Burgos Asperilla Laura

Caracterización y estudio electroquímico
de superficies de Ti inmersas en medio

fisiológico y en cultivo celular
Tesis doctoral
Laura Burgos Asperilla

2012
FACULTAD DE CIENCIAS
Dpto. de Química Física Aplicada
Caracterización y estudio electroquímico de superficies de

Ti inmersas en medio fisiológico y en cultivo celular
Tesis doctoral
Laura Burgos Asperilla
2012
Directores
Concepción Alonso Fuente
Profesor Titular
Dpto. Química Física Aplicada (UAM)
Mª Cristina García Alonso

Científico Titular
Dpto. Ingeniería de Superficies, Corrosión y
Durabilidad. (CENIM-CSIC)
A mi familia
Agradecimientos
Una vez finalizado este trabajo, a veces lleno de dificultades y obstáculos, es
inevitable que te asalte un sentimiento egocéntrico que hace que centres la mayor
parte del mérito en el trabajo realizado por ti misma. Sin embargo, desde un punto de
vista objetivo, me doy cuenta que la realización de esta Tesis Doctoral no hubiera sido
posible sin la participación de personas e instituciones que han facilitado y hecho
posible este trabajo.
Me gustaría agradecer en primer lugar a la Dra. Concepción Alonso Fuente y a

la Dra. Mª Cristina García Alonso, las directoras de esta Tesis Doctoral, por la
confianza que depositaron en mi al aceptarme en su grupo de trabajo. Además, les
tengo que agradecer su paciencia, ayuda, dedicación, apoyo, motivación y
seguimiento que he recibido durante estos cinco años de arduo trabajo.
Además, también quiero agradecer a todo el departamento de Química Física

Aplicada de la Universidad Autónoma de Madrid por haberme acogido y tratado tan
bien en todo este tiempo y en concreto a la universidad por concederme el contrato
que me ha permitido realizar este trabajo.
Tengo que agradecer de forma especial y sincera al Dr. Jose Luis García Fierro y
a la Dra. Irene Llorente Carrasco por la ayuda prestada en la realización de los análisis
de XPS. De nuevo, agradecer a la Dra. Irene Llorente Carrasco por la realización de las
imágenes de AFM y a Alfonso García Delgado por su ayuda en la utilización del SEM. A
Alessandro Scapoli por la realización de la foto de la portada y a Cecilia Fernández
Martí por sus sugerencias.
Quiero agradecer también al Prof. Eduardo Ruiz Hitzky, la Dra. Pilar Aranda y a
la Dra. Margarita Darder Colom porque gracias a ellos, que me dieron la oportunidad
de trabajar en el ICMM, inicié mi aventura en el mundo de la investigación. Además,
gracias a todo el grupo de gente que me hizo más amena mi estancia allí y sobretodo
GRACIAS Almudena por ser mi Amiga, por ayudarme en todo lo que has podido, por
estar ahí en los buenos y los malos momentos, no solo en el trabajo en el ICMM, sino
gracias también por formar parte de mi vida y dejarme ser también parte de la tuya.
Gracias por tus risas, por hacerme los viajes al trabajo tan amenos y por tu curiosidad
incansable (Raul creo que me entiendes ¿verdad?). Suerte en vuestro nuevo
proyecto…………os quiero.
Gracias a la familia del CENIM: María C., Heidys, Iván, Jesús, Antonio, Miliki,
Emilio, Belén, Dani, Fernando, Violeta, Edgar, Rodrigo, Manuel, Alejandro, Juan Carlos,
Amir, Óscar, Blanca y Cris, por haberme acogido tan bien y haberme dado tantos
momentos alegres y divertidos, no sabéis cuanto echo de menos vuestras risas,
bromas “invisibles”, habilidades ocultas, etc. Porque al final pasamos más tiempo
juntos que con nuestras respectivas familias y ya se sabe que el roce hace el cariño, os
quiero. Además, quisiera agradecer a María su generosidad, sugerencias y sinceridad.
También añoro los desayunos a horas intempestivas con Jose Mª y Pedro Pablo.
Gracias por compartir conmigo vuestras historias, por vuestros consejos y
sugerencias, y por enseñarme cada día “El museo del bujero”. En esta gran familia no
puede faltar “la cuchipandi” (que no me olvido de vosotros). Diana, te agradezco tu
sensatez, sinceridad y tu espíritu de lucha, siempre se aprende algo nuevo a tu lado.
Mónica, gracias por dejarme conocerte mejor, por compartir conmigo esos momentos
difíciles, por escucharme y comprenderme y darme ánimo cuando lo he necesitado.
Irene, aunque no terminamos de colaborar juntas, a nivel personal me has aportado
mucho. Gracias por los consejos, por serenarme y ponerme los pies en el suelo
cuando me acelero. Y por último, pero no menos importante, Santi. Gracias por
hacerme reír, por animarme en los bajones, por poner banda sonora a la jornada
laboral (sobretodo los viernes). Por compartir conmigo tus cosas, por escuchar las
mías, porque nunca dejaré de soñar gracias a ti, tq. A toda la Cuchipandi, deciros que
gracias por acompañarme y aguantarme en los paréntesis de las 12, ya sabéis hora
Coca-cola Zero, os echo mucho de menos, os quiero y os llevaré siempre conmigo.
A mis AMIGOS de la UAM: Miriam, gracias por tu paciencia infinita, por

escucharme, ayudarme y aconsejarme. Sabes que sin ti, hubiera sido todo muchísimo
más difícil, gracias por estar ahí, tq. Ana, Ángel y Vero gracias por acogerme tan bien
en vuestro grupo, por compartir conmigo las comidas, vuestras historias y por
escucharme y animarme cuando lo he necesitado. Ana, gracias por esas sesiones de
“hierbas”, por tu generosidad, quiero que sepas que eres muy importante para mí,
que te admiro por ese tesón que tienes como madre y amiga. Ángel y Vero, aunque el
destino ha querido que nuestras vidas se separen os llevaré siempre en el corazón. A
los tres os quiero.
Me gustaría agradecer enormemente a Merce, Isa e Isabel ya que aunque

indirectamente, también habéis tenido un papel muy importante en este trabajo.
Gracias por animarme, aconsejarme, entenderme y por compartir conmigo esos ratos
en los que gracias a vosotras desconecto de la tesis.
Cómo no, también agradezco a mi familia por hacerme tan feliz y por
enseñarme que hay una vida después del trabajo:
 Gracias Mamá y Papá por todo lo que habéis hecho por mí, desde el minuto 1
de mi vida siempre habéis estado ahí para todo y seguís estando. Gracias por
ser mis padres. Ya sabéis que para mi sois los mejores padres del mundo. Os
AMO.
 A mi hermano Daniel y a mi cuñada Irene, os agradezco las risas, los llantos
(verdad Dani, vaya infancia más buena), los ratos juntos viendo pelis…Gracias
por estar ahí. Os quiero.
 Gracias también a mi cuñado y a mis suegros por toda la ayuda, cariño y
buenos momentos que hemos pasado juntos. Os Quiero.
 A mi Cachorro (Chema, no podías faltar), te agradezco todo el amor que me
das, las risas, las discusiones, los altos y los bajos, pues de cada momento hay
que sacar las cosas positivas. Gracias por animarme, por no dejar que me
estrelle, por aconsejarme, por quererme tal cual y sobretodo por darme lo
mejor que tengo en esta vida, Hugo. Te quiero mucho Cacho.
 Hugo, eres lo mejor que me ha pasado en la vida y gracias a ti he aprendido a
valorar las cosas de otra manera. Perdóname por las ausencias y gracias por
todos los momentos de felicidad incondicional que me das. Te Quiero, Te
Adoro y Te amo.
Para terminar no se me olvida una frase que me escribió en la carpeta un amigo de la

infancia y que creo que es mi meta en la vida:
“No consiste en llenar la vida de años, sino los años de vida”

Índice
1. Introducción
1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática ............................................ 1
1.2 Titanio...................................................................................................................... 4
1.3 Modificaciones superficiales del titanio .................................................................... 9
1.4 Estudio de la interfase Ti/medio fisiológico ............................................................. 15
1.5 Estudio de la interfase Ti/Células ............................................................................ 22

1.5.1 Comportamiento celular ante el implante metálico o biomaterial ..................................... 22
1.5.2 Estudio de las interacciones electroquímicas de la interfase Ti/Células ............................. 24
1.5.3 Estudio de la adhesión celular mediante la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) ....... 27
2. Objetivos y Plan de Trabajo ....................................................................... 29
3. Materiales y métodos ............................................................................... 33
3.1 Materiales .............................................................................................................. 35

3.1.1 Electrodos ............................................................................................................................ 35
3.1.1.1 Electrodos de trabajo ................................................................................................... 35
3.1.1.2 Electrodos de referencia .............................................................................................. 37
3.1.1.3 Electrodo auxiliar o contraelectrodo ........................................................................... 37
3.1.2 Celda electroquímica ........................................................................................................... 37
3.2 Reactivos y disoluciones ......................................................................................... 40
3.3 Fundamento teórico de las técnicas utilizadas ........................................................ 41

3.3.1 Técnicas de caracterización ................................................................................................. 41
3.3.1.1 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) ........................................................ 41
3.3.1.2 Microscopía de fuerza atómica (AFM) ......................................................................... 43
3.3.1.3 Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microanálisis por dispersión de
rayos X (EDX) ............................................................................................................................ 45
3.3.2 Experimentación con cultivos celulares............................................................................... 47
3.3.3 Técnicas electroquímicas ..................................................................................................... 50
3.3.3.1 Potencial de corrosión ................................................................................................. 50
3.3.3.2 Curvas de polarización. Pendientes de Tafel ............................................................... 52
3.3.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) ................................................... 55
3.3.4 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) ............................................................................ 61
3.4 Equipos................................................................................................................... 64
3.4.1 Microscopio electrónico de barrido (SEM) y microanálisis por dispersión de
rayos X (EDX) ................................................................................................................................. 64
3.4.2 Microscopio de fuerza atómica (AFM) ................................................................................. 64
3.4.3 Espectrómetro fotoelectrónico de rayos-X (XPS) ................................................................ 65
3.4.4 Potenciostato ....................................................................................................................... 65
3.4.5 Microscopio óptico invertido ............................................................................................... 66
3.5 Metodología ........................................................................................................... 67

3.5.1 Técnicas de caracterización ................................................................................................. 67
rayos X (EDX) ............................................................................................................................ 69
3.5.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS)......................................................... 69
3.5.2 Ensayos en cultivos celulares ............................................................................................... 69
3.5.3 Técnicas electroquímicas ..................................................................................................... 72
3.5.3.1 Potencial de corrosión.................................................................................................. 72
3.5.3.2 Curvas de polarización ................................................................................................. 72
3.5.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).................................................... 73
4. Resultados y discusión ............................................................................... 77
4.1 Estudio de la interfase Ti-Q/componentes del DMEMc ............................................ 79

4.1.1 Caracterización de Ti-Q ........................................................................................................ 79
4.1.1.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ................................................................... 79
4.1.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ......................................................... 80
4.1.2 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) ....................................................................... 82
4.1.3 Caracterización de las muestras de Ti-Q en los distintos componentes del DMEMc
por espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) .................................................................. 87
4.1.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en los distintos componentes del DMEMc .... 95
4.1.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de ensayo ................................... 95
4.1.4.2 Curvas de polarización ................................................................................................. 96
4.1.4.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).................................................. 101
4.1.5 Discusión ............................................................................................................................ 113
4.2 Estudio de la interfase Ti-Q/Osteoblastos Saos-2 .................................................. 119

4.2.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ........................................................................ 119
4.2.3 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) .......................................................................... 121
4.2.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en cultivos de osteoblastos Saos-2 .............. 124
4.2.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de ensayo................................. 125
4.2.4.2 Curvas de polarización ............................................................................................... 126
4.2.4.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) ................................................. 128
4.2.5 Discusión ............................................................................................................................ 135
4.3 Estudio de la interfase Ti-TT/componentes del DMEMc ........................................ 139

4.3.1 Caracterización de las superficies de Ti ............................................................................. 139
energía de rayos X (EDX) ........................................................................................................ 139
4.3.1.2 Microscopía de fuerza atómica (AFM) ....................................................................... 140
4.3.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ...................................................... 142
4.3.1.4 Cálculo del espesor de óxido de titanio mediante espectroscopía de
impedancia electroquímica. ................................................................................................... 144
4.3.2 Caracterización del Ti-TT en los distintos componentes del DMEMc por
espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ....................................................................... 145
4.3.3. Estudio electroquímico del Ti-TT sumergido en los distintos componentes del
DMEMc ....................................................................................................................................... 151
4.3.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) ................................................. 157
4.3.4 Discusión ............................................................................................................................ 171
4.4 Estudio de la interfase Ti-TT/Osteoblastos Saos-2 ................................................. 179

4.4.1 Curva de crecimiento de Osteoblastos Saos-2 .................................................................. 179
4.4.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ........................................................................ 180
4.4.3 Caracterización del Ti-TT sumergido en DMEMc y en cultivos de Saos-2 por
espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) ....................................................................... 181
4.4.4. Caracterización electroquímica del Ti-TT sumergido en DMEMc y en cultivos
de osteoblastos Saos-2............................................................................................................. 185
4.4.4.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).................................................. 189
4.4.5 Discusión ............................................................................................................................ 195
5. Conclusiones ............................................................................................ 201
6. Bibliografía .............................................................................................. 207
7. Anexos ..................................................................................................... 221
7.1 Composición del DMEM ........................................................................................ 223
7.2 Composición bioquímica y hormonal del FBS......................................................... 224
7.3 Diagrama de Pourbaix para el titanio .................................................................... 225
7.4 Curva de Volcano .................................................................................................. 226
7.5 Índice de figuras ................................................................................................... 227
7.6 Índice de tablas..................................................................................................... 232

1. Introducción
1. Introducción 1
1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática
Se puede definir un biomaterial como un material farmacológicamente inerte,

sintético o natural diseñado para sustituir o reforzar la función de un tejido o un
órgano. Para que un biomaterial pueda ser implantado en el cuerpo humano, debe
estar constituido por un material biológicamente compatible; es decir, que no
provoque su rechazo, que cuente con una elevada resistencia a la corrosión y unas
propiedades mecánicas adecuadas.
Tabla 1. Tipos de materiales sintéticos, ventajas, desventajas y aplicaciones de biomateriales

utilizados en implantes.
Materiales Ventajas Desventajas Aplicaciones
Polímeros: Silicona, Baja resistencia Suturas, arterias,

Elásticos, fácil de
Teflón, Dacron, mecánica, degradación venas, nariz, orejas,
fabricar, baja densidad.
Nylon. con el tiempo. tendones.
Fijación ortopédica:
Baja biocompatibilidad, tornillos, clavos,
Metales: Ti y sus
Buenas propiedades corrosión en medios alambres, placas,
aleaciones, Co-Cr,
mecánicas fisiológicos, alta barras
aceros inoxidables.
densidad. intermedulares,
implantes dentales.
Fractura ante esfuerzos

Cerámicas: Óxidos de
Buena de alto impacto, difícil Bola en prótesis de
Al, aluminatos de Ca,
biocompatibilidad, fabricación, baja cadera, implantes
óxidos de Ti,
resistencia a la resistencia mecánica, dentales, dispositivos
compuestos de
corrosión, inerte. inelásticos, alta transcutáneos.
carbono.
densidad.
Buena compatibilidad,
Compuestos:
inerte, resistencia a la Carecen de consistencia Válvulas cardiacas,
Cerámica-metal,
corrosión, alta en la fabricación del uniones óseas,
carbono-otro
resistencia a los material. marcapasos.
material.
esfuerzos.
2 1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática
Existen cuatro grupos de materiales usados como implantes: metálicos,

cerámicos, poliméricos y compuestos de ellos. En la Tabla 1 se contemplan algunas
de las ventajas, desventajas y aplicaciones para los cuatro grupos de materiales.
Si atendemos a las propiedades mecánicas que se requieren para un

determinado implante, dependerá del órgano al que van a reemplazar: no se
necesitan las mismas propiedades funcionales para remplazar una válvula del
sistema cardíaco, que un trasplante de córnea, una pieza dental o una articulación.
Si nos centramos en aplicaciones donde se requiere la sustitución de componentes
óseos, los materiales más utilizados son los metales y/o aleaciones metálicas.
Teniendo en cuenta que más de tres cuartas partes del sistema periódico son
metales, el número de elementos metálicos que se utilizan en la fabricación de
implantes es bastante limitado. Centrándonos en los materiales que van a
remplazar a componentes del aparato locomotor, deben asegurar una buena
transmisión de cargas y distribución de fuerzas entre el hueso y el implante. Es
[1]
decir, su módulo elástico debe ser lo más cercano al hueso posible (20 GPa en
zona cortical del hueso). Otras propiedades mecánicas importantes en
aplicaciones osteoarticulares serían: buena resistencia a la tracción, al impacto,
resistencia a la fractura, resistencia al desgaste y a la fatiga [1]. De todas ellas, quizá
las más importantes son las que se refieren a situaciones de carga dinámica, es
decir, desgaste y fatiga.
La biocompatibilidad de un material viene dada por su capacidad para producir

una respuesta apropiada en el organismo. Teniendo en cuenta, que no existe ningún
material totalmente inerte dentro del organismo, se pueden clasificar los
biomateriales atendiendo al grado de biodegradación y a la respuesta biológica que
desencadenan. Así, nos encontramos que pueden ser bioactivos, como la
hidroxiapatita; biodegradables, como el magnesio; bioinertes, como la alúmina y la
zirconia; o biotolerables como los polímeros y metales o aleaciones metálicas como el
[2]
acero inoxidable, aleaciones de CoCr y el Ti y sus aleaciones . Los biomateriales se
1. Introducción 3
encuentran expuestos temporal o permanentemente a fluidos del cuerpo. Debido a

esto, es esencial entender las relaciones existentes entre las propiedades, funciones y
estructuras de los materiales biológicos y su interacción con el medio que les rodea,
pues el éxito de un biomaterial o de un implante dependerá de las propiedades y
biocompatibilidad del implante. En los casos de biomateriales metálicos es muy
importante que, la dosis de iones metálicos que puedan liberar a los tejidos vivos, no
interfiera en los procesos metabólicos del cuerpo humano y no provoque situaciones
de rechazo. En cuanto a la resistencia a la corrosión de los materiales metálicos, hay
que tener en cuenta que se encuentran inmersos en un medio hostil como es el
organismo humano, y a temperaturas del orden de 37°C, condiciones que pueden
provocar y favorecer dicha corrosión. No obstante, la mayoría de ellos forman una
capa de óxido en su superficie, protegiendo al metal y disminuyendo drásticamente la
velocidad de corrosión, como ocurre en el acero inoxidable, las aleaciones de CoCr y
el titanio y sus aleaciones.
Como ya se ha señalado, la selección de un determinado biomaterial metálico

