veze.
Watson-Crickova struktura se jošnaziva i B-
DNA. U fiziološkim uslovima DNA se gotovo u
potpunosti nalazi kao B-DNA.A-forma je prisutna
u mnogim otopinama koje ne sadrže vodu. A-DNA
je, kao i B-DNA, u vidu desne dvostruke
uzvojnice, ali je ona nešto šira i ima 11 baza po
zavoju. Z-forma se javlja u vidu lijeve dvostruke
uzvojnice. Ima 12 parova baza po zavoju tako da
uzvojnica izgleda tanja i izduženija. Kičma DNA
ima cik-cak izgled zato što je jedinica koja se
ponavlja dinukleotid,
Osobine nukleotidnih baza
Nekoliko neobičnih DNA struktura uključuju po tri ili čak četiri DNA lanca u
jednu uzvojnicu. Ovakve strukturne varijacije javljaju se na mjestima gdje
započinju ili gdje se reguliraju procesi važni za metabolizam DNA
(replikacija, rekombinacija, transkripcija). Nukleotidi koji učestvuju u
Watson-Crickovim baznim parovima mogu formirati određeni broj dodatnih
vodikovih veza, naročito sa funkcionalnim grupama razmještenim po velikoj
brazdi. Na primjerprotonizirani citidinski ostatak se može upariti sa
gvanozinskim ostatkom G-C para, a timidin se može upariti sa adenozinom A-T
para.Ovakvo neobično sparivanje, tzv.Hoogsteen-ovo sparivanje (prema
Karstu Hoogsteenu koji je prvi uočio ovo sparivanje 1963.) omogućava
stvaranje trostruke uzvojnice DNA.
Gvanozin tetrapleks
(kvadrupleks). Četiri lanca DNA
mogu formirati četverostruku
uzvojnicu, ali to se obično dešava
samo kod sekvenci koje sadrže
veliki broj gvanozinskih ostataka
Polipurinske ili polipirimidinske
sekvence koje sadrže strukture
ogledala, mogu stvarati
neobičan oblik DNA tzv. H-
DNA. Struktura H-DNA je
primjer trostruke uzvojnice
koja sadrži jedan purinski i dva
pirimidinska lanca. Pirimidinski
lanci su sastavljeni iz dugih
nizova naizmjeničnih ostataka T
i C.
H-DNA
Polipirimidinske i polipurinske sekvence
potrebne za formiranje trostruke DNA,
nalaze u predjelima važnim za regulaciju i
ekspresiju određenih eukariotskih gena.

Ribonukleinske kiseline djeluju kao posrednici u prevođenju informacije koju

kodira DNA u sekvencu aminokiselina određenog proteina.F.Jacob i J.Monod
1961. predložili su naziv mRNA za dio ukupne celularne RNA koja prenosi
informaciju sa gena na nukleoproteinske komplekse za sintezu proteina u
citosolu (ribosome).Proces sinteze RNA na DNA matrici zove se
transkripcija.

Ako mRNA nosi kod za jedan protein kažemo da je monocistronska,a ako

kodira 2 ili više različitih proteina onda je policistronska.U eukariota većina
mRNA su monocistronske.
Dužina mRNA određena je veličinom proteina kojeg kodira.Za polipeptidni
lanac od 100 aminokiselinskih ostataka potrebna je mRNA sa najmanje 300
nukleotida.
RNA imaju različite strukture i funkcije.mRNA, tRNA, rRNA,
ribozimi.Produkt transkripcije je uvijek jednolančana RNA.Jedan lanac
ima tendenciju da stvara desno orijentiranu heliksnu konformaciju koja
se stabilizira slaganjem baza. RNA nema jednostavnu sekundarnu
strukturu kao što je dvostruki heliks DNA.

Prekidi u A-formi usljed

nesparenih baza na jednom
ili oba lanca dovodi do
stvaranja unutrašnjih petlji ili
izbočina.

U prisustvu komplementarnih sekvenci formira se A-tip uzvojnice.

Heliksna struktura nastala sparivanjem
baza u RNA. Primjer M1RNA
komponente ribonukleaze P.