dependerá del tipo de aplicación o función a cumplir dentro del cuerpo humano.
Dependiendo de su aplicación dentro del organismo, si es sólo temporal (tornillos,
placas de fijación de fracturas, etc.) se utilizarán aceros inoxidables, el Ta y el Ti-cp (Ti
comercialmente puro); o bien si es permanente (implantes dentales o en prótesis de
cadera o de rodilla, fundamentalmente) en las que entran en juego las aleaciones de
CoCr y las aleaciones de base titanio fundamentalmente, donde las solicitaciones
mecánicas son más exigentes durante un largo periodo de tiempo.
Teniendo en cuenta las excelentes características del titanio, se deduce que, el

titanio y sus aleaciones, son unos de los biomateriales metálicos con mejores
propiedades para ser utilizados en aplicaciones biomédicas, ya sea como implante
temporal o permanente. Entre sus principales cualidades se encuentran unas buenas
propiedades mecánicas (posee el menor módulo elástico de los biomateriales
metálicos) y una excelente biocompatibilidad y resistencia frente a la corrosión. Sin
4 1.2 Titanio
embargo, a pesar de sus buenas propiedades, las elevadas exigencias de las

condiciones fisiológicas en ciertas aplicaciones biomédicas, como las asociadas con el
aparato locomotor, dan lugar a que con el tiempo, se deteriore y tenga que ser
sustituido. Por esta razón, la investigación sobre el titanio en un medio fisiológico tan
exigente continúa evolucionando hacia lugares donde el campo de aplicación es muy
amplio.
1.2 Titanio
El titanio fue descubierto en 1791 (en el mineral menacanita) por el clérigo

británico William Gregor, quien le puso el nombre de “menaquita”. Cuatro años
después, el químico alemán Martin Heinrich Klaproth volvió a descubrir el elemento
en el mineral rutilo, y le llamó titanio, como alusión a la fuerza de los mitológicos
titanes griegos. El titanio es un metal de transición perteneciente al 4º período de la
tabla periódica, de número atómico 22, peso atómico 47,87 g/mol y cuya
configuración electrónica es [Ar] 3d24s2. La capa d, incompleta, hace del titanio un
elemento muy reactivo, que puede adoptar las valencias +2, +3 y +4 y, además,
[3]
formar disoluciones sólidas con muchos elementos sustitucionales . Este metal de
transición ocupa el noveno lugar entre los elementos más abundantes en la corteza
terrestre (su concentración es del 0,8% en peso del total) y el cuarto entre los metales
[4]
más empleados habitualmente, después del Al, Fe y Mg . El titanio se encuentra
muy diseminado en la Tierra en forma de dióxidos de titanio y diversas clases de
titanatos en minerales como la ilmenita, la anosovita, el rutilo y la pseudobrookita. Las
menas que contienen minerales de titanio están ampliamente distribuidas y son
muchos los países que poseen depósitos explotables. Los minerales principales, la
ilmenita (FeO·TiO2) y el rutilo (TiO2), se encuentran en rocas y en ciertas arenas de
playa. La ilmenita, romboédrica, frecuentemente se halla asociada a la magnetita,
mientras que el rutilo, tetragonal, aparece en las rocas ígneas, metamórficas y
sedimentarias. Otros minerales que aparecen junto al rutilo son la anatasa y la
1. Introducción 5
brookita, ambas TiO2 tetragonal y romboédrico, respectivamente, siendo el rutilo el

más abundante de todos. La transformación del mineral natural a titanio metálico
puro consiste, en esencia, en la cloración de las menas de ilmenita o rutilo para
formar tetracloruro de titanio (TiCl4) y, posteriormente, la reducción de éste mediante
magnesio fundido, en una atmósfera de argón, para evitar la oxidación (método de
Kroll) [5].
Debido a las dificultades de extracción y transformación, el titanio metálico

resulta caro comparado con otros metales de uso más extendido. Sin embargo, sus
excelentes propiedades mecánicas lo convierten en uno de los metales más atractivos
en un gran número de aplicaciones.
El titanio, en estado metálico, es un material alotrópico, es decir, puede existir

en más de una forma cristalográfica. A temperatura ambiente, presenta una
estructura hexagonal compacta (fase α), cuya densidad es de 4,5 g/cm3. Sin embargo,
a temperaturas superiores a 885°C, sufre una transformación reversible a la
estructura cúbica centrada en el cuerpo (fase β) con una densidad de 4,4 g/cm3
(Figura 1).
Figura 1. Estructuras cristalinas del titanio (fases α-Ti y β-Ti).

6 1.2 Titanio
En estado puro, el titanio presenta una resistividad eléctrica en el rango 0,4 –

0,6 μΩm, un valor bajo comparado con el de otros metales. Las propiedades térmicas
del titanio puro, se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Propiedades térmicas del titanio puro.
Propiedades térmicas
Punto de fusión 1670 °C
Punto de ebullición 3260 °C
Calor latente de fusión 435,4 J/g
Calor específico 0,528 J/(°C·g)
Conductividad térmica 17 W/(°C·m)
El titanio puro es un material rígido y dúctil que presenta un módulo de

elasticidad de 108 GPa, el más cercano al hueso (de aproximadamente 20 GPa) de los
biomateriales metálicos, además de una elevada resistencia a la tracción (103 MPa) y
[3]
una gran tenacidad . Sin embargo, tiene una baja resistencia al desgaste, debido al
bajo valor de la relación de los parámetros de red c/a (1,59), típica de la estructura
hexagonal compacta (Figura 1). Esta es una de las principales desventajas del Ti en
comparación con otros biomateriales metálicos. Por este motivo, el Ti-cp posee un
98,635-99,500% de pureza al que se le añaden impurezas intersticiales de C, H, O, N,
Fe y otras que disminuyen su reactividad además de incrementar la relación c/a,
mejorando así sus propiedades mecánicas. En función de las concentraciones de
impurezas añadidas, el α−Ti cp queda catalogado en grados (Tabla 3) según la ASTM
(American Society for Testing and Materials) [6].
Es también muy frecuente alear el titanio con impurezas tanto intersticiales

como sustitucionales. Hay elementos como el Al, Ga, Ge, C, O y N que tienden a
estabilizar la fase α. Hay otros, por el contrario, que tienden a estabilizar la fase β,
como son el Mo, V, Ta y Nb. Por último, también existen aleantes eutectoides como el
Mn, Fe, Cr, Co, Ni, Cu y Si que son solubles tanto en la fase α como en la β, no
estabilizan ninguna de ellas, pero mejoran su dureza. Por consiguiente, dependiendo
1. Introducción 7
de las impurezas disueltas en el titanio y sus concentraciones relativas, se podrán

obtener aleaciones tipo α, tipo β o, incluso, tipo α+β, respectivamente, si la fase α,
la β, o ambas fases coexisten a temperatura ambiente, abarcando un gran espectro de
propiedades mecánicas (Tabla 4) [7]. Esta variabilidad de composición y por tanto de
propiedades mecánicas, nos permite tener una cierta versatilidad a la hora de elegir el
tipo de implante de Ti que más se adecue a los requerimientos clínicos de la cirugía.
Tabla 3. Comparación de varias especificaciones para el α−Ti comercialmente puro (cp):

concentración máxima de aleantes, tensión de ruptura (Tr), límite elástico (Te) y elongación máxima
(ε).
ASTM-Ti O N Fe Tr Te 
C (%) H (%) Otros (%)
(cp) (%) (%) (%) (MPa) (MPa) (%)
Grado 1 0,020 0,015 0,18 0,03 0,20 --- 240 170-310 24
Grado 2 0,020 0,015 0,25 0,03 0,30 --- 343 275-410 20
Grado 3 0,020 0,015 0,35 0,05 0,30 --- 440 377-520 18
Grado 4 0,020 0,015 0,40 0,05 0,50 --- 550 480 20
Grado 7 0,020 0,015 0,25 0,03 0,30 0,12-0,25 Pd 343 275-410 20
0,2-0,4 Mo
Grado 12 0,020 0,015 0,25 0,03 0,30 480 380 12
0,6-0,9 Ni
Las excelentes propiedades mecánicas del titanio y sus aleaciones, así como su
baja densidad (el 55% de la del acero) y su elevado punto de fusión, lo convierten en
un material de gran interés tecnológico. Pero, además, el titanio presenta una elevada
[8]
resistencia a la corrosión frente a ambientes químicos muy reactivos y es
biocompatible en presencia de ambientes biológicos, lo que promueve su uso como
biomaterial. Pocas son las sustancias capaces de alterarlo: altas concentraciones de
HCl, H2SO4, NaOH o HF en caliente. En conjunto, estas propiedades han otorgado al
[8]
titanio una situación preferente en muy diversas aplicaciones industriales . En
8 1.2 Titanio
medicina se usa tanto en prótesis óseas, tornillos y clavos, como en válvulas cardíacas
o instrumentos e implantes dentales.
Tabla 4. Varios tipos de aleaciones de titanio, así como sus respectivas composiciones, estructura
cristalina, resistencia a tracción (Rt), límite elástico (Te) y elongación máxima (ε).
Aleación Composición (%) Estructura Rt (MPa) Te (MPa) ε (%)
Ti cp 99 Ti α 262-686 151-585 17-30

Ti-Al-Sn 5 Al, 2,5 Sn α 860 806 18
Ti-Al-V 6 Al, 4 V α+β 1171 1067 8
Ti-Al-Zn-Mo 6 Al, 2 Sn, 4 Zn, 6 Mo α+β 1098-1166 1029-1098 20
Ti-V-Cr-Al 13 V, 11 Cr, 3 Al β 853-1166 804-1098 10-25
Las principales líneas de investigación, dentro de la comunidad científica

dedicada al titanio y sus aleaciones en el campo de los biomateriales, se centran
fundamentalmente en dos aspectos. El primero de ellos está relacionado con las
características intrínsecas masivas del material, es decir, en sus propiedades
[9]
mecánicas, específicamente, reducir su módulo de elasticidad (de 108 GPa, hasta
los aproximadamente 20 GPa del hueso); el segundo, con mejorar las propiedades de
la superficie del titanio, que es la que en definitiva se encuentra en contacto con el
medio fisiológico. Como ya se ha señalado, una de las principales desventajas del
titanio y sus aleaciones es su baja resistencia al desgaste: es, paradójicamente, la más
baja de los biomateriales metálicos utilizados en aplicaciones biomédicas. Este
material, en condiciones de fricción y/o desgaste producido entre el hueso y el
implante, da lugar a la rotura de la capa pasiva con la consiguiente liberación de
[10, 11]
partículas de tamaño nanométrico e iones metálicos al medio que le rodea . Es
por ello, que se han encontrado altas concentraciones metálicas en los alrededores de
[12, 13]
las prótesis de Ti , lo cual puede dar lugar a resorción ósea, con la consiguiente
pérdida del implante [9], e incluso, a acumulaciones de partículas e iones en el hígado,
páncreas o nódulos linfáticos [14]. Para intentar paliar este problema, los esfuerzos se
centran en conseguir superficies más resistentes al desgaste y en acelerar la
1. Introducción 9
osteointegración ósea de tal forma, que se consiga una “interfase” continua implante-
hueso lo más rápidamente posible, que dé la estabilidad suficiente como para evitar
los problemas asociados con la liberación de partículas e iones metálicos. Para ello, es
evidente que el estudio de la interacción entre el material de implante y el medio
fisiológico en los primeros periodos de implantación, es fundamental para establecer
una estrategia que mejore la conexión íntima implante/hueso.
Precisamente para mejorar las propiedades del Ti y sus aleaciones en los

aspectos relacionados a su superficie, es posible plantear numerosas modificaciones
superficiales.
1.3 Modificaciones superficiales del titanio
En el proceso de osteointegración, la superficie del material de titanio es

fundamental en la respuesta al entorno biológico en los dispositivos médicos
artificiales. Si para determinadas aplicaciones biomédicas la superficie nativa de los
materiales de titanio no es adecuada, se realizan modificaciones o preparaciones
previas en dicha superficie: se trata, por ejemplo, de conseguir superficies más
rugosas que mejoren el anclaje al hueso, o más bioactivas, que aceleren los procesos
iniciales de osteointegración, o de mayor resistencia mecánica superficial, con el fin
de conseguir mayor resistencia frente al desgaste.
Los métodos más utilizados para modificar la superficie del Ti y la de sus

aleaciones, aparecen en la Tabla 5. Como se observa en la Tabla 5, podemos
considerar tres bloques fundamentales de modificaciones superficiales: métodos
mecánicos, que tienen como objetivo conseguir una rugosidad y topografía
específicas (aunque también se utilizan para eliminar impurezas de la superficie [15] así
como para mejorar el anclaje del biomaterial al hueso); los métodos químicos y los
físicos, en los que se modifica la naturaleza química de la superficie del titanio. Vamos
a centrarnos en los métodos que modifican la naturaleza química de la superficie.
10 1.3 Modificaciones superficiales del titanio
Tabla 5. Principales tratamientos superficiales del titanio y sus aleaciones para aplicaciones
biomédicas [16].
Método de modificación
Capa modificada Objetivo
superficial
Métodos mecánicos
Se forman superficies rugosas o Producir superficies con
Mecanizado
lisas por medio del proceso de topografías específicas, limpiar y
Pulverizado (grinding)
sustracción o eliminación física hacer más rugosas las superficies
Pulido
de las primeras capas de la para mejorar la adhesión en
Chorreado
superficie. hueso.
Métodos Químicos
<10nm de capa de óxido en la Eliminar escamas de óxido y
Tratamientos ácidos
superficie contaminación.
Tratamientos básicos ~1m de gel de titanato sódico
Tratamiento con peróxido de ~5nm de capa densa interna y Mejorar la biocompatibilidad,

hidrógeno una capa porosa externa bioactividad o conductividad en
hueso.
~10m de capa fina como fosfato
Sol-gel
cálcico, TiO2 y sílice
Producir superficies con
topografías específicas, mejorar
~10nm a 40m de capa de TiO2,
la resistencia a la corrosión,
Oxidación anódica adsorción e incorporación de
mejorar la biocompatibilidad,
aniones del electrolito
bioactividad o conductividad en
hueso.
~1m de capa fina de TiN, TiC, Mejorar la resistencia al
CVD TiCN, diamante y carbono como desgaste, resistencia a la
diamante. corrosión y compatibilidad.
Inducir respuestas específicas en
Modificación por titania
células y tejidos por medio de la
silanizada, fotoquímica,
Métodos bioquímicos inmovilización en la superficie de
monocapas autoensambladas,
péptidos, proteínas o factores de
proteínas
crecimiento.
Métodos físicos
Mejorar la resistencia al
~30 a 200m de capa de titanio,
desgaste, resistencia a la
Atomizador térmico HA, silicato cálcico, Al2O3, ZrO2,
corrosión y propiedades
TiO2
biocompatibles.
~1m de capa fina de TiN, TiC, Mejorar la resistencia al
PVD TiCN, diamante y carbono como desgaste, resistencia a la
diamante. corrosión y compatibilidad.
Modificar la composición de la
Implantación y deposición de ~10nm de superficie modificada superficie, mejorar la resistencia
iones y/o ~m de capa fina al desgaste y a la corrosión y
aumentar la biocompatibilidad.
1. Introducción 11
Métodos químicos
Existen muchos tratamientos químicos para modificar la superficie de los

materiales de Ti. En primer lugar, se puede hacer un pre-tratamiento ácido para
eliminar los contaminantes de la superficie y obtener acabados uniformes. Para este
pre-tratamiento se puede utilizar una mezcla de ácidos, compuesta por 10-30 % vol.
[17]
de HNO3 y 1-3 % vol. de HF . El ácido fluorhídrico ataca rápidamente al TiO2 y
reacciona con el Ti, formando fluoruros de titanio solubles e hidrógeno. La
incorporación del hidrógeno al Ti puede provocar la fragilización de la capa
superficial1 [18]
. Sin embargo, una relación de 10 a 1 de HNO3/HF puede minimizar la
formación de hidrógeno libre. Como resultado de estos tratamientos químicos, se
obtiene preferentemente una superficie de TiO2, pero suelen quedar residuos incluso
después de un tratamiento térmico. En esta misma línea de investigación, Wen y col.
han publicado que la bioactividad de las aleaciones de Ti se puede mejorar utilizando
la combinación de dos tratamientos químicos: 1º HCl + H2SO4 y 2º una disolución
[19]
alcalina . Este tratamiento da lugar a la formación de microporos bioactivos en la
superficie del Ti. Kim y col. introducen por primera vez el tratamiento con bases,
[20, 21]
previamente al tratamiento térmico . Este tratamiento consiste en definitiva en
sumergir los materiales en una disolución 5-10 M de NaOH o 10 M de KOH a 60°C
entre 1 y 24 horas. Posteriormente, se limpian con agua destilada y se secan al aire, a
40°C, durante 24 horas. A continuación, las muestras de Ti se tratan térmicamente,
entre 400-800°C, durante 1 hora. Este tratamiento forma una capa de apatita, muy
parecida al hueso, que es biológicamente activa (Figura 2).
1
La fragilización por hidrógeno ha sido definida como la pérdida de resistencia y ductilidad, inducida por el
hidrógeno, que puede derivar en la iniciación o propagación de fracturas mecánicas. La fragilización por
hidrógeno es especialmente devastadora, debido a la naturaleza del fallo originado. Dicho fallo sucede a
tensiones muy pequeñas (en comparación a las que serían necesarias en ausencia de hidrógeno) y tiene un
periodo de “incubación” tan variable que lo hace prácticamente impredecible.
Figura 2. Imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de superficies sin tratar, tratadas con
base, y con una base y posterior tratamiento térmico, de izquierda a derecha respectivamente [21].
Otro método químico que tiene como finalidad aumentar la bioactividad

superficial es el tratamiento con peróxido de hidrógeno. La superficie de Ti, en
contacto con un medio vivo, reacciona con el H2O2 presente en el medio,
[22, 23] [24]
produciendo geles Ti-peroxy que facilitan la formación de apatita . Cai y col.
tratan el Ti con H2O2 al 30% y HCl al 99% durante 30 minutos y lo lavan con agua
destilada. Posteriormente, lo sumergen en disoluciones de hasta 10 M de KOH a 60°C
durante 24 horas, y lo tratan térmicamente a 600°C durante 1 hora. Después, lo
sumergen durante 14 días en SBF (“simulated body fluid”, fluido simulado del cuerpo2)
a 37°C y queda depositada apatita en los poros de la superficie, induciendo la
diferenciación de las células MSCs en osteoblastos [25].
Entre los métodos electroquímicos que implican la modificación superficial se

encuentra por otro lado la oxidación anódica, que se utiliza para aumentar el espesor
de la capa de óxido de 3-7 nm a 100-1000 nm. Las ventajas del anodizado de Ti son,
entre otras, el aumento de la protección frente a la corrosión, la disminución de la
liberación de iones y la formación de una capa porosa. Las propiedades estructurales
y químicas de los óxidos formados por anodización, se pueden controlar variando
2
Este medio está compuesto por sales inorgánicas en las que están presentes tanto los iones calcio como los
iones fosfato.
1. Introducción 13
parámetros como el potencial del ánodo, la composición del electrolito, la

[16]
temperatura y la intensidad de corriente . Las principales reacciones de oxidación
en el ánodo son la disolución (oxidación) del titanio en la interfase Ti/TiO 2:
Ti ↔ Ti2+ + 2e-
y en la interfase TiO2/electrolito:
2H2O ↔ 2O2- + 4H+
2H2O ↔ O2 (gas) + 4H+ + 4e-
Los iones Ti2+ y O2- que se forman en estas reacciones redox son conducidos a
través del óxido por la aplicación de un campo eléctrico externo, dando como
resultado la formación de la capa de óxido (Ti2+ + 2O2- ↔ TiO2 + 2e-), siendo su
espesor proporcional al voltaje aplicado. Si el proceso de anodización se lleva a cabo a
potenciales por encima del límite de rotura, el óxido no resiste el flujo de corriente,
aumentando mucho la producción del gas y produciéndose, a menudo, explosiones.
Este tipo de anodización se suele llamar “Spark anodizing”: da lugar de forma típica a
capas de óxido menos uniformes y más porosas [16].
Yang y col. [26] combinan la oxidación anódica, en una disolución de H2SO4, con
un tratamiento térmico. De este modo consiguen superficies porosas de TiO 2 en fases
anatasa/rutilo, las cuales, al ser sumergidas en SBF, inducen la formación de apatita
en la superficie.
Todos estos tratamientos modifican en gran medida la superficie del titanio y

sus aleaciones en cuanto a rugosidad y composición, y como resultado se obtienen
superficies de TiO2 cuyas características dependerán de los tratamientos utilizados.
Métodos físicos
Los métodos físicos también producen cambios importantes en la superficie.

[27]
Un ejemplo sería la deposición hidrotermal de hidroxiapatita , que consigue
obtener películas de hidroxiapatita con espesor uniforme e integridad estructural.
Sin embargo, existe un método físico que modifica ligeramente la superficie del
titanio; la oxidación térmica. Con este método se consigue crecer la capa de óxido que
lo recubre, dependiendo de la temperatura y el tiempo de tratamiento. La oxidación
térmica se suele llevar a cabo en diferentes atmósferas, ya sea en atmósfera normal,
que contiene tanto oxígeno como nitrógeno, como en atmósfera de argón. Hwang y
col. estudiaron la influencia de la atmósfera utilizada, en la oxidación térmica de Ti en
función de la temperatura (500°C y 700°C). A altas temperaturas obtuvieron una
estructura compacta de rutilo y por debajo de 600°C, capas de TiO2 amorfas, las
[28]
cuales mostraron más tendencia a formar CaP que las capas con rutilo . En este
mismo sentido, Vaquila y col. confirmaron, por medio de espectroscopía Auger, que a
temperaturas inferiores a 200°C solo se detecta TiO2, mientras que a temperaturas
comprendidas entre 200°C y 350°C aparecen dos tipos de óxido de titanio: TiO 2 y Ti2O3
[29]
. El espesor de esta capa de óxido de titanio depende tanto de la temperatura
como del tiempo de exposición al oxígeno. Incrementando la temperatura, se
promueve la difusión del oxígeno hacia el seno del material, aumentando así la
oxidación global. Sin embargo, a altas temperaturas los átomos de oxígeno se
desorben de la superficie con la consecuente reducción del estado de oxidación del Ti.
Estas dos tendencias opuestas indican que debe haber un intervalo de temperatura
óptimo para conseguir la máxima oxidación. Lu y col. establecieron que el intervalo
[30]
donde se produce la oxidación máxima de la superficie está entre 227-327°C .
Cuando estos materiales se sumergen en una disolución acuosa, los grupos OH - unidos
[31]
a los cationes metálicos poseen propiedades ácido/base . Lo grupos OH- presentes
en la superficie del Ti favorecen el enlace con iones fosfatos a través de los iones Ca 2+
[32]
presentes en el medio fisiológico . Estos puntos sirven como anclaje de los
1. Introducción 15
osteoblastos, y por tanto, a mayor concentración de OH- en la superficie, mayor

adhesión celular [31].
Muchos de estos estudios han confirmado que estos tratamientos térmicos son
adecuados para conseguir una mayor adhesión celular [31, 32].
1.4 Estudio de la interfase Ti/medio fisiológico
En la superficie del titanio y en la de sus aleaciones se genera,

espontáneamente en contacto con el aire, una capa de óxido de titanio (TiO 2) que
recubre el material. Esta capa, cuyo espesor es de 3 a 7 nanómetros, confiere a estos
materiales propiedades tales como resistencia a la corrosión y capacidad de
repasivación, siendo químicamente inertes e incluso biocompatibles.
La superficie de óxido nativo de Ti sin tratar ha sido estudiada por McCafferty y

[33]
Wightman , encontrando que la superficie está protegida por tres tipos diferentes
de óxido de titanio. La parte más externa de la capa está formada por TiO2 y la parte
más interna por Ti2O3 y TiO. Por tanto, el Ti y sus aleaciones gracias a la fina capa de
óxido que poseen en su superficie son relativamente inertes y poseen buena
resistencia a la corrosión. Se podría decir que estos materiales no sufren “corrosión
importante” en entornos biológicos [16].
Cuando un material de Ti se introduce en un ser vivo, se pueden liberar

productos de corrosión e iones metálicos, debido a la interacción del biomaterial con
el medio fisiológico. Los procesos electroquímicos que tienen lugar en esta interfase,
pueden provocar daños, tanto en las inmediaciones del implante como en tejidos más
[34, 35]
alejados de él . Por esta razón, para que un implante tenga éxito es muy
importante conocer los procesos que tienen lugar entre el biomaterial y los distintos
componentes del medio celular.
16 1.4 Estudio de la interfase Ti/medio fisiológico
Cuando estos materiales se sumergen en una disolución acuosa, se producen

en la superficie una serie de cambios, dando lugar a grupos Ti-OH que tienen carácter
[31]
ácido o básico , como se muestra en la Figura 3. En esta figura, se muestra un
esquema de cómo interacciona el Ti con los iones H+ y OH- presentes en un medio
acuoso. Los OH- son atraídos por los átomos de Ti polarizados de la superficie del
biomaterial (ácidos de Lewis) mientras que los H+ son atraídos por los átomos de
oxígeno polarizados (bases de Lewis). La primera reacción hace que la superficie se
cargue negativamente, mientras que la segunda hace que se cargue positivamente. La
carga neta de la superficie va a depender del valor de pH de la disolución que se
utilice [36].
Capa pasiva Electrolito

Ti OH-
O H+
Ti OH-
Titanio O H+
Ti OH-
O H+
Ti OH-
O H+
Figura 3. Interfase formada entre la capa pasiva del Ti y una disolución acuosa. Marcado en azul,
coordinación simple del grupo OH- con el Ti (carácter básico); en rojo, coordinación doble formando
Ti2OH+ (carácter ácido).
En la mayoría de los casos la descripción de la carga de la superficie es más

compleja, ya que además de estos dos iones se pueden unir otros iones presentes en
el medio, así como moléculas de agua.
[37]
Boehm sugiere que debido a la quimisorción del agua hay dos tipos de
grupos -OH coexistiendo en la superficie de TiO2. Estas dos especies de -OH se
distinguen por la distinta manera de coordinarse con el Ti: si se coordina de manera
simple (Figura 3 recuadro azul) se dice que tienen carácter básico; si se coordina de
1. Introducción 17
manera doble (Figura 3 recuadro rojo) entonces tiene carácter ácido. Por tanto, si nos
basamos en los valores de pK de estos grupos, a pH fisiológico se esperaría que la
[38]
superficie de TiO2 estuviera cargada negativamente . Cuando esta superficie se
sumerge en una disolución de H2PO4-, las especies de fosfato que se forman pueden
ser Ti-H2PO4 o Ti-HPO4- [38].
Por otro lado, Takadama y col. argumentan que esta superficie está cargada
[39]
negativamente por distintas razones . Los grupos -OH presentes en la superficie a
pH 7,4 repolimerizan y condensan en unidades de titania cargados negativamente,
que posteriormente interaccionan electrostáticamente con la carga positiva de los
iones de calcio, dando como resultado la formación de un titanato de calcio amorfo.
Estos autores suponen que dicho compuesto gana una carga positiva e interacciona
con la carga negativa del fosfato presente en la disolución, formándose así un fosfato
de calcio amorfo que finalmente se estabiliza en apatita cristalina (similar al hueso),
[39]
con una relación Ca/P de 1,65 . Asimismo, la formación de depósitos externos de
Ca/P en la superficie de Ti impide el normal envejecimiento de la capa pasiva de TiO 2
[40]
. Sin embargo, la formación de una capa artificial de óxido de titanio ya sea por
anodizado [26] o por tratamiento térmico [41], mejora la formación de apatita frente a
la capa de óxido nativa del Ti.
Hanawa y Ota [42] han demostrado que, las superficies de titanio sólo adsorben
iones de calcio, fosfatos, oxígeno, grupos -OH y agua, aunque estén sumergidas en
disoluciones en las que haya otros tipos de iones. De esta manera, estudian la
formación y el crecimiento de capas de Ca/P en función del tiempo de inmersión y del
pH de la disolución. La composición de los depósitos de Ca/P a pH 7,4 varía en función
del tiempo, consiguiendo a los 30 días de inmersión, una composición muy cercana a
la de la hidroxiapatita. Por tanto, se puede concluir que las superficies de titanio, por
naturaleza, favorecen la formación de dicha apatita, aunque muy lentamente 3,

[42]
necesitándose períodos largos de inmersión . Uno de los precursores de la
hidroxiapatita es el fosfato de octacalcio; con él se puede formar una capa porosa en
la superficie de Ti, que mejoraría las propiedades de biocompatibilidad del implante
[43]
.
Otros autores plantean la posibilidad de acelerar el proceso de formación de

una capa de Ca-P en la superficie del Ti por medio de un tratamiento químico en dos
etapas. En la primera, la superficie de titanio se trata con ácidos y NaOH y en la
segunda se sumerge en disoluciones que contienen tanto iones calcio como iones
fosfato [44]. Con estos tratamientos consiguen una capa porosa y uniforme de Ca-P que
mejora la biocompatibilidad de las superficies de Ti. Es importante tener en cuenta
que la formación de una capa amorfa de TiO2 o una capa compuesta de cristales de
anatasa en la superficie de Ti favorece la formación de una capa porosa y uniforme de
Ca-P, mientras que si la capa de TiO2 está compuesta únicamente por cristales de
rutilo, la formación de esa capa no tiene lugar [28, 45].
Yang y col. [46] estudiaron la cinética de formación de la apatita sobre partículas

de TiO2 por medio de la microbalanza de cristal de cuarzo o QCM, obteniendo el
siguiente mecanismo: los iones Ca2+ del SBF (serum body fluid) son atraídos hacia la
interfase disolución/TiO2 que está cargada negativamente. A continuación, el titanato
de calcio formado en la interfase se combina con los iones fosfato formando núcleos
[46]
de apatita, a partir de los cuales se producirá la nucleación y su crecimiento . Esta
técnica ha permitido a Galli y col. demostrar que en presencia de proteínas en el
medio, los iones fosfato producen la desorción de las proteínas adsorbidas sobre
superficies de Ti [47].
3
Estos depósitos son muy beneficiosos para el comportamiento biológico de los biomateriales. Gracias a ellos,
los osteoblastos se encuentran en un entorno químico más parecido al del hueso, favoreciendo la
osteointegración del implante.
1. Introducción 19
Sin embargo, en los fluidos biológicos del cuerpo humano no solo están
presentes sales inorgánicas, sino multitud de componentes orgánicos como la
glucosa, aminoácidos, vitaminas y proteínas.
La glucosa es el carbohidrato más común y se clasifica como un monosacárido,

aldosa y hexosa. También es conocida como dextrosa, debido a que es dextrógira, es
decir, que es un isómero con la propiedad de desviar el plano de luz polarizada hacia
la derecha. La Figura 4 muestra la fórmula molecular de la D-glucosa. Es un
compuesto soluble en agua con una densidad de 1,54 g/cm3. Es un sólido blanco
cristalino con una constante dieléctrica mucho más alta que la de los lípidos, proteínas
y carbohidratos complejos, como la celulosa y el almidón.
Figura 4. Fórmula molecular de la D-Glucosa.
Hasta donde llega nuestro conocimiento, no existen estudios previos de la

interacción que se produce entre la superficie de titanio y la glucosa, contrariamente
a lo que sucede con las proteínas. Los estudios realizados sobre el titanio, en medios
fisiológicos, demuestran que las proteínas se adsorben rápidamente sobre la
[48-
superficie, compitiendo con los iones inorgánicos a tiempos largos. Varios autores
50]
han estudiado cómo influyen las moléculas biológicas en el comportamiento frente
a la corrosión de los materiales metálicos, concluyendo que:
 La adsorción de las proteínas sobre la superficie metálica modifica la

disponibilidad del oxígeno presente en la interfase biomaterial/fluido biológico,
lo que puede alterar las reacciones electroquímicas que tienen lugar sobre la
superficie metálica. Por un lado, la capa de proteínas adsorbida puede

dificultar la evolución de la reacción del oxígeno (disminuye la velocidad de la
reacción catódica), y por otro, puede dificultar la transferencia de carga
responsable de la disolución de la capa pasiva (reacción anódica), aumentando
la resistencia de polarización del biomaterial y disminuyendo la velocidad de
corrosión [48].
 La adsorción de proteínas puede generar capas compactas que actúan de
barrera impidiendo la difusión de los iones del metal desde la superficie de
este hacia el electrolito o la formación del óxido. Debido a la disminución de la
velocidad de la reacción anódica, se espera que la resistencia de corrosión
aumente.
 Las proteínas pueden unirse a los iones metálicos (formación de complejos
organometálicos) y transportarlos fuera de la interfase electrolito/biomaterial,
[49]
incrementándose la disolución del metal . Por consiguiente, al aumentar la
reacción de disolución del metal, disminuye la formación de la capa pasiva [50].
Figura 5. Estructura terciaria de la albúmina de suero bovino (BSA).
Una de las proteínas más comunes y más abundantes presentes en el medio

fisiológico (que se toma como modelo en la mayoría de las investigaciones), es la
1. Introducción 21
albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, BSA, Figura 5). Las proteínas están
compuestas por una serie de aminoácidos unidos mediante enlace peptídico. La
estructura básica de un aminoácido se compone de cuatro partes: un grupo amino (-
NH2), un grupo carboxílico (-COOH), un átomo de carbono central y una cadena
[51]
lateral. La BSA tiene una masa molecular de 66300 Da con dimensiones de 4 x 4 x
14 nm3 [52]. Esta proteína contribuye en un 80% a la presión osmótica de la sangre y es
la responsable del mantenimiento del pH. Su estructura globular se consigue
plegando su cadena polipeptídica, que contiene 585 aminoácidos, en tres dominios -
hélice [50]. Debido a su mayor concentración, en los fluidos fisiológicos con respecto a
otras proteínas presentes, la BSA es la primera que llega a la superficie del implante
de acuerdo con las leyes de transporte de masa, y por eso juega un papel muy
importante en la adsorción inicial de las proteínas sobre las superficies biomédicas. La
adsorción de la albúmina depende en gran medida de la superficie metálica y de las
condiciones externas que se tengan, por tanto se hace difícil extrapolar su
comportamiento en diferentes sistemas biológicos [50].
El papel de esta proteína en el proceso de adsorción de los depósitos de Ca/P a

la superficie del Ti ha sido estudiado por Serro y col. Estos autores indican que existe
una inhibición parcial de la formación de la apatita debido a la presencia de la BSA [53].
Por otro lado, dichos autores sugieren que cuando una muestra de Ti se pone en
contacto con una disolución en la que están presentes tanto proteínas, como iones de
calcio y fosfato, se produce en primer lugar la adsorción de la BSA seguido de la
[54] [55]
deposición de los iones . En este sentido, Lima y col. también llegan a la
conclusión de que los iones de cálcico y fosfato se incorporan a la superficie muy
lentamente, mientras que la BSA lo hace rápidamente. Aunque en la literatura existen
bastantes trabajos, en los que han estudiado el comportamiento electroquímico del Ti
y sus aleaciones en disoluciones que contienen BSA, las interacciones entre el suero
fetal bovino (fetal bovine serum, FBS) y las superficies de Ti no han sido del todo
[56]
aclaradas, dando lugar a resultados contradictorios . Esta disparidad de resultados
22 1.5 Estudio de la interfase Ti/Células
parece debida a que dichos trabajos se llevaron a cabo sobre diferentes acabados
superficiales de Ti. Teniendo en cuenta que, las interacciones entre el medio
fisiológico y la superficie de los biomateriales dependen, en gran medida, de la
morfología de la superficie del material como la rugosidad, topografía o textura de los
biomateriales, no es de extrañar que a veces los resultados sean tan diferentes.
Un paso más allá en la investigación es considerar el efecto de las células vivas

sobre la superficie metálica y su interacción con la misma. Esta interacción
condicionará la biocompatibilidad y el mecanismo de osteointegración del biomaterial
metálico.
1.5 Estudio de la interfase Ti/Células
1.5.1 Comportamiento celular ante el implante metálico o biomaterial
Cuando se pone en contacto el titanio con el medio celular, además de las