Analiza strukture RNA i odnosa između strukture i funkcije je nadolazeće

polje istraživanja, slične kompleksnosti kao što je analiza strukture
proteina.Kako naša spoznaja o velikom broju funkcija RNA molekula raste,
tako raste i važnost razumijevanja strukture RNA.
Pored poznavanja strukture, za pravilno shvatanje funkcije nukleinskih
kiselina, potrebno je poznavati i njihove hemijske osobine. Uloga DNA kao
čuvara genetske informacije zavisi od njene nasljedne stabilnosti.
Dugotrajno očuvanje informacije bez promjena je veoma važno za ćeliju, jer i
veoma spore promjene DNA imaju jak odraz na fiziološki status ćelije.
Vjeruje se da su procesi poput geneze karcinoma ili starenje, posljedica
nagomilavanja ireverzibilnih promjena DNA. Pored boljeg razumijevanja
fizioloških procesa, poznavanje hemijskih osobina nukleinskih kiselina
omogućilo je razvoj moćnih tehnologija koje se primjenjuju u oblasti
molekularne biologije, opšte medicine i sudske medicine.

Dva lanca DNA uzvojnice mogu se lako

reverzibilno razdvojiti kada se pokidaju
hidrogenske veze između sparenih baza.
To se može postići zagrijavanjem otopine
iznad 800ili dodavanje kiseline ili baze.
Razdvojeni komplementarni DNA lanci
spontano reasociraju gradeći dvostruku
uzvojnicu, kod odgovarajuće ionske
jakosti i pri temparaturi koja je ispod
Tm. Ovaj proces renaturacije DNA se
naziva kaljenje (annealing).

Temperatura na kojoj se 50% DNA

denaturira naziva se temperatura
taljenja i označava se sa Tm.Tačka
taljenja DNA može se lako odrediti
mjerenjem apsorpcije svjetlosti
otopine DNA pri talasnoj dužini od 260
nm.Razdvajanje dvolančane uzvojnice
na pojedinačne lance dovodi do
povišenja apsorpcije koje se naziva
hiperhromni efekat.
Dvostruke uzvojnice (dupleksi) sastavljeni od dva RNA lanca, ili od po jednog
lanca RNA i DNA (RNA-DNA hibridi), također se mogu denaturirati pod
sličnim uvjetima kao i DNA. Zanimljivo je da su RNA dupleksi znatno
stabilniji od DNA dupleksa sa uporedivom baznom kompozicijom, tako da za
denaturaciju RNA treba za oko 200C viša temperatura nego za DNA.

Što je veće evoluciono srodstvo različitih

organizama to se lakše hibridiziraju njihove
DNA.
Sposobnost dva komplementarna DNA lanca da
se upare, moguće je iskoristiti za otkrivanje
identičnih DNA sekvenci kod različitih vrsta, ili
unutar genoma jedne vrste.Hibridizacija DNA
lanaca koji dolaze od različitih izvora,
predstavlja osnovu za velik broj moćnih tehnika
koje se primjenjuju u molekularnoj genetici.

Neenzimske promjene u nukleinskim kiselinama

Nukleotidi su podložni različitim spontanim promjenama svoje kovalentne
strukture.Iako su ove promjene veoma spore, one ipak imaju veliki fiziološki
zanačaj zbog netolerantnosti ćelije prema promjenama u genetskom
materijalu.Izmjene u strukturi DNA, koje dovode do stalne promjene
genetske informacije koju ta DNA kodira, nazivaju se mutacije.

Određene nukleotidne baze podliježu procesu

spontanog gubitka amino grupe (deaminacija). Spora
deaminacija citozina u uracil djeluje prilično
bezazleno, ali je sasvim izvjesno da je to glavni razlog
što DNA umjesto uracila sadrži timin.
UV zračenje uzrokuje kondenzaciju
između dva susjedna pirimidina
nukleinske kiseline pri čemu dolazi
do formiranja ciklobutanskih
pirimidinskih dimera. Do te reakcije
najčešće dolazi između susjednih
timidinskih ostataka na istom DNA
lancu.
Pored ciklobutanskog dimera
susjedni pirimidini mogu pod
djelovanjem UV zračenja tvoriti
jošjednu vrstu dimera tzv. 6-4
fotoprodukt.