interacciones de los distintos componentes del fluido fisiológico, también tienen lugar
los procesos de adhesión, crecimiento y diferenciación de las células presentes en el
organismo vivo sobre la superficie del implante. Inmediatamente después de que un
biomaterial es implantado en el cuerpo humano, además de las interacciones de la
superficie con el agua y los iones, se ponen en marcha una serie de mecanismos de
defensa del sistema inmunitario. Los que primero detectan la presencia del implante
son los neutrófilos y los macrófagos, seguidos por la formación a partir de los
macrófagos activados de células gigantes de cuerpo extraño. A continuación, las
células osteoprogenitoras migran a las cercanías del implante, donde se diferencian a
osteoblastos, que forman el hueso.
La adhesión celular implica un primer contacto con la superficie del

biomaterial; posteriormente, la extensión de la célula que va seguida por una
secuencia de diferenciación y crecimiento celular. Las células se unen a proteínas
adsorbidas a la superficie por medio de moléculas de adhesión transmembrana, a
1. Introducción 23
[36]
sitios específicos de las proteínas . En orden cronológico, la interacción entre una
célula y la superficie se lleva a cabo en diferentes etapas:
1. En la superficie del biomaterial crece una interfase de acuerdo con sus

propiedades y con el entorno líquido en el que está sumergido.
2. Posteriormente se adsorbe una capa de proteínas que se estructura en
respuesta a las propiedades físico-químicas de la superficie.
3. Las células reconocen la capa de proteínas y reaccionan.
4. El tejido se estructura de acuerdo con las propiedades de las proteínas y
de la capa de células adheridas a la superficie.
Desde el punto de vista electroquímico, las células pueden afectar al proceso

de corrosión de los implantes metálicos con los que estén en contacto [57, 58], debido a
que los tejidos celulares segregan varios tipos de matriz extracelular. La matriz
extracelular suele estar compuesta por proteínas de adhesión como fibronectina,
elastina, integrinas y colágeno, glicosaminoglicanos como ácido hialurónico,
[59]
chondroitín sulfato, etc. y factores de crecimiento, que no solo actúan como un
andamio físico para la adhesión celular y la organización de estructuras celulares, sino
que hacen de mediadores de la señalización intracelular hasta los receptores de la
[60]
superficie celular . Por tanto, la matriz extracelular es necesaria para una buena
adhesión de las células al implante y su posterior osteointegración.
Desde el punto de vista biológico, el estudio de las interacciones que se

producen entre un biomaterial y un cultivo celular, puede realizarse según diversas
técnicas: entre ellas se encuentra la inmunofluorescencia, que nos proporciona
información de las distintas moléculas de adhesión (como por ejemplo integrinas) que
[61]
producen las células para adherirse a la superficie , o bien nos permite ver con
claridad tanto el núcleo como el citoplasma celular y así observar con detalle la
[62, 63]
preferencia de las células por los distintos biomateriales . También es frecuente
el uso de moléculas como la tetrametilrodamina metil éster, que es una sustancia
fluorescente que se une a la membrana mitocondrial en células saludables. Cuando se

altera el potencial de membrana mitocondrial, se produce una disminución de la
fluorescencia, factor que advierte de necrosis o de muerte celular programada
[64]
(apoptosis) . Otra manera de estudiar la adhesión y la viabilidad celular es
utilizando MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). Esta
molécula es metabolizada en la mitocondria de células sanas produciéndose un
cambio de color, de amarillo claro a azul oscuro, cuya concentración es directamente
proporcional a la cantidad de células metabólicamente activas [65]. Otra de las técnicas
más utilizadas para observar la adherencia de las células al sustrato en cuestión es el
microscopio electrónico de barrido [66].
Todas estas técnicas se centran en qué les sucede a las células como
consecuencia de su interacción con el biomaterial metálico, pero ¿qué sucede con el
biomaterial metálico?, ¿cómo le afecta la presencia de las células vivas? Entre las
técnicas utilizadas para estudiar la modificación superficial del biomaterial se
encuentran las técnicas electroquímicas y la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM).
1.5.2 Estudio de las interacciones electroquímicas de la interfase Ti/Células
El estudio electroquímico de la interacción entre la superficie de los

biomateriales metálicos y los cultivos celulares se puede llevar a cabo a través de
técnicas electroquímicas. Estas técnicas, permiten estudiar la cinética y los
mecanismos de adhesión celular sobre los materiales metálicos en función del grado
de recubrimiento celular y su efecto sobre las propiedades electroquímicas de la
interfase medio celular/superficie metálica. En la bibliografía se recogen
investigaciones sobre las interacciones electroquímicas existentes entre el implante y
las células para el Ti y sus aleaciones cuando se ponen en contacto con diferentes
[67]
tipos de líneas celulares, como por ejemplo células tipo osteoblastos U-2 OS ,
[68] [59]
osteoblastos humanos Saos-2 y fibroblastos L929 . Concretamente Hiromoto y
col. [59] han estudiado, cómo se ven afectadas las propiedades electroquímicas de una
1. Introducción 25
superficie de Ti (pulida a 600 grit), en presencia de fibroblastos L929. Estos autores

han obtenido que, la densidad de corriente anódica se mantiene invariable en
presencia de células, mientras que la densidad de corriente catódica disminuye. Por
tanto, concluyen que el efecto que provocan las células sobre la superficie de Ti es
ralentizar la difusión de las moléculas e iones a través de la matriz extracelular creada
por la secreción celular, mientras que la reacción anódica está limitada por la
pasividad de la capa de óxido. Sin embargo, este comportamiento no está del todo
[69]
claro, ya que los mismos autores en otro trabajo han obtenido un aumento de la
densidad de corriente anódica en presencia de fibroblastos L929, concluyendo que se
acelera la reacción anódica debido al efecto acomplejante de las proteínas presentes
en el medio.
El potencial de corrosión es otra variable que se ve afectada por la presencia de

células en las superficies de titanio. Este parámetro genera controversia ya que como
[59]
se ha comentado, se han obtenido resultados dispares. Así, Hiromoto y col. y
[68]
García-Alonso y col. obtienen una disminución del potencial de corrosión en
presencia de células, mientras que otros autores obtienen el efecto contrario [69].
Huang [67] ha estudiado in situ el crecimiento de osteoblastos U-2 OS sobre Ti,

así como sobre la aleación Ti-6Al-4V durante 72 h., utilizando la espectroscopía de
impedancia electroquímica (electrochemical impedance spectroscopy, EIS). Los
resultados mostraron, un aumento en la impedancia y la resistencia de polarización
de los biomateriales, a medida que las células evolucionan hacia los diferentes
estadíos de adhesión, extensión y proliferación. No obstante, en los diagramas de
impedancia no se observaron claramente dos constantes de tiempo. Sin embargo,
[68]
MC. García–Alonso y col. han obtenido dos constantes de tiempo claramente
diferenciadas en los diagramas de impedancia, a partir del cuarto día de incubación de
osteoblastos Saos-2, sobre la aleación de Ti-6Al-4V. La primera constante de tiempo
está relacionada con la presencia de las células sobre la superficie, mientras que la
segunda corresponde a la capa pasiva formada sobre la aleación de Ti-6Al-4V.
Mustafa y col. [70] han demostrado, que a tiempos largos de incubación, con células de
hueso de mandíbula humana (28 días), los iones de fósforo y calcio se incorporan a la
estructura de la capa de TiO2. Estas conclusiones son importantes, puesto que el fin
de todos estos estudios es la osteointegración del biomaterial en la estructura del
hueso.
Un aspecto que no podemos olvidar, ya que afecta al comportamiento celular,

es el acabado superficial del implante metálico. En este sentido se han llevado a cabo
estudios de adhesión y supervivencia celular sobre distintos acabados o
[71]
modificaciones superficiales del titanio. Demetrescu y col. han realizado ensayos,
con fibroblastos humanos, sobre dos acabados superficiales de Ti: Ti nativo pulido con
papel de lija 2400 y una superficie de nanotubos de TiO 2 obtenida por anodizado.
Estos autores concluyen que, la velocidad de corrosión es menor en el caso de la
superficie de nanotubos de TiO2 que en la superficie nativa, coincidiendo con mayores
valores de impedancia. Curiosamente, las células tienen una ligera preferencia por la
superficie nanoestructurada frente al óxido nativo. En este mismo sentido, Huang y
col. [72] mantienen que, el valor de la impedancia electroquímica para el Ti anodizado
(nanoestructurado), es de 2 a 4 veces superior al Ti sin tratamiento, durante los 5
primeros días de inmersión en un cultivo de osteoblastos U-2 OS. Además, para las
muestras tratadas se obtiene mejor extensión celular y biocompatibilidad. Por otro
[73]
lado, Karpagavalli y col. han comprobado que la electrodeposición de TiO2
nanoestructurado sobre Ti6Al4V, en contacto con un cultivo de células de músculo de
aorta humana, aumenta la resistencia a la corrosión y disminuye la velocidad de
corrosión de la superficie electrodepositada con respecto a la aleación sin tratar.
Otra manera de favorecer la biocompatibilidad de un implante sería, como ya

señalamos anteriormente, modificar la superficie del biomaterial con tratamientos de
oxidación térmica, aumentando el espesor de la capa de TiO 2 [74].
1. Introducción 27
1.5.3 Estudio de la adhesión celular mediante la microbalanza de cristal de

cuarzo (QCM)
Una técnica muy sensible capaz de medir con gran sensibilidad variaciones de
masa y que permite caracterizar la interfase Ti/células es la microbalanza de cristal de
cuarzo (quartz crystal microbalance, QCM). Esta técnica permite medir con gran
sensibilidad los cambios de masa en la superficie de cristales de cuarzo o sensores de
QCM. El registro de la frecuencia de resonancia del cristal de cuarzo a lo largo del
tiempo está relacionada linealmente con el cambio de masa en la superficie, por
[75]
medio de la ecuación de Sauerbrey . Sin embargo, esta ecuación es válida para
pequeñas variaciones de masa que impliquen un cambio de frecuencia inferior al 2% y
[76] [77]
depósitos no viscosos. En 1993, Gryte y col. y Redepenning y col. fueron los
primeros en resaltar que las células depositadas o adsorbidas sobre los sensores de
cuarzo no pueden ser tratados como una masa rígida ideal. Las células deben ser
consideradas como una masa viscosa similar a un fluido. Se estima que una monocapa
de células sobre un cristal de cuarzo de frecuencia de resonancia 5 MHz tiene un
espesor de 1m y que la densidad de las células es de 1 g·cm-3, entonces debería dar
lugar a un incremento de frecuencia teórico, si pudiera ser aplicada la ecuación de
[77]
Sauerbrey, de 5600 Hz . Sin embargo, los resultados experimentales son, en
general, de al menos un orden de magnitud inferior a este valor. Esto es debido a que
las células se comportan como depósitos viscoelásticos y aunque no existe una
relación directa entre la masa de las células y el cambio en la frecuencia de
resonancia, se puede relacionar el recubrimiento celular con el incremento de
[77]
frecuencia . Por otro lado, no es posible estudiar multicapas de células debido a
que la señal está completamente extinguida a distancias mayores de 1 m [78, 79].
[80]
Wegener y col. llevaron a cabo un estudio detallado de adhesión celular
basándose en el análisis de la frecuencia utilizando tres líneas celulares diferentes
(células MDCK I y II y fibroblastos 3T3). Estos autores confirman las suposiciones de
[77]
Redepenning , en las que la disminución de la frecuencia está relacionado con el
número de células que están en contacto con la superficie. Ahora bien, durante el
proceso de adhesión celular, éstas se unen tanto a la superficie como a otras células
cercanas por medio de su citoesqueleto de actina en determinados puntos; de esta
manera, la mayoría de la superficie celular no está en contacto con la superficie del
sustrato: lo que detectamos no es el total de la masa adsorbida, sino una pequeña
[81]
fracción de la misma . Como el mecanismo y la velocidad de adhesión son
diferentes para cada tipo celular, esa fracción de masa adsorbida a la superficie
variará, como refleja la disparidad de resultados obtenidos en la bibliografía.
Teniendo esto en cuenta, se han realizado estudios en los que se relacionan los
cambios en la frecuencia con el número de células realmente adheridas a la superficie
[82-84]
. Así, Marx Kenneth y col. [84] lavan dos veces con PBS, obteniendo las células que
no se han adherido a la superficie y a continuación, realizan dos ciclos de tripsinación
y posterior lavado con PBS, contabilizando de esta manera el número real de células
adheridas a la superficie. También se ha registrado la variación de frecuencia durante
[85]
el despegue celular, producido por la adición de tripsina . En este mismo sentido,
[76]
Gryte y col. han conseguido medir la variación de frecuencia producida por el
despegue celular, añadiendo una cantidad determinada de NaOH, obteniendo
variaciones de frecuencia inferiores a los obtenidos en el proceso de adhesión ya que
el NaOH hace que se despeguen las células, pero no elimina toda la matriz
extracelular que han secretado dichas células.
También debemos comentar que en las etapas iniciales de adhesión de los

distintos tipos celulares se da una disminución en la frecuencia, debida a la adhesión
de las células a la superficie. Sin embargo, a tiempos más largos, se obtiene un
aumento de frecuencia alcanzando valores por encima del valor de la frecuencia
[81]
inicial . Según Galli-Marxer y col. estas variaciones no están relacionadas con el
despegue de las células adheridas al cristal, sino que es debido al cambio de las
propiedades viscoelásticas de las células con el tiempo [81].
2. Objetivos y Plan de Trabajo
2. Objetivos y plan de trabajo 31
Las primeras etapas de interacción del medio fisiológico con el biomaterial

metálico tienen una gran importancia en la posterior aceptación o rechazo de dicho
biomaterial. El objetivo principal de esta Tesis será estudiar las interacciones que se
establecen entre cada uno de los componentes del medio fisiológico y la superficie
metálica de titanio, además de los cambios que se producen en la superficie de Ti en
presencia de osteoblastos, en función del tiempo de exposición; el fin no es otro que
conocer los procesos que tienen lugar en la interfase formada durante los estadíos de
adhesión, proliferación y crecimiento, así como la propagación y confluencia celular.
Concretamente, se han llevado a cabo los siguientes objetivos:
- Caracterización superficial de dos acabados diferentes de titanio: 1) titanio

evaporado sobre cristales de cuarzo (Ti-Q) y 2) titanio tratado térmicamente (Ti-TT),
por medio de la microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía de fuera
atómica (AFM) y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS).
- Estudio de las interacciones que se producen entre la superficie de titanio (Ti-

Q y Ti- TT) y cada uno de los componentes del medio de cultivo celular en el que se
desarrollan los osteoblastos (Saos-2), en la primera semana de inmersión, mediante
técnicas electroquímicas, XPS y la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM).
- Análisis de las interacciones entre la superficie de titanio (Ti-Q y Ti-TT) y

osteoblastos Saos-2 vivos en función del tiempo de exposición, con el fin de investigar
la interfase formada durante las distintas etapas de adhesión, proliferación y
crecimiento, así como la confluencia celular mediante técnicas electroquímicas y SEM.
- Cinética de adhesión de los osteoblastos sobre el Ti-Q mediante la QCM,

técnicas electroquímicas y SEM.
3. Materiales y métodos
3. Materiales y métodos 35
3.1 Materiales
3.1.1 Electrodos
3.1.1.1 Electrodos de trabajo
El material ensayado en el presente trabajo de investigación fue Titanio

obtenido mediante distintos procesados:
Ti-Q: Se emplearon cristales de cuarzo de corte AT de 10 MHz de Maxtek Ink.,

Santa Fe Springs, CA, USA, de 25 mm de diámetro, recubiertos por 300 nm de titanio
depositado en fase vapor en ambas caras. La disposición de los electrodos es
asimétrica, siendo sus áreas geométricas circulares 1,370 cm2 (cara superior) y 0,370
cm2 (cara inferior).
Figura 6. Cristal de cuarzo con electrodos de Ti.
Ti-TT: Se utilizaron fueron discos de Ti de grado 4 cortados perpendicularmente

a la dirección de una barra de 30 mm de diámetro suministrada por Goodfellow
Cambrigde (Inglaterra). La composición química nominal de las barras es la siguiente
(en % en masa): 99,475 % de titanio 0,010 % de carbono, 0,015 % de hidrógeno, 0,400
% de oxígeno, 0,050 % de nitrógeno y un 0,050 % de hierro. La superficie de las
muestras se desbastó utilizando diversos papeles de lija de finura de grano creciente,
600 y 1200 grit, y se finalizó con un pulido fino con pasta de diamante de 9 m y 1 m
de tamaño de partícula. Posteriormente, los discos de Ti se lavaron con agua destilada
36 3.1 Materiales
y seguidamente con etanol en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos.

Finalmente, se dejaron secar a temperatura ambiente. Estas muestras se
denominaron titanio másico (Ti-m).
Las muestras de Ti-m se sometieron a un tratamiento térmico a 277°C durante

5 horas siguiendo el programa de temperatura que se muestran en la Figura 7. La
rampa de calentamiento fue de 2,86°C/min hasta alcanzar en 1 hora 30 minutos la
temperatura elegida de 277°C, donde las muestras de titanio permanecieron durante
5 horas. Posteriormente, se disminuyó la temperatura siguiendo una rampa de
enfriamiento de 2,14°C/min durante 2 horas hasta alcanzar temperatura ambiente,
aproximadamente 20°C. Las muestras así tratadas, se denominarán titanio tratado
térmicamente (Ti-TT). El área del electrodo de trabajo expuesta al medio fue de 0,79
cm2.
Figura 7. Programa de temperatura aplicado a las muestras de titanio másico (Ti-m).
Para eliminar cualquier interferencia (contaminación) en las medidas realizadas

en medios biológicos y con osteoblastos, la superficie de cada cara de los distintos
electrodos de trabajo (Ti-Q y Ti-TT) se esterilizaron con luz ultravioleta durante 15

minutos en una campana de flujo laminar.
3.1.1.2 Electrodos de referencia
El electrodo de referencia se utiliza para medir la diferencia de potencial de la

interfase metal/disolución de forma relativa y tiene un valor de potencial estable y
reproducible. La estabilidad del potencial del electrodo de referencia se debe a un
sistema redox en contacto con una disolución tampón o saturada. Las propiedades
que debería satisfacer un electrodo de referencia son un valor reproducible del
potencial y una reacción termodinámicamente bien definida, no polarizable y de fácil
uso [50]. En este trabajo, se empleó un electrodo de referencia de Ag/AgCl (E / 0,224 V
vs ENH) para las medidas electroquímicas realizadas en presencia de los componentes
del medio fisiológico. Sin embargo, para los ensayos electroquímicos en presencia de
células osteoblásticas, se utilizó un electrodo de platino, como pseudoreferencia,
debido a que las condiciones de esterilización (120°C y 1 atm) pueden modificar las
características de los electrodos de referencia, como calomelanos o Ag/AgCl utilizados
habitualmente en los ensayos electroquímicos.
3.1.1.3 Electrodo auxiliar o contraelectrodo
Como electrodo auxiliar o contraelectrodo se utilizó un hilo de platino

enrollado sobre sí mismo, para conseguir un área considerablemente mayor que la del
electrodo de trabajo y evitar polarizaciones indeseadas.
3.1.2 Celda electroquímica
Para realizar los ensayos electroquímicos sobre las distintas superficies de Ti se

utilizó una celda electroquímica de tres electrodos [86]. Generalmente, en las medidas
electroquímicas con biomateriales se suelen utilizar células electrolíticas
38 3.1 Materiales
convencionales con dos cuerpos de vidrio, ubicándose en la parte superior los

electrodos de trabajo (biomaterial), referencia y auxiliar. Sin embargo, estas células
no permiten el estudio “in situ” del comportamiento frente a la corrosión de
biomateriales metálicos en contacto con el medio celular, ya que el electrodo de
referencia, normalmente de calomelanos o de cloruro de plata, no soporta las
elevadas temperaturas de esterilización necesarias para trabajar con cultivos
celulares. Otro inconveniente es la disposición vertical del electrodo de trabajo, que
imposibilita la adhesión celular y por tanto, el estudio del mecanismo y la cinética de
corrosión del biomaterial en contacto con el medio celular.
Para solventar estos inconvenientes, se utilizó la célula electrolítica de la Figura

[86]
8 para todos los ensayos, que consta de una base de teflón con dos piezas, entre
las que se aloja horizontalmente el electrodo de trabajo conectado eléctricamente
con el exterior mediante un contacto de cobre. La unión entre el electrodo de trabajo
y las piezas de teflón se realizó por medio de una junta tórica de silicona, la cual no es
nociva para los cultivos celulares [85]. La fijación exterior de ambos elementos se llevó
a cabo mediante cuatro tornillos. En la pieza superior de teflón se enrosca la celda
electroquímica de vidrio (ajustando de nuevo con una junta tórica de silicona) de
doble pared para mantener la termostatización deseada (25°C o 37°C). En la parte
[86]
superior, la celda tiene tres bocas para insertar el ER y el CE y añadir el medio de
cultivo celular. Además, existen dos uniones Luer que permiten la entrada y la salida
de aire al 5% de CO2, atmósfera necesaria para mantener las condiciones ambientales
adecuadas en estos cultivos.
Para eliminar cualquier interferencia (contaminación) en las medidas realizadas

con medios biológicos y con osteoblastos, la celda electroquímica se esterilizó a 1 atm
y 120°C durante 30 minutos. Este proceso de esterilización se llevo a cabo en un
autoclave.
Figura 8. Partes de la celda electroquímica [86] y muestras de los dos acabados de Ti (imagen superior)
y celda electroquímica en su conjunto (imagen inferior).
40 3.2 Reactivos y disoluciones
3.2 Reactivos y disoluciones
Los reactivos empleados en el presente trabajo se detallan en la siguiente

tabla.
Tabla 6. Relación de reactivos utilizados en los ensayos realizados en el presente trabajo.

Reactivo Pureza (%) Marca
NaH2PO4·H2O 99 Merck
NaCl 99 Merck
CaCl2·2H2O 99 Merck
D-Glucosa 99,5 Sigma-Aldrich
DMEM - Cambrex Biowhittaker
BSA 96 Sigma-Aldrich
FBS - Cambrex Biowhittaker
Penicilina/ Estreptomicina - Gibco
Tripsina-EDTA 0,25 Gibco
Etanol 96 Panreac
Etanol absoluto Panreac
Tetrametilsilano (TMS) 99,7 Merck
Para estudiar la interacción de los distintos componentes del medio fisiológico

con la superficie de Ti, se utilizó como referencia la composición del medio de cultivo
celular “Dulbecco´s modified eagle’s médium” (DMEM) (Anexo 7.1). El medio de
cultivo de los osteoblastos, en nuestro caso, está compuesto por DMEM (sin rojo
fenol) y completado por un 10% (v/v) de FBS (composición en el Anexo 7.2) y un 1%
de penicilina-estreptomicina para evitar contaminación bacteriana. En nuestro caso,
el DMEM utilizado no contiene rojo fenol pues se comprobó que aceleraba los
procesos de corrosión del titanio. A este medio completo le denominaremos DMEMc.
De todos los componentes de dicho medio centramos la atención en ciertas sales
inorgánicas como el NaH2PO4 y el CaCl2, y compuestos orgánicos como glucosa y la
albúmina (BSA). En la Tabla 7 aparecen las disoluciones empleadas en los distintos
ensayos. Todas las disoluciones fueron ajustadas a un pH de 7,4 con una disolución de
NaOH 0,1M, antes de ser utilizadas.
Posteriormente, se llevaron a cabo ensayos con DMEMc y con DMEMc en

presencia de Osteoblastos Saos-2.
Tabla 7. Composición de los distintos medios utilizados para los estudios electroquímicos y
nomenclatura de las disoluciones.
Disoluciones NaCl NaH2PO4 CaCl2 Glucosa BSA

(mM) (mM) (mM) (mM) (g·l-1)
NaH2PO4 (disolución P) 110 0,91 --- --- ---
NaH2PO4 + CaCl2
110 0,91 1,80 --- ---
(disolución PCa)
NaH2PO4 + CaCl2 + Glucosa 110 0,91 1,80 25,00 ---

(disolución PCaG)
NaH2PO4 + CaCl2 + BSA 110 0,91 1,80 --- 2,52

(disolución BSA)
FBS (disolución FBS)* 110 0,91 1,80 0,57 2,52

*Entre otros componentes, ver Anexo 7.2.
3.3 Fundamento teórico de las técnicas utilizadas
3.3.1 Técnicas de caracterización
3.3.1.1 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS)
La espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS) es uno de los métodos de

caracterización de superficies más ampliamente utilizado en la actualidad. Esta
técnica está basada en el efecto fotoeléctrico, el cual fue observado originariamente
en superficies de metales fácilmente ionizables, tales como metales alcalinos. El
origen de la técnica se debe, fundamentalmente, al descubrimiento del efecto
42 3.3 Fundamento teórico de las técnicas utilizadas
fotoeléctrico (Hertz, 1887) y a la interpretación cuántica del efecto fotoeléctrico

(Einstein, 1905). Sin embargo, la técnica tal y como la conocemos ahora, no fue
desarrollada hasta los años 60, particularmente por Siegbahn, Turner y Price.
La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X es una extensión del efecto

fotoeléctrico, que se basa en la irradiación de la muestra con rayos X blandos (de baja
energía h. Esto provoca la emisión de fotoelectrones con una energía de ligadura,
EB:
Siendo hla energía de los fotones, EK la energía cinética del fotoelectrón

emitido, W la función de trabajo del espectrómetro y EB la energía de ligadura,
parámetro que identifica al electrón de forma específica, en términos del elemento y
nivel atómico.
Los componentes más importantes de un espectrómetro fotoelectrónico de

rayos X son: una cámara de ultra-alto vacío, donde se produce el bombardeo de la
muestra con fotones, una rejilla de salida, por donde salen los electrones emitidos; un
analizador de energía de los electrones; un detector de electrones y un registrador.
Cuando se bombardea la muestra en la cámara de ultra-alto vacío, los fotoelectrones
se emiten en todas direcciones. Algunos pasan a través de una rejilla de salida y a
continuación el analizador de energía de los electrones los separa de acuerdo con su
energía cinética. Los electrones llegan al detector y el espectro registrado es el
número de electrones por unidad de tiempo (cuentas por segundo) como una función
de la energía de ionización o de la energía cinética de los fotoelectrones.
El XPS es una técnica espectroscópica cuantitativa, que permite analizar, en

una superficie determinada, los elementos presentes y su estado de oxidación,
indicando los elementos que se encuentran en las primeras capas de átomos (10 nm).
Esta profundidad de análisis depende del recorrido libre medio de los electrones en el
interior del sólido, siendo característico de cada elemento y dependiendo de la

energía cinética de los fotoelectrones que se están midiendo. Se pueden realizar
estudios de perfiles de profundidad eliminando progresivamente capas externas de
átomos con el bombardeo de átomos de argón [87].
3.3.1.2 Microscopía de fuerza atómica (AFM)
La microscopía de fuerza atómica (atomic force microscopy, AFM; desarrollada

por Binning, Quate y Gerber en 1986) es una técnica microscópica que se engloba
dentro de las microscopías de sonda de barrido (scanning probe microscopy, SPM),
entre las que también se encuentra la microscopía de efecto túnel (scanning tunnel
microscopy, STM; Binning y Rohrer, Premio Nobel de Física en 1982) entre otras.
Figura 9. Cantiléver y punta de AFM.
El primero de los microscopios de sonda de barrido fue el STM. Sin embargo, el

principal problema que presenta es que su uso queda restringido a muestras
metálicas o semiconductoras, pues para que los electrones puedan atravesar la
barrera por efecto túnel tienen que estar cerca del nivel de Fermi. Esta restricción fue
superada por el AFM, cuyo funcionamiento es similar al STM, con la salvedad de que
el parámetro que se emplea para evaluar la muestra no es la corriente túnel, sino la
fuerza de atracción y repulsión entre la punta y la muestra. Las puntas suelen ser de 2
micras de largo y menos de 100 Å de diámetro (Figura 9). Para mantener constante la
fuerza entre la punta y la muestra y poder medir sus variaciones, se monta la punta en
el extremo de una micropalanca flexible o cantiléver (100-200 micras de largo), cuya
deflexión es proporcional al desplazamiento entre punta y muestra: ésta se mide
mediante la reflexión de un láser en el extremo de la micropalanca y que incide sobre
un detector de diodos. Si se mantiene constante la deflexión, se registran los cambios
de posición del láser en el detector, obteniéndose la imagen (Figura 10). Varias son las
fuerzas que contribuyen a la flexión del cantiléver, siendo la más común la fuerza de
van der Waals. Este tipo de medida puede ser aplicada tanto a materiales aislantes,
como a semiconductores o conductores [88].
Figura 10. Esquema de un microscopio de fuerzas atómicas.
La unidad de AFM está constituida, fundamentalmente, por la cabeza óptica

(que incluye el láser y el sistema de detección), el escáner con el conjunto punta-
muestra (la base del AFM), la unidad electrónica de control (o realimentación) y un
ordenador desde el cual, gracias al software del microscopio, se regulan los

parámetros de operación del AFM y la adquisición de resultados.
Existen tres modos de operación básicos en AFM: modo de contacto

(dinámico), de no contacto (estático) y de contacto intermitente o “tapping”
(dinámico). Estos tres modos de operación se diferencian en la magnitud y tipo de
fuerzas que se establecen entre punta y muestra. En el modo de no contacto, a
medida que se acerca la punta a la muestra, empiezan a actuar las fuerzas atractivas o
de Van der Waals. En el modo de contacto, se sigue acercando la punta a la muestra
hasta que en un momento determinado, la punta toca la superficie de la muestra y
comienzan a aparecer las fuerzas de repulsión por solapamiento de las nubes de
electrones de la punta y la muestra. La magnitud de las fuerzas que intervienen es
muy distinta. En el caso del modo de contacto es del orden de 10 -7N, mientras que en
el régimen de no contacto es del orden de 10-13N. Debido a esta diferencia, el modo
de no contacto presenta peor resolución topográfica que el modo de contacto. Sin
embargo, el modo de contacto presenta limitaciones cuando las muestras son muy
blandas o delicadas, por ejemplo, muestras biológicas. Una solución a estas
limitaciones, es el modo intermitente o “tapping”, que combina ambos modos.
Durante el barrido, la punta toca alternativamente la superficie y se levanta a una
frecuencia entre 5·104 y 5·106 ciclos/s. De esta manera, se mejora la resolución
topográfica al tocar la superficie (contacto) pero se evita dañarla cuando son
muestras delicadas (no contacto) [88].
3.3.1.3 Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microanálisis por

dispersión de rayos X (EDX)
El principio fundamental de un microscopio electrónico de barrido (SEM) es el

empleo de un haz fino de electrones, procedente de un filamento de wolframio, para
incidir sobre la superficie de un material de naturaleza conductora [89]. Los electrones
que salen del cátodo, constituido por un filamento incandescente, atraviesan en su
marcha un medio de concentración, lentes electromagnéticas de forma cilíndrica y

son atraídos por el ánodo, al que se le ha impuesto un potencial negativo, que obliga
a los electrones a agruparse en un punto. El haz de electrones primarios incide
posteriormente en la muestra.
Al someter a la muestra, a este bombardeo de electrones primarios (haz de

electrones incidente) se originan, entre otros los siguientes procesos:
-Desprendimiento y formación de electrones secundarios.
-Desprendimiento y formación de electrones electrodispersados.
Los efectos de contraste topográfico de la superficie son debidos a los

electrones secundarios que salen de la banda de conducción, formándose a lo largo
de todo el recorrido del haz sobre la muestra. La señal obtenida varía gradualmente
con los cambios locales de la pendiente de la superficie. En el contraste topográfico
las zonas más elevadas y más brillantes son aquellas donde existe mayor
concentración de electrones, como por ejemplo los vértices y aristas, mientras que las
más oscuras corresponden a valles o zonas más bajas. Por tanto, desplazando el haz
de electrones sobre la superficie y recogiendo las señales producidas en cada punto,
es posible obtener un mapa topográfico de dicha superficie.
Los electrones electrodispersados dejan vacantes en niveles internos de

energía. El ion resultante, se estabiliza rellenando la vacante con un electrón de nivel
superior y la diferencia de energía entre los orbitales electrónicos implicados es
emitida en forma de radiación X. Los rayos-X producidos tienen una energía que
corresponde exactamente a una transición electrónica específica para cada elemento.
Dichos valores de energía, dan lugar a las líneas características del elemento o
radiación característica. Dependiendo del nivel energético del orbital atómico al que
lleguen los electrones, tenemos las líneas K, L, M. La energía de estas líneas es función
del número atómico de los elementos, lo que nos permite identificarlos y distinguirlos
en un espectro de dispersión de rayos X (energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX).

Por tanto, la espectroscopía de dispersión de rayos-X proporciona información
analítica sobre la composición del total o de zonas de la muestra de hasta unas
cuantas micras de diámetro y unos 3 nm de profundidad, aplicándose para identificar
o confirmar elementos o sustancias tanto conocidas como desconocidas en la
superficie de dicha muestra.
3.3.2 Experimentación con cultivos celulares
Con el fin de estudiar el proceso de interacción entre las células vivas del
organismo y el material del implante se recurre a los denominados experimentos “in
vitro” (“en vidrio” = en el laboratorio); es decir, ensayos con cultivos celulares.
En el último siglo, se han desarrollado metodologías para aislar células y

obtener, a partir de ellas, poblaciones homogéneas que luego puedan ser analizadas e
incluso multiplicarse “in vitro”. Esto ofrece ventajas tanto en la investigación básica,
pues permite estudiar diversos procesos que ocurren en las células, como en la
investigación aplicada, produciendo moléculas de interés e ingeniería de tejidos, entre
otras.
La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir,

multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciales, si se les provee de un
medio apropiado en una placa de cultivo. Así, las células pueden ser observadas
continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente para explorar los
efectos producidos al agregar o eliminar moléculas específicas al medio celular (tales
como hormonas o factores de crecimiento) [90].
El cultivo de tejidos y células fue iniciado en 1907 por el zoólogo americano

Ross Harrison, de la Universidad Johns Hopkins. Este investigador publicó un breve
[91]
pero crítico artículo (“Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo”) que
introdujo exitosamente una nueva técnica para demostrar experimentalmente cómo

se originan las fibras nerviosas: el cultivo de tejidos. Además de argumentar
sólidamente la “doctrina neural”, resolvió los problemas básicos del cultivo celular,
como el medio, la observación y la contaminación.
Actualmente, los cultivos se establecen principalmente a partir de

suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos.
A diferencia de las bacterias, la mayoría de las células obtenidas de tejidos no

están adaptadas para vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida sobre la
cual crecer y dividirse. Para los cultivos celulares este soporte es la superficie de una
placa de cultivo de poliestireno. Los contenedores con el cultivo se mantienen en un
incubador a 37°C en una atmósfera de 5% de CO 2. Aun así, a veces el crecimiento y la
diferenciación de las mismas sólo se logra recubriendo el soporte plástico con
componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las células en
los tejidos, con la cuál interactúan), como por ejemplo colágeno y laminina.
Los cultivos se pueden clasificar en: cultivos primarios y secundarios. Los

primarios son aquellos cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un
organismo, sin proliferación “in vitro”. Este tipo de cultivo puede iniciarse con o sin
fraccionamiento para separar los distintos tipos celulares. En la mayoría de los casos,
las células de los cultivos primarios, pueden ser despegadas del recipiente de cultivo a
uno nuevo, donde proliferarán para formar varios cultivos secundarios. En estas
condiciones, las células suelen crecer hasta cubrir la superficie del recipiente de
cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor), donde como
consecuencia del contacto entre las células se detiene temporalmente su
proliferación, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco; así podrán
subcultivarse durante semanas o meses. En este estadío, las células frecuentemente
mostrarán distintas propiedades en función de su origen. Por ejemplo, los fibroblastos
(células que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos
animales) secretarán colágeno o las células derivadas del tejido muscular esquelético
se fusionarán, para así generar fibras musculares con capacidad contráctil
espontánea. Gracias a que estos fenómenos ocurren en cultivo es posible estudiarlos
con diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos intactos.
La mayoría de las células de los vertebrados cesan su división celular a partir de

un número finito de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular
[92]
. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y
40 veces en cultivo, antes de detenerse. Algunas células pueden frenar sus divisiones
celulares como consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos
de control” (check points) del ciclo celular [93]. Para inmortalizar estas células, hay que
lograr la inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos
“oncogenes” (genes promotores del cáncer) que pueden ser obtenidos de virus
cancerígenos (como algunas cepas de HPV o virus del papiloma humano, adenovirus,
etc.). Estas líneas celulares son muy útiles en la investigación, como fuente de un gran
número de células uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en
nitrógeno líquido (a -196°C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo su
viabilidad, constituyendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de
una investigación.
Además de la obtención de ciertas líneas celulares, otro aspecto que ha