Reaktivne hemikalije, koje se ispuštaju u sredinu kao industrijski proizvodi i

nus-proizvodi, mogu uzrokovati promjene na DNA. Hemikalije ne moraju biti
štetne same po sebi ali se tokom ćelijskog metabolizma mogu prevesti u
štetne. Postoje dvije glavne klase takvih agenasa:1. Deaminirajući agensi,
naročito nitritna kiselina (HNO2), ili jedinjena koja se mogu kroz
metaboličke procese prevesti u nitritnu kiselinu ili nitrite;2. Alkilirajući
agensi.
Nitritna kiselina, koja nastaje od svojih organskih
prethodnika kao što su nitrozamini, nitriti ili nitritne soli,
veoma je moćan akcelerator deaminacije baza. Slične
efekte proizvodi i bisulfit. Oba agensa se koriste za
konzerviranje prerađene hrane jer sprečavaju razvoj
otrovnih bakterija

Reakcijom dimetil sulfata iz gvanina nastaje O6-metilgvanin koji se ne može

upariti sa citozinom.
Najveći izvor mutagenih promjena u DNA je oksidacija. Jedinjenja koja
sadrže pobuđeni oksigen, kao što su hidrogen-peroksid, hidroksil radikali ili
superoksidni radikali, nastaju usljed zračenja ili kao nus-proizvodi aerobnog
metabolizma. Ćelije posjeduju dobro razrađen odbrambeni sistem, koji
uključuje brojne enzime poput katalaze i superoksid dismutaze, pomoću
kojeg pretvaraju reaktivne okside u bezopasna jedinjenja.
Ipak, jedan dio ovih oksidanata uspijeva proći kroz sistem i uzrokuje širok
spektar oštećenja na DNA, od reakcija oksidacije dezoksiriboze i baza pa do
razbijanja lanaca. DNA svake ljudske ćelije svakodnevno je podvrgnuta
hiljadama štetnih oksidativnih reakcija.

Sanger-ova metoda za sekveniranje DNA

bazira se na mehanizmu sinteze DNA
pomoću DNA polimeraza.DNA polimeraze
trebaju primer (kratki nukleotidni lanac
na koji se dodaju nukleotidi) i matrični
lanac na osnovu kojeg se vrši selekcija
svakog novog nukleotida
U Sanger-ovoj proceduri koriste se
dideoksinukleotid trifosfati (ddNTP) za
prekidanje sinteze DNA. Kada se ddNTP
ubaci umjesto dNTP, zaustavlja se elongacija lanca zato što analog ne sadrži
3’-hidroksilnu grupu koja je neophodna za polimerizaciju.DNA koja se
sekvenira koristi se kao matrica na koju se “kali”fluorescentno ili
radioaktivno obilježeni kratki primer. U reakcionu smjesu se dodaje i mala
količina ddNTP koji osigurava ranije prekidanje sinteze DNA. Zavisno od
toga koji se ddNTP dodaje na mjestima gdje se nalazi odgovarajući dNTP
imat ćemo prekid sinteze DNA.

Rezultirajuća otopina sadrži

smjesu obilježenih fragmenata od
kojih svaki završava istim
nukleotidom. Fragmenti različite
dužine mogu se razdvojiti
elektroforezom. Procedura se
ponavlja za sva četiri ddNTP, a
sekvenca se očitava direktno iz
autoradiograma. Pošto kraći
fragmenti brže migriraju oni se
nalaze na dnu gela i predstavljaju
nukleotidne pozicije koje su
najbliže primeru (5’kraj).

Sva četiri markirana ddNTP dodaju se u istu epruvetu . Rezultirajući obojeni

fragmenti DNA separiraju se na osnovu veličine u elektroforetskom gelu koji
se nalazi u kapilarnoj epruveti. Svi fragmenti određene dužine migriraju u
kapilarnom gelu i pripadaju jednom piku. Boja pika se detektuje pomoću
laserske zrake.
Sinteza
relativno
jeftinih DNA
polimera sa
prethodno
dizajniranom
sekvencom
imala je
snažan uticaj
na sva
područja
biohemije.