evolucionado en gran medida ha sido la elección de un medio de cultivo adecuado
para la supervivencia de las células. Hasta los años ´70, el cultivo de tejidos parecía
resultar de la fusión entre la ciencia y la brujería. Poco a poco, los fluidos coagulados
fueron reemplazados por placas con medios líquidos que contenían pequeñas
cantidades de una serie de moléculas necesarias para la supervivencia y multiplicación
celular: sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas; además, la mayoría de los medios
incluían una mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma de
suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios
se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de rutina, generando la
dificultad, para muchos investigadores, de conocer cuáles son las macromoléculas

específicas que un tipo celular requiere para funcionar normalmente. Como
consecuencia, se desarrollaron numerosos medios químicamente definidos,
denominados “libres de suero”, que poseen, además de las pequeñas moléculas
mencionadas, varias proteínas específicas necesarias para la supervivencia y
proliferación, como factores de crecimiento que estimulan la proliferación celular. Así,
se descubrieron muchas moléculas de señalización extracelulares esenciales para la
supervivencia, desarrollo y proliferación de determinados tipos celulares, gracias a
estudios que buscaban establecer las condiciones mínimas de cultivo para un
comportamiento celular adecuado.
Otro componente de importancia para los medios de cultivo son los

compuestos indicadores de pH, como por ejemplo el rojo fenol (pH 7,4). Los mismos
le otorgan color al medio, que puede ir virando hacia otro color en función de los
cambios de acidez, permitiendo controlar este parámetro tan importante en el cultivo
celular. Por otro lado, la penicilina y la estreptomicina son un ejemplo de los muchos
antibióticos que se añaden para evitar el crecimiento de bacterias contaminantes en
los cultivos celulares. Todos ellos conforman el medio de cultivo celular utilizado en
experimentos “in vitro”.
3.3.3 Técnicas electroquímicas
3.3.3.1 Potencial de corrosión
El potencial de corrosión o potencial a circuito abierto consiste en la medida

del potencial del electrodo de trabajo con respecto al electrodo de referencia, cuando
ambos electrodos se encuentran sumergidos en el medio electrolítico sin
perturbación externa. En un biosistema, donde el biomaterial metálico está en
contacto con los fluidos fisiológicos, tienen lugar varias reacciones simultáneamente.
En las zonas anódicas se oxidará el metal y en las zonas catódicas se reducirá el

oxígeno presente en el medio. Debido a que el pH es neutro, la reacción de reducción
de los protones no contribuirá notablemente a la corrosión del metal. Además, en el
caso del titanio el enlace Ti-Hads es muy fuerte del orden de 20 KJ·mol-1 siendo la i0
muy pequeña, como muestra la curva de Volcano (i0 vs Gads, Anexo 7.4).
Inicialmente, al sumergir la pieza metálica en la disolución de estudio, la

diferencia de potencial entre las zonas anódicas y catódicas es la diferencia Eq-Eq´
(Figura 11). Pero al empezar a corroerse y debido a las polarizaciones de activación, la
diferencia de potencial decrece hasta que prácticamente se anula alcanzando el
potencial mixto de corrosión (Ecorr), al cual la velocidad del proceso de corrosión se
iguala con la del proceso de reducción. Suponiendo que la suma de todas las
microzonas anódicas es igual a la suma de todas las microzonas catódicas, las
densidades de corriente de ambos procesos se igualan alcanzando la densidad de
corriente de corrosión (icorr). La diferencia de potencial será mínima ya que los
electrones pasan de las zonas anódicas hacia las catódicas a través de la red cristalina
metálica.
Las medidas de potencial a circuito abierto o potencial de corrosión

proporcionan información acerca de la tendencia a corroerse o pasivarse del
biomaterial. Cuanto menor sea el potencial de corrosión de un determinado material
metálico, se puede considerar más activo, es decir, mayor tendencia a corroerse. Sin
embargo, valores de potencial de corrosión mayores definen un material más noble y
con menor tendencia a la corrosión. Es importante señalar que el potencial de
corrosión no suministra información cuantitativa sobre la cinética o velocidad con la
que ocurre la corrosión. Así, materiales con potenciales similares pueden tener
cinéticas de corrosión diferentes. Es por eso que este tipo de medidas son muy útiles
como complemento de otras técnicas electroquímicas [1].
3.3.3.2 Curvas de polarización. Pendientes de Tafel
Las curvas de polarización representan la variación que experimenta la

densidad de corriente de un electrodo (i) en función del potencial aplicado de forma
estacionaria o a una velocidad de barrido constante (˂ 5 mV·s-1). Las curvas de
densidad de corriente-potencial constituyen una primera aproximación en el estudio
de la corrosión, pues permiten observar el efecto que producen variables como la
composición química del electrolito, la temperatura y el tiempo de inmersión, entre
otros, en las distintas reacciones que tienen lugar en la superficie del electrodo.
+i
Ti0 → Ti4+ + 4e-
icorr
Eéq EeqO2
Ecorr E
EeqH2
O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-
2H+ + 2e- → H2
-i
Figura 11. Curvas de polarización para electrodos mixtos.
Para un electrodo de titanio inmerso en un medio neutro aireado, las

reacciones que tienen lugar son la oxidación del metal:
Ti → Ti4+ + 4e-
y la reducción del oxígeno (Figura 11):
O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-
En el potencial mixto de corrosión se igualan las densidades de corriente de

reducción y de oxidación, y la densidad de corriente neta es cero. La curva i/E que se
obtiene, es la suma de las curvas de oxidación anódica y de reducción catódica (trazo
discontinuo).
La ecuación básica de la curva densidad de corriente-potencial para un proceso

de corrosión es:
( ) ( )
{ } (1)
donde:
: es la densidad de corriente total.
: es la densidad de corriente de corrosión.
= E – Ecorr : es la polarización.
F: constante de Faraday (96485 C/mol).
R, n y T: tienen su significado habitual.
← y →: son los coeficientes de transferencia de las reacciones anódica y catódica
respectivamente.
Las curvas de polarización de un electrodo mixto pueden representarse en

diagramas semilogarítmicos. Esta representación de E vs log i (Figura 12), conocida
[94]
como diagrama de Tafel es de gran utilidad para evaluar parámetros cinéticos .A
partir del punto de intersección de las dos rectas (Figura 12) es posible calcular el
potencial mixto de corrosión (Ecorr) y el log icorr.
Eeq
O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-
Ecorr
Eéq Ti0 → Ti4+ + 4e-
i0 i´0 icorr Log i
Figura 12. Diagrama de Tafel completo de un electrodo mixto en un medio neutro aireado.
Debido a que la polarización catódica de concentración es muy pronunciada se

obtiene una curva que tiende a ser paralela al eje de potencial. La densidad de
corriente de corrosión se reduce enormemente. En este caso la corrosión estaría
controlada catódicamente. La ecuación (1) puede representarse en función de las
pendientes de Tafel anódica y catódica:
( ) ( )
{ }
donde:
; Pendiente de la recta anódica.
; Pendiente de la recta catódica.

Ambas pendientes pueden obtenerse experimentalmente a partir de las

pendientes de las curvas de densidad de corriente-potencial cuando estas se
representan en escala semilogarítmica.
3.3.3.3 Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS)
La espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) es una técnica

ampliamente extendida en muchos campos científicos. Es una técnica no destructiva,
muy sensible a pequeños cambios en el sistema que permite determinar la influencia
del medio (composición química del electrolito, concentración de oxígeno, pH, etc) y
de factores externos (potencial aplicado), en las propiedades electroquímicas del
sistema en estudio.
Como comentamos anteriormente, en electroquímica los parámetros cinéticos

se determinan a partir del análisis de los procesos de relajación de las reacciones
electródicas que quedan desplazadas del equilibrio o del estado estacionario, por
aplicación de una señal eléctrica. Dicho desplazamiento puede estar motivado por la
aplicación de una señal de tipo escalón, rampa rectangular, triangular, etc. En el
método de la impedancia electroquímica, partiendo del potencial de equilibrio o del
potencial a circuito abierto, la señal de excitación que se aplica es una función de tipo
sinusoidal:
E = E0 senωt
Variando la frecuencia, ω, de esta señal de potencial, E, desde cero al infinito, se

obtiene la respuesta del sistema, esta vez en corriente, i [95].
I = i0 sen(ωt+)
siendo E0 e i0 las amplitudes máximas de la señal de entrada y de su respuesta en

corriente, respectivamente, mientras que  es la diferencia de fase entre dichas
señales. Por lo general, para conseguir respuestas lineales y que no se altere

irreversiblemente el sistema con la medida, la señal de entrada (E) se aplica sobre el
potencial de equilibrio o potencial estacionario del electrodo y su amplitud (E0) suele
ser muy baja, dentro del orden de 5-10 mV.
La relación entre la señal de potencial aplicada y la corriente de respuesta se

conoce como impedancia del sistema, de igual forma que en corriente continua, la
relación entre el voltaje y el flujo de corriente define la resistencia, en virtud de la ley
de Ohm. Pero la impedancia, a diferencia de la resistencia, es una magnitud vectorial,
con una dirección o argumento, :
 = arctan (Z”/Z’)
donde Zés la componente real y Z” la componente imaginaria de la impedancia. Y un

modulo, ⎪Z⎪, que vendrá definido por el cociente de las amplitudes de la señal de
voltaje y la señal de corriente:
⎪Z⎪= E0/i0
siendo:
⎪Z⎪ = [(Z’)2 + (Z’’)2]1/2
Dado que la aplicación del potencial en forma de onda sinusoidal tiene lugar en
un amplio rango de frecuencias, se obtiene para cada valor de frecuencia un vector
[96]
impedancia. Existen diferentes formas de representar la impedancia , siendo las
más utilizadas los denominados diagramas de Nyquist y de Bode. El diagrama de
Nyquist consiste en la representación en el plano complejo de la parte real e
imaginaria de los extremos del vector impedancia en todas y cada una de las
frecuencias estudiadas. El diagrama de Bode recoge la variación del módulo del vector
impedancia y del ángulo de fase, en función de la frecuencia.
La medida de impedancia en un sistema electroquímico constituye un examen

analítico de los distintos procesos que tienen lugar y que se manifiestan global y
simultáneamente en el sistema investigado. Así, cuando se trabaja a frecuencias
bajas, tanto los procesos rápidos como los lentos tienen lugar. Sin embargo, al
aumentar la frecuencia solo se observa la contribución de los procesos más rápidos,
que son los que tienen tiempo suficiente para ocurrir, antes de la inversión de la
polaridad de la señal de alterna.
Los resultados de impedancia son comúnmente interpretados por medio de un

circuito equivalente. En este sentido, los parámetros investigados en los experimentos
de impedancia se consideran como elementos eléctricos, los cuales forman un circuito
eléctrico que simula el comportamiento experimental. De acuerdo con el modelo
seleccionado y sus propiedades es posible obtener información de los mecanismos
electroquímicos y las propiedades del sistema. A continuación, se describen los
elementos eléctricos más comunes:
- Resistencia (R): representa la resistencia a la transferencia de carga a través de
una cierta interfase (por ejemplo electrolito/metal). Puede estar relacionada con la
resistividad presente para un compuesto o disolución a la transferencia de carga a
través de ellos (resistencia del electrolito, Re) o incorporada en un subcircuito RC
(circuito eléctrico formado por una resistencia combinada en paralelo con una
capacidad) la cual corresponde a la resistencia de transferencia o a la resistencia
faradaica de la interfase.
- Capacidad (C): representa la distribución de cargas en la interfase
electrodo/electrolito. Debido a la electroneutralidad de la materia, una disposición de
cargas sobre una superficie fuerza una imagen de signo contrario en la otra cara de la
interfase, haciendo que la doble capa en torno a los electrodos, las películas
pasivantes y otras capas superficiales, se comporten como condensadores o circuitos
eléctricos más complejos que contienen condensadores. La principal ventaja de este
elemento es la posibilidad de evaluar el espesor de la capa física (medio dieléctrico)
existente entre las placas del condensador. Generalmente, en sistemas reales este
elemento se corrige para tener en cuenta diferentes aspectos que pueden influir en
su comportamiento no ideal. Esta corrección de la capacidad se conoce como
elemento de fase constante, CPE (constant phase element). El CPE está definido por la
función empírica de admitancia de la expresión siguiente [97]:
donde Yp es una constante independiente de la frecuencia; el exponente  es tal que

se encuentra en un intervalo . Si  = 0 el CPE es una resistencia de valor R =
1/Yp. Cuando  = 1 es un condensador puro de valor C = Yp. Cuando  = 0,5 es la
admitancia de Warburg [97].
Figura 13. Circuito equivalente de Randles simplificado y su respuesta en frecuencia, representada en

el plano complejo en forma de diagrama de Nyquist.
En la Figura 13 se muestra el circuito más sencillo (Randles simplificado), el cual

explica satisfactoriamente el comportamiento de un gran número de sistemas
electroquímicos. La respuesta en frecuencia del circuito de Randles simplificado, es
una semicircunferencia a partir de la cual se pueden determinar los valores de los
elementos del circuito (Figura 13). Re (resistencia del electrolito) vendrá dado por el
punto de corte a altas frecuencias del diagrama de impedancia con el eje real, R tc
(resistencia a la transferencia de carga) coincidirá con el diámetro de la
semicircunferencia y, por último, Cdc (capacidad de la doble capa) se puede

determinar a partir del valor máximo de Z”:
Cdc = -1/(maxRtc)
donde  = 2f, siendo f la frecuencia.
Procesos más lentos como la difusión se manifiestan por una distorsión de los
valores del vector impedancia que definen la semicircunferencia, produciéndose a
bajas frecuencias una línea recta de pendiente unidad. En sistemas electroquímicos
reales, a veces los diagramas de impedancias presentan ciertas anomalías que los
apartan del comportamiento ideal, siendo necesario un estudio exhaustivo de los
procesos que tienen lugar y cómo se pueden simplificar e interpretar a través de
circuitos equivalentes [98, 99].
Transformadas de Kramers-Kronig
Para determinar si los resultados obtenidos de impedancia son válidos o han

sido distorsionados durante la adquisición de los resultados experimentales, es
[100]
necesario aplicar las relaciones de Kramers-Kronig . Las ecuaciones de Kramers-
Kronig (K-K) son relaciones de naturaleza matemática, por lo que no reflejan ninguna
otra propiedad física del sistema objeto de estudio. La ventaja de las relaciones de K-K
es que no es necesario utilizar un circuito eléctrico equivalente para determinar la
consistencia de los resultados experimentales [101].
Las transformadas de K-K se pueden aplicar siempre que el sistema objeto de

estudio sea invariante en el tiempo y cumpla las siguientes cuatro condiciones:
causalidad, linealidad, estabilidad, y valor finito [102, 103].
[102]
Un sistema es causal si su respuesta no precede a la perturbación . Si a un
sistema en reposo se le aplica una perturbación en t = 0, la respuesta del sistema
debe ser 0 para t < 0. Físicamente esto quiere decir que el sistema no genera ruido
independiente de la señal aplicada para t ≥ 0.
Un sistema es lineal si la relación entre la perturbación introducida y la

[100]
respuesta se puede describir mediante ecuaciones diferenciales lineales . Esto
significa que la impedancia obtenida sea independiente de la perturbación recibida.
Así, para asegurar la linealidad, se suele utilizar una amplitud de la perturbación entre
5 y 15 mV. Aunque hay que tener en cuenta que si la amplitud es demasiado pequeña
el cociente señal/ruido disminuye [103].
Un sistema electroquímico es estable si, cuando cesa la perturbación impuesta

el sistema vuelve al estado original [103].
La impedancia debe tener un valor finito en todo el intervalo de frecuencia

analizado, incluyendo ω → 0 y ω → ∞. Desde un punto de vista práctico, la condición
de valor finito no es crítica. En estudios de corrosión, sin embargo, la falta de
consistencia de los resultados electroquímicos, al aplicar las relaciones de K-K es, a
menudo debida a un fallo en la condición de estabilidad [104].
Las integrales de las transformadas de K-K se pueden expresar como [105]:
-
( )∫ (5)
-
( )∫ (6)
donde Z’() y Z”() son funciones continuas que proporcionan la parte real e
imaginaria de la impedancia respectivamente, en función de la frecuencia angular ()
en rad/s (0 <  < ∞); siendo x una variable de integración entre 0 < x < ∞. Utilizando
las ecuaciones (5) y (6) es posible transformar la parte real de la impedancia en la
[105]
parte imaginaria y viceversa . La comparaciones de los diagramas obtenidos
experimentalmente, con los obtenidos calculando las relaciones de K-K, es un método
de validación de la adquisición de resultados.
3.3.4 Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM)
La microbalanza de cristal de cuarzo es un dispositivo sensible a la masa que

tiene la habilidad de medir pequeños cambios de masa a tiempo real en sensores de
cristal de cuarzo. La sensibilidad de la QCM es de aproximadamente 100 veces mayor
que una balanza electrónica con una sensibilidad de 0,1 g [106]
. Esto significa que la
QCM es capaz de medir cambios de masa tan pequeños como una fracción de
monocapa o de una sola capa de átomos. La alta sensibilidad y la supervisión en
tiempo real de los cambios de masa en el cristal del sensor de cuarzo, hacen de la
QCM una técnica con diversas aplicaciones.
La base física del funcionamiento de la QCM es el efecto piezoeléctrico inverso,

en el que la aplicación de un campo eléctrico, a través de un material piezoeléctrico,
induce una deformación del material. Jacques y Pierre Curie descubrieron el efecto
piezoeléctrico en 1880. Se encontró que el estrés mecánico aplicado a la superficie de
materiales como la sal Rochelle turmalina y el cuarzo (acéntricos4), daba lugar a un
potencial eléctrico a través del cristal, cuya magnitud era proporcional a la tensión
aplicada. Gracias a esta tensión mecánica, se produce un desplazamiento físico de los
átomos, haciendo que el momento dipolar varíe y generando una carga en el cristal.
El descubrimiento del efecto piezoeléctrico permitió verificar

experimentalmente el efecto piezoeléctrico inverso, que consiste en la aplicación de
un voltaje, a través de estos cristales, dando lugar a la correspondiente tensión
mecánica. El campo eléctrico induce la reorientación de los dipolos del material
4
Material acéntrico es aquel que posee un eje polar debido a los dipolos asociados a la disposición de los átomos en la red
cristalina.
acéntrico, dando como resultado la tensión de red y la deformación de corte. La

magnitud de la deformación de corte depende de la magnitud del potencial aplicado.
La polaridad opuesta produce una tensión idéntica, pero en la dirección opuesta.
Cristal de cuarzo
El cuarzo es la forma más estable de la sílice (o dióxido de silicio SiO 2). Para las
aplicaciones de la QCM se emplean cristales de -cuarzo, debido a sus excelentes
propiedades mecánicas y piezoeléctricas. El ángulo de corte, con respecto a la
orientación de los cristales, determina el modo de oscilación. El cristal cortado AT,
que es el más utilizado para aplicaciones de QCM, se fabrica cortando una barra de
cuarzo con un ángulo de corte 35° 10’con respecto al eje óptico, como se muestra en
la Figura 14 [106].
Figura 14. Fotografía del cristal de cuarzo y dibujo del corte AT.
La ventaja de la utilización del cristal de cuarzo cortado AT es que, la variación

de frecuencia con la temperatura, en torno a la temperatura ambiente es cercana a
cero.
En los estudios de QCM, se utiliza un disco delgado de -cuarzo, que se

intercala entre dos electrodos metálicos depositados por evaporación en uno y otro
lado del cristal, con un espesor aproximado de 300 nm. Los electrodos de oro han sido
unos de los más utilizados en los estudios de QCM, debido a la facilidad con la que se
evapora el Au. Sin embargo, se han empleado también Cu, Ni, Pt, Ti y otros metales.
Experimentalmente se ha comprobado que los cambios en la masa unida al

cristal del cuarzo, producen cambios en la frecuencia de resonancia del mismo. La
relación entre el cambio de frecuencia de resonancia fundamental (fm) y el cambio
de masa (m) viene dada por la ecuación de Sauerbrey [75]:
 2  f 02  m  2  f 02  m
f   (7)
A    A     
1/ 2
donde:
f0 : la frecuencia de resonancia antes de la adición o eliminación de masa,
A : el área del cristal,
-3
 : la densidad del cuarzo (2,648g·cm ),
 : la velocidad de transmisión de onda,

11 -1 -2
 : la constante de cizallamiento (2,947x10 g·cm ·s , corte AT).
Esta ecuación es válida para pequeñas variaciones de masa, que impliquen un

cambio de frecuencia inferior al 2% y depósitos no viscosos. Otro factor que afecta en
gran medida a la respuesta es la temperatura, ya que ésta origina cambios en la
viscosidad y densidad de la disolución. Por esta razón, es necesario termostatizar la
celda electroquímica, en adición a los motivos generales de cualquier experimento
electroquímico.
La microbalanza de cristal de cuarzo constituye una técnica novedosa y muy

prometedora en electroquímica (los primeros estudios con microbalanza de cuarzo in
situ datan de 1981), debido a que permite medir los cambios de masa que tienen
[107]
lugar durante los procesos electroquímicos . Dichos cambios de masa pueden ser
debidos a las variaciones de masa que pueden tener lugar durante la oxidación o
64 3.4 Equipos
reducción de las especies electroactivas adheridas al electrodo, pero además, también

a cambios físicos en la zona interfacial. Así, la microbalanza de cuarzo responde, no
sólo a los cambios de masa del depósito, sino también a los cambios de densidad y/o
viscosidad que pueden producirse en una capa de disolución de unos 300nm desde la
superficie del electrodo. La alteración de la zona interfacial durante el proceso
electroquímico puede estar asociada a diversos factores: cambios en las propiedades
eléctricas del electrodo (por ejemplo debido a la corrosión del mismo), flujos de
especies hacia o desde el electrodo, asociados a la propia reacción de oxidación o
reducción, o como en nuestro caso la adsorción o desorción de especies sobre la
superficie del electrodo.
3.4 Equipos
3.4.1 Microscopio electrónico de barrido (SEM) y microanálisis por dispersión
de rayos X (EDX)
La morfología superficial del cristal de Ti (Ti-Q) y del Ti tratado térmicamente

(Ti-TT) se analizó utilizando un microscopio electrónico de barrido de modelo JEOL-
6500F, equipado con un cañón de emisión de campo (FEG), acoplado con dispersión
de rayos X (EDX). Las muestras se examinaron con 15 kV y 7 kV de voltaje de
aceleración, dependiendo de si se precisaba realizar microanálisis o toma de
imágenes, respectivamente. Las imágenes se obtuvieron usando un haz de electrones
secundarios.
3.4.2 Microscopio de fuerza atómica (AFM)
Con el fin de obtener imágenes topográficas y la medida de la rugosidad del Ti-

Q y del Ti-TT, se empleó la microscopía de fuerza atómica (AFM). Para ello, se utilizó
un AFM 5100 (Agilent) equipado con un scanner de 10 m de rango máximo en las
direcciones “x” e “y”, y de 4 μm en la dirección “z”. Las imágenes se obtuvieron
utilizando un cantiléver de nitruro de silicio con un radio de curvatura de sonda

nominal de 10nm y una constante de fuerza nominal de 40 N/m. La resolución de las
[108]
imágenes fue de 512 x 512 puntos. Se utilizó un software WSxM (Nanotec) . Se
trabajó en modo de contacto intermitente o “tapping”. Además, no se precisó de un
tratamiento específico previo de las muestras estudiadas.
3.4.3 Espectrómetro fotoelectrónico de rayos-X (XPS)
El espectrómetro que se utilizó, para realizar la caracterización superficial por

medio de XPS de las muestras de titanio fue un VG Escalab 200R, equipado con un
analizador hemiesférico de electrones (energía de paso de 50 eV) y una fuente de
rayos-X de MgKα (hν = 1254,6 eV, 1 eV = 1,6302 · 10-19 J), a 120 W. Para medir la
energía cinética de los fotoelectrones se utilizó un analizador de electrones
hemiesférico, trabajando en modo de paso de energía constante. Durante la
adquisición de resultados, la presión en la cámara de análisis se mantuvo por debajo
de 2·10-8 mbar. Los resultados de XPS se obtuvieron en incrementos de 0,1 eV, con un
tiempo entre cada medida de 50 ms. Las energías de ligadura se calibraron respecto al
pico del C1s a 284,9 eV. Los espectros de alta resolución se resolvieron ajustando las
curvas a los componentes de cada pico, mediante el programa “XPS peak”. Se
ajustaron los resultados sin realizar suavizado de los mismos. Para ajustar la forma de
las curvas a los componentes, se utilizaron funciones simétricas, mezcla de Gaussiana
y Lorentziana. Las proporciones atómicas se calcularon a partir de las proporciones de
las áreas de pico experimentales y normalizando con los factores de sensibilidad
atómica [109].
3.4.4 Potenciostato
Los estudios de potencial de corrosión, espectroscopía de impedancia

electroquímica y curvas de polarización, se llevaron a cabo con un potenciostato
Gamry Instruments Referencia 600.
66 3.4 Equipos
3.4.5 Microscopio óptico invertido
La observación de los cultivos de control de osteoblastos en placas de

poliestireno y el recuento de los mismos, se realizó con un microscopio óptico
invertido Motic modelo AE30.
La microbalanza de cristal de cuarzo que se empleó para realizar los estudios

con los cristales de Ti (Ti-Q) fue una Stanford Research Systems (SRS) Modelo
QCM200. En la Figura 15, se muestra el brazo de la QCM así como sus componentes.
Figura 15. Brazo de QCM y sus componentes.
Esta técnica permite relacionar los cambios de frecuencia con los cambios de
masa. Para realizar las medidas de adsorción de los componentes del medio celular
sobre el Ti-Q se mantuvo la temperatura a 25°C por medio de un baño
termostatizado. El dispositivo utilizado para realizar las medidas de adsorción de
osteoblastos Saos-2 con la QCM fue el que se muestra en la Figura 16.
El sensor de cuarzo se aloja en el brazo de la microbalanza de cuarzo, que a su

vez está fijado dentro de una macrocelda electroquímica (Figura 16). La celda
presenta tres orificios para manipulación desde el exterior. En uno de ellos se coloca
un tubo con atmósfera de aire al 5 % de CO2. La celda presenta una doble pared que
permite la recirculación del agua, manteniendo la temperatura. Dentro de la celda
electroquímica se añade agua destilada para evitar que se evapore el líquido presente
encima del sensor. Por la misma razón, se tapa con un cristal cubreobjetos el brazo de
la QCM. Esta celda se mantuvo con un baño termostátizado a 37°C para el estudio de
ganancia de masa debido a la adhesión de los osteoblastos. Para evitar pérdidas de
calor, la celda en su conjunto se mantuvo dentro de una caja de material aislante.
Figura 16. Macrocelda electroquímica utilizada para realizar las medidas de QCM en presencia de los
osteoblastos Saos-2.
3.5 Metodología
3.5.1 Técnicas de caracterización
3.5.1.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microanálisis po r

dispersión de rayos X (EDX)
Las muestras de Ti-Q y Ti-TT en presencia y ausencia de osteoblastos, a

distintos tiempos de ensayo, fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica
de barrido (SEM).
68 3.5 Metodología
Previo al estudio de SEM y/o EDX de una determinada muestra es necesario

metalizarla, siempre que ésta no sea conductora. Este metalizado puede ser de oro
(requerido para la toma de imágenes de alta calidad), o de carbono (indicado en el
caso de realizar microanálisis).
En el caso de toma de imágenes de Ti-Q y Ti-TT con osteoblastos se requiere

seguir un protocolo de fijación y posterior deshidratación de la estructura celular, ya
que el alto vacío de trabajo, necesario en el microscopio electrónico de barrido,
desestructura la materia biológica. Este protocolo de preparación se llevó a cabo a 4°C
en una campana de flujo laminar.
Las muestras, con los osteoblastos adheridos, se lavaron dos veces con
disolución tamponada de fosfato (PBS). Posteriormente, se añadió a cada pocillo
glutaraldehído al 2,5% en PBS hasta cubrir las muestras, que se dejaron sumergidas
durante 24 horas a 4°C, con el objeto de fijar la estructura celular. A continuación se
procedió a la deshidratación de las muestras remplazando progresivamente el
contenido en agua de la disolución por etanol. Para ello, las muestras se lavaron tres
veces con agua destilada para eliminar los restos de glutaraldehído y PBS. Luego se
partió de un volumen fijo de agua destilada, al que se fue retirando disolución y
añadiendo determinadas cantidades de etanol consiguiendo en cada paso las
siguientes concentraciones finales de etanol: 35%, 50%, 70% 95% y 100%. Las
muestras se mantuvieron 10 minutos en cada disolución. Por último, para dotar a
estas muestras de la resistencia mecánica necesaria para soportar el alto vacío del
microscopio, se fue remplazando progresivamente el etanol absoluto por
tetrametilsilano (TMS). El procedimiento fue retirar el etanol absoluto e ir añadiendo
en su lugar TMS, para alcanzar progresivamente 50% de TMS y 100% de TMS, en
cuyas disoluciones permanecieron las muestras durante 10 minutos. Transcurrido el
tiempo de tratamiento, se retiró el TMS y se dejó secar en la campana durante 30
minutos. Las muestras, así preparadas, pueden ser observadas al microscopio
electrónico de barrido.
Las muestras en estado de recepción, Ti-m, después del tratamiento térmico,

Ti-TT así como el Ti-Q fueron caracterizadas mediante AFM, para conocer la
topografía y la rugosidad de su superficie. No ha sido necesaria una preparación
previa de las distintas muestras.
3.5.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS)
Las muestras de Ti en estado de recepción (Ti-m) después del tratamiento

térmico a 277°C durante 5 horas (Ti-TT), así como el Ti-Q fueron analizadas mediante
XPS. Además, esta técnica también se utilizó para analizar la composición de los dos
acabados de titanio, después de su inmersión, durante 7 días, en los distintos
componentes del DMEMc.
Igualmente el XPS se utilizó para analizar las proteínas presentes sobre las
superficies de Ti-TT, después de haber tenido lugar el crecimiento celular durante 7
días en un cultivo de osteoblastos. Para ello, los osteoblastos adheridos a la superficie
de las muestras se retiraron sumergiendo las muestras en agua destilada, en un baño
de ultrasonidos durante 10 minutos y dejándolas secar [110]. De esta manera, tanto la
capa de óxido de titanio como las especies fuertemente adsorbidas, permanecieron
sobre la superficie.
3.5.2 Ensayos en cultivos celulares
La línea celular de osteoblastos empleada para los distintos experimentos, fue

Saos-2 de osteosarcoma humano. Los osteoblastos en medio de cultivo DMEMc se
mantuvieron en una atmósfera de aire con un 5% de CO2, a 37°C y un 100% de
humedad relativa en un incubador.
Se obtuvieron curvas de crecimiento de la línea celular de osteoblastos para

conocer, en primer lugar, la velocidad de proliferación de los mismos y,
70 3.5 Metodología
posteriormente, poder comparar dicha proliferación sobre diferentes sustratos. Para

ello, se sembraron en una placa de poliestireno de 6 pocillos 2,5·104 osteoblastos/ml
(1,5·104 osteoblastos/cm2). Esta cantidad de osteoblastos es apropiada para cubrir
toda la superficie del pocillo en aproximadamente una semana. Las placas con los
cultivos se introdujeron en el incubador y se observó su crecimiento y proliferación
durante los 7 días de ensayo, mediante el microscopio óptico invertido. Transcurridos
2, 4, 6 y 7 días se procedió a despegar y contar dichos osteoblastos.
El recuento celular comprende una primera fase de despegue celular y una fase
posterior de contaje. Para llevar a cabo el despegue celular a cada tiempo de cultivo,
cada pocillo se lavó dos veces con una disolución tampón de fosfatos (phosphate
buffer solution, PBS). Una vez retirado el PBS, se añadió 0,4 ml de Tripsina-EDTA5, y
para favorecer la acción de la tripsina y por tanto el despegue celular, se introdujeron
durante aproximadamente 5 minutos en un incubador. Pasados esos 5 minutos, la
tripsina se neutralizó con 0,6 ml de medio fresco, DMEMc. La suspensión de
osteoblastos en DMEMc y tripsina se centrifugó a 1300 rpm, durante 4 minutos, para
separar los osteoblastos del medio de cultivo. Una vez decantado el sobrenadante se
obtuvo un pellet visible en el fondo del tubo, al cual se añadieron 5 ml de medio
fresco y se resuspendió para asegurar una distribución celular homogénea.
Posteriormente, para el contaje celular, se cargaron 15 l en cada lado de la cámara
Neubauer de contaje de células (Figura 17). Con ayuda del microscopio óptico
invertido, se buscó la cuadrícula que aparece en la Figura 17 y se contaron los
osteoblastos situados en los cuadrados marcados con una L. El total de osteoblastos
se sumó, se dividió entre 4 y se multiplicó por un factor de corrección 10 4, así se
5
La tripsina es una enzima peptidasa que rompe los enlaces peptídicos de las proteínas, mediante hidrólisis,
para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos. En este caso, se utiliza para romper las uniones
peptídicas de las células con la superficie. El ácido etilendiaminotetraacético o EDTA es una sustancia utilizada
como agente quelante que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación
octaédrica, como por ejemplo el calcio.
obtuvo el número de osteoblastos/ml. El contaje celular se realizó siempre por

duplicado.
Figura 17. Cámara Neubauer de contaje de células.
Con el objetivo de evaluar cuál es la concentración óptima de osteoblastos

adheridos sobre la superficie, que sea sensible a las medidas de impedancia, se
realizaron ensayos en función de la concentración celular, variando ésta entre 1,5·10 4
y 3,0·105 osteoblastos/cm2. Lo que se pretende es obtener un recubrimiento celular
total en el cultivo de Saos-2 a la semana de incubación. Como resultado, se eligió la
concentración más baja, 1.5 104 osteoblastos/cm2, como concentración celular más
adecuada para registrar el potencial de corrosión, las curvas de polarización y la
espectroscopía de impedancia electroquímica de las muestras de titanio.
En los ensayos con la QCM en presencia de osteoblastos la concentración

celular se varió entre 1,5·104 y 3,0·105 osteoblastos/cm2 obteniéndose una
concentración óptima de 5,0·104 osteoblastos/cm2 para alcanzar la confluencia celular
a las 24 horas de ensayo.
Como medida de control y para verificar la viabilidad del cultivo, en cada

ensayo se pusieron en marcha paralelamente cultivos de osteoblastos en placas de
poliestireno. De esta manera, se observó al microscopio óptico invertido la viabilidad
y proliferación de la línea celular en cada ensayo realizado con las superficies de Ti.
72 3.5 Metodología
3.5.3 Técnicas electroquímicas
Las técnicas electroquímicas que se utilizaron para evaluar la modificación de la

interfase metal/disolución debida a la interacción con los diferentes componentes del
DMEMc, así como con los osteoblastos, fueron la evolución del Ecorr con el tiempo, la
espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) durante 7 días y las curvas de
polarización después de 7 días de ensayo.
3.5.3.1 Potencial de corrosión
La evolución del potencial de corrosión (Ecorr) con el tiempo de inmersión (siete

días) de las muestras de Ti-Q y Ti-TT en ausencia de osteoblastos se midió frente al
electrodo de referencia Ag/AgCl. Sin embargo, en presencia de osteoblastos, el E corr se
midió frente a un pseudoreferencia de Pt.
3.5.3.2 Curvas de polarización
Con el objetivo de evaluar los parámetros correspondientes a la corrosión del

Ti-Q y del Ti-TT en cada una de las disoluciones de los componentes del medio celular
(DMEMc) se obtuvieron curvas de polarización. Este método potenciodinámico
consiste en aplicar un barrido lineal de potencial (catódico o anódico) a partir del
potencial de corrosión, a una velocidad de barrido de 1 mV/s. La magnitud de la
polarización fue de ± 0,5 V respecto del Ecorr. Las curvas de polarización se obtuvieron
a los 7 días de estar en contacto con cada uno de los componentes del DMEMc
estudiados sobre Ti-Q y Ti-TT, a los 7 días en el caso de los ensayos con Saos-2 sobre
Ti-Q y a los 1, 3, 5 y 7 días para los ensayos con Saos-2 sobre Ti-TT. Para realizar los
ensayos con osteoblastos se utilizaron diferentes muestras para cada tiempo de
ensayo y para cada una de las ramas catódica y anódica de las curvas de polarización.
Para obtener un espectro de impedancia electroquímica se aplicó una onda

sinusoidal de potencial de ± 10mV de amplitud respecto al Ecorr, para las muestras de
Ti-TT y Ti-Q que estaban en contacto con los componentes del DMEMc, y ± 5mV de
amplitud para las muestras de Ti-Q y Ti-TT que estaban en contacto con los
osteoblastos. El intervalo de frecuencias fue de 10 5 a 10-3 Hz, obteniendo 5 puntos por
década.
Los resultados de las medidas de EIS experimentales se ajustaron a diferentes

circuitos eléctricos equivalentes. Los parámetros de estos circuitos se calcularon,
ajustando la función de impedancia al espectro obtenido por medio de un programa
de ajuste de mínimos cuadrados, no lineal (NLLS program), como el Z-plot/Z-view.
En general, la selección de cada uno de los circuitos eléctricos equivalentes

utilizados para ajustar los resultados experimentales de impedancia, se realizó
teniendo en cuenta los siguientes criterios: 1) el significado físico del circuito, 2) que
los errores relativos para cada parámetro del circuito fueran mínimos y 3) que el valor
de , referido al ajuste con los datos experimentales, fuera el menor de todos.
Con el fin de evaluar la fiabilidad de los resultados de EIS, se procedió a realizar

las transformadas de Kramers-Kronig (K-K) mediante el programa Z-plot/Zview
representando las componentes real e imaginaria de la impedancia frente a la
frecuencia. En estas representaciones se incluyen tanto los resultados experimentales
como los obtenidos a partir de las transformadas de K-K. Asimismo, se calculó el error
para cada una de las representaciones a partir de la siguiente función estadística [111]:
∑ | |
̅ (8)
donde | | representa el valor absoluto de la diferencia entre el valor

experimental de la impedancia y el valor calculado de las transformadas de
74 3.5 Metodología
K-K ; es el valor máximo de la impedancia experimental, y , el

número de puntos de los resultados experimentales. Con este cálculo, se consigue
comparar los resultados obtenidos experimentalmente con los calculados a partir de
las transformadas de K-K.
El tratamiento del cristal de cuarzo con Ti evaporado consistió en lavarlo

previamente con agua destilada y a continuación se secó con N 2 de alta pureza.
Seguidamente, se montó el brazo de la QCM (Figura 15) con el cristal de cuarzo de Ti y
se realizaron medidas en aire hasta obtener un valor constante de frecuencia de
oscilación próximo a 5 MHz, que es la frecuencia del cristal de cuarzo.
A continuación, se introdujo el brazo de la QCM con el electrodo de Ti-Q en

posición vertical en agua ultra-pura a T = 25°C, obteniéndose una disminución en el
valor de la frecuencia de f = -776 Hz, valor próximo al calculado teóricamente por
[78]
Kanazawa y Gordon . Posteriormente, se introdujo el brazo de la QCM en las
diferentes disoluciones de los componentes del DMEMc, es decir, en las disoluciones
P, PCa, BSA y FBS, a T = 25°C hasta que se obtuvieron valores estables de frecuencia
de oscilación.
Para llevar a cabo los ensayos de QCM con los osteoblastos Saos-2, se fijó el
brazo de la QCM en posición horizontal como se muestra en la Figura 16 y se registró
la frecuencia en aire hasta alcanzar un valor constante de aproximadamente 5 MHz.
Posteriormente, se añadieron 2 ml de DMEMc y se registró la frecuencia durante
aproximadamente 2 h. Una vez alcanzado un valor de la frecuencia estable de
aproximadamente 868 Hz, se añadió el volumen de suspensión celular, necesario para
alcanzar la concentración de osteoblastos deseada, y se registró la frecuencia durante
aproximadamente 24 h. Este tiempo es suficiente para que la mayoría de los
osteoblastos presentes en la suspensión celular se adhieran a la superficie del Ti-Q. A
continuación, sin dejar de registrar la frecuencia, se despegaron los osteoblastos

retirando el medio y añadiendo 1 ml de tripsina. Cuando se obtuvo un valor de
frecuencia constante (aproximadamente 5 h), se adicionó 1 ml de DMEMc para parar
el efecto de la tripsina y se procedió al contaje de los osteoblastos para determinar
cuántos habían quedado adheridos a la superficie expuesta.
4. Resultados y discusión
4. Resultados y discusión 79
4.1 Estudio de la interfase Ti-Q/componentes del DMEMc
4.1.1 Caracterización de Ti-Q
La caracterización de la morfología superficial del Ti-Q fue realizada mediante

SEM y AFM, y la composición superficial fue determinada por XPS.
4.1.1.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM)
En la Figura 18 se puede observar la superficie de Ti evaporado sobre los

cristales de cuarzo (Ti-Q) a diferentes magnificaciones. La superficie metálica revela
una estructura para el Ti-Q en forma de escamas depositadas sin ninguna orientación
preferencial. Esta distribución aleatoria le confiere a la muestra una fina rugosidad
superficial, dotándola de cierta homogeneidad.
1 m 100 nm
Figura 18. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la superficie del Ti-Q a diferentes
magnificaciones.
Las imágenes de AFM (10 m x 10 m) de Ti-Q (Figura 19) muestran una
topografía superficial homogénea con un perfil de rugosidad uniforme y
prácticamente constante en toda la muestra (RMS = 37 nm). Por tanto, se puede
concluir que este acabado presenta una rugosidad superficial a escala nanométrica
reproducible; esta rugosidad a nivel de nanoescala es importante, ya que puede influir
80 4.1 Estudio de la interfase Ti-Q/componentes del DMEMc
en la respuesta física, química y biológica, así como en la conducta frente a la

corrosión de un biomaterial.
Figura 19. Imagen por microscopía de fuerza atómica (AFM) de la topografía superficial del Ti-Q y
perfil de rugosidad.
4.1.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)
La composición química de la superficie del Ti-Q expuesta al aire se analizó por

medio de la espectroscopía fotoelectrónica de rayos-X (XPS). En la Figura 20 se
muestran los espectros de alta resolución del C1s, del O1s y del Ti2p para el Ti-Q.
Figura 20. Espectros de alta resolución de XPS del C1s, del O1s y del Ti2p para el Ti-Q.
El espectro de alta resolución del Ti2p muestra que la superficie está cubierta
por una capa de óxido (formada espontáneamente) cuya composición es solamente
TiO2 (Ti2p3/2 458,5 eV y Ti2p1/2 464,3 eV), aunque también es posible detectar una
pequeña cantidad de Ti metálico (453,6 eV) y una mínima presencia de Ti 2O3 (456,5
eV) (Tabla 8). El espectro de alta resolución del C1s se puede resolver en tres picos:
uno a 248,8 eV que representa los carbonos en los hidrocarburos del medio ambiente
(C-C y C-H) y los otros dos picos a 286,4 y 288,4 eV representando los carbonos en los
enlaces C=O y O-C=O [112]. Por último, el espectro de alta resolución del O1s muestra
tres componentes: 529,8 eV asignada al TiO2, 531,5 eV correspondiente al enlace Ti-
OH y 532,3 eV al enlace C=O (Figura 20). La asignación de estos picos está de acuerdo
con los obtenidos por McCafferty y Wightman [33].
Tabla 8. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s, del C1s y
del Ti2p para el Ti-Q.
Superficie Elemento Asignación Energía de Ligadura (eV) % atómico
C-C, C-H 284,8 18,8

C1s 3,3
C=O 286,4
O-C=O 288,4 3,8
TiO2 529,8 37,2

Ti-Q O1s Ti-OH 531,5 11,0
C=O 532,3 6,9
Ti 453,6 0,7
Ti2O3 456,5 0,03
Ti2p
TiO2 458,5 12,5
TiO2 464,3 5,9
Una vez caracterizada la superficie del Ti-Q, se procedió a determinar si, como
consecuencia de la interacción de los distintos componentes del DMEMc con la
superficie de Ti-Q, se producía una adsorción o precipitación de algún compuesto
sobre la superficie. Para ello se utilizó la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM).
Cualquier adsorción o precipitación de compuestos o iones sobre la superficie

del Ti-Q se traduce en una variación en la frecuencia de oscilación del cristal, la cual
puede ser relacionada, mediante la ecuación de Sauerbrey (ec. (7)), con un

incremento de masa. En la Figura 21 se muestra la variación de frecuencia en función
del tiempo de inmersión en las disoluciones de NaH2PO4 (P) y NaH2PO4 + CaCl2 (PCa).
El primer valor de frecuencia registrado fue para el Ti-Q en aire, hasta obtener un
valor de frecuencia estable próximo a 5 MHz, que es la frecuencia de oscilación del
cristal de cuarzo. Posteriormente se introdujo en posición vertical el brazo con el Ti-Q
en agua ultrapura a T = 25°C, obteniéndose una disminución en el valor de la
frecuencia de -776 Hz al cabo de aproximadamente 3h, como se puede apreciar en la
Figura 21. Según Kanazawa y Gordon [78] es posible predecir por medio de la ec. (9) el
cambio en la frecuencia de resonancia que tiene lugar cuando un cristal de cuarzo se
sumerge en un medio viscoso, como por ejemplo en una disolución.
( ) (9)
donde,
fu : la frecuencia de oscilación del cristal (5 MHz)

q : la densidad del cuarzo (2,648 g/cm3)
q: la constante de cizallamiento del cuarzo (2,947·1011 g/cm·s2, corte AT)
L : densidad del líquido en contacto con el electrodo, para el agua (1 g/cm3)
L : la viscosidad del líquido en contacto con el electrodo, para el agua (0,0891
poisse).
La variación teórica de la frecuencia para un cristal de cuarzo de Ti sumergido

en agua destilada da como resultado un f = -714 Hz, similar a los f = -776 Hz que se
obtienen experimentalmente (Figura 21). A continuación se introdujo el Ti-Q en una
disolución de NaH2PO4 (pH = 7,4) registrándose después de 8 horas una disminución
de frecuencia de f = -40 Hz, indicando que los iones fosfato presentes en la
disolución P se han adsorbido sobre la superficie del Ti-Q (Figura 21).
Figura 21. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido
en la disolución P (NaH2PO4) y la disolución PCa (NaH2PO4 + CaCl2).
Aplicando la ecuación de Sauerbrey [75]:
 2  f 02  m  2  f 02  m
f   (7)
A    A     
1/ 2
donde:
f0 : la frecuencia de resonancia antes de la adición o eliminación de masa

A : el área del cristal (1,37 cm2)
-3
 : la densidad del cuarzo (2,648g·cm )
 : la velocidad de transmisión de onda

11 2
 : la constante de cizallamiento (2,947·10 g/cm·s , corte AT)
se calcula el incremento de masa correspondiente a la adsorción de los iones fosfato,

que es de m = 0,71 g/cm2. Posteriormente, esta disolución se cambió por la
disolución PCa, obteniéndose un f = -6 Hz después de 10 h. aproximadamente
(Figura 21). Para estudiar la competitividad entre los iones fosfato y los iones calcio
por adsorberse sobre la superficie del Ti, se sumergió un cristal limpio directamente
en la disolución PCa, dando una disminución de frecuencia con respecto al agua de f
= -48 Hz, al cabo de 75 h. Comparando ambos procedimientos se puede concluir que
cuando ambos iones están presentes simultáneamente en la disolución, la cinética de
adsorción es más lenta.
La adsorción de proteínas como la albúmina sobre la superficie del Ti-Q

aparece en la Figura 22 a. Observamos una disminución de la frecuencia de f = -17
Hz al cabo de 14 horas. Ignorando cualquier cambio que se pueda producir en la
densidad y viscosidad del medio, se puede hacer una estimación aproximada de la
posible cantidad de BSA adsorbida sobre la superficie de Ti-Q. Teniendo en cuenta
[52]
que las dimensiones del área proyectada de una molécula de BSA es 4 x 14 nm y
que el área expuesta del electrodo es 1,37 cm2, el número de moléculas de BSA que
formarían una monocapa sería de 2,45·1012. Puesto que la masa molecular de la BSA
es de 66KDa [51]
, una monocapa de BSA debería pesar 0,268 g. Si utilizamos la
ecuación de Sauerbrey [75]
, se obtiene que el f teórico para una monocapa de
moléculas de BSA es de -11 Hz. Por tanto, como para la BSA sola se ha obtenido un f
de -17 Hz el número de monocapas formadas es de 1,5: esto indica que la superficie
de Ti-Q se encuentra cubierta por más de una monocapa de BSA.
Por el contrario, si la BSA está en presencia de NaH2PO4 + CaCl2 (disolución BSA)

(Figura 22 b) se obtiene un valor de f = -57 Hz. Es decir, la adsorción de la BSA sobre
la superficie del Ti-Q se ve potenciada por la presencia de los iones Ca2+.
Figura 22. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo
sumergido en (a) una disolución de BSA y (b) una disolución de BSA + NaH2PO4 + CaCl2.
En la Figura 23 aparece la variación de la frecuencia como consecuencia del

proceso de adsorción del FBS. El f obtenido fue de -66 Hz. En este caso, la
disminución de la frecuencia es todavía mayor, lo que concuerda con los resultados
obtenidos hasta ahora, pues el FBS está constituido por multitud de proteínas,
(fundamentalmente BSA) y otros nutrientes celulares.
Figura 23. Variación de la frecuencia de oscilación del cristal de cuarzo (Ti-Q) con el tiempo sumergido
en la disolución de FBS.
4.1.3 Caracterización de las muestras de Ti-Q en los distintos componentes del
DMEMc por espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)
La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) se utilizó para obtener

información acerca de los elementos presentes sobre la superficie de Ti-Q después de
siete días de inmersión en cada una de las disoluciones utilizadas. Dicha información
ayudará posteriormente a seleccionar en cada caso, el circuito eléctrico equivalente
que mejor simule, tanto física como matemáticamente, los resultados experimentales
obtenidos mediante espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS).
En la Figura 24, se muestran los espectros generales de XPS del Ti-Q en aire y
sumergido, durante 7 días, en cada una de las disoluciones de los componentes del
DMEMc estudiados.
Figura 24. Espectros generales de XPS para el Ti-Q sumergidos, durante 7 días en: (a) aire, (b)
NaH2PO4, (c) NaH2PO4 + CaCl2, (d) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa, (e) NaH2PO4 + CaCl2 + BSA y (f) FBS.
Cuando una muestra de Ti-Q se sumerge en la disolución de NaH2PO4

(disolución P), los espectros generales obtenidos para el Ti son muy similares a los del
óxido nativo existente sobre una superficie de Ti expuesta al aire. Sin embargo, a
partir de los espectros de XPS de alta resolución para el O1s se observan notables
diferencias (Figura 25 a). Como se puede observar en la Tabla 9 las energías de
ligadura obtenidas para el espectro de O1s son 529,8 eV asignada al enlace del TiO 2,
531,3 eV al enlace P=O- y 532,4 eV al enlace P-OH [31, 56]. Las bandas correspondientes
al -P=O y al P-OH tienen energías de ligadura próximas al Ti-OH (531,5 eV) y al C=O
(532,3 eV). Es posible que exista una contribución de Ti-OH en la banda de energía de
ligadura más baja, sin embargo, es poco probable la presencia de C=O (debido a la
contaminación en aire) para una muestra de Ti en contacto con la disolución. Además,
la presencia de fosfato (P2p) a 133,5 eV parece confirmar la posibilidad de que se
hayan formado este tipo de enlaces entre el fósforo y los grupos oxigenados de la
superficie del Ti-Q. Por otra parte, si se comparan los porcentajes atómicos de las
bandas asignadas en el espectro de alta resolución del Ti2p para el Ti-Q (Tabla 8) con
su homólogo para el Ti-Q/P (Tabla 9), se puede observar cómo para la muestra de Ti-Q
sumergida en la disolución de fosfato los % atómicos de las tres bandas del Ti
disminuyen ligeramente. La presencia de iones fosfato, así como la disminución de los
% atómicos de las bandas de Ti, confirman la adsorción de iones fosfato sobre la
superficie del Ti-Q, como ya se había comprobado mediante los ensayos con la QCM
después de 8 horas de inmersión.
En presencia de la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (disolución PCa) el espectro

del Ti2p muestra únicamente las bandas características del TiO 2 (Ti2p3/2/458,4 eV y
Ti2p1/2/464,2 eV). Los % atómicos de ambas bandas han disminuido a más de la mitad
con respecto al Ti-Q en fosfato como se puede apreciar en la Tabla 9. De hecho, la
banda del O1s correspondiente al TiO2 (529,8 eV) disminuye a la cuarta parte (Figura
25 a y b). Es interesante resaltar que el % atómico de la banda de O1s
correspondiente al enlace -P=O aumenta con respecto a la disolución en ausencia de
Ca2+ (27,5 vs 7,4 %). Este aumento del % atómico puede ser debido a que la adsorción
de Ca2+ a la superficie de Ti cargada negativamente favorece la adsorción de los iones
[32]
fosfato . Por esta razón, es posible asignar el pico 532,4 eV al enlace Ca-O-. De la
misma forma el % atómico de la banda correspondiente al P2p aumenta (1,5 vs 3,3
%), apareciendo la banda del Ca2p a 347,4 eV (Tabla 9). Sin embargo, el cociente Ca/P
después de 7 días de exposición a la disolución PCa es muy bajo (1,6/3,3 = 0,48)
comparado con el valor estándar cuando se forma la apatita (1,67), compuesto de
características similares al hueso.
Tabla 9. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-Q después de 7 días
sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa
(PCaG), NaH2PO4 + CaCl2 + BSA y FBS.
Superficie Elemento Asignación Energía de Ligadura (eV) % atómico

C-C, C-H 284,8 23,2
C1s
C=O 286,4 3,6
O-C=O 288,4 4,0
TiO2 529,8 38,1

Ti-Q / P O1s -P=O, Ti-OH 531,3 7,4
P-OH 532,4 8,8
Ti 453,6 0,4
Ti2p TiO2 458,5 8,9
TiO2 464,2 4,2
3-
P2p PO4 133,5 1,5
C-C, C-H 284,8 33,2

C1s C=O 286,4 5,3
O-C=O 288,0 7,5
TiO2 529,8 9,2

O1s -P=O, Ti-OH 531,4 27,5
Ca-O 532,4 6,3
Ti-Q / PCa
Ca2p CaHPO4 347,4 1,6
TiO2 458,4 4,0

Ti2p
TiO2 464,2 2,1
3-
P2p PO4 133,5 3,3
C-C, C-H 284,9 21,8

C1s C-OH 286,5 18,5
Ti-Q / PCaG -HC=O 287,8 14,4
C=O 531,5 7,9

O1s
C-OH 532,8 36,1
C-C, C-H 284,7 19,4

C-NH 286,0 28,6
C1s
C=N 287,0 5,6
COOH, CONH 288,2 7,3
Ti-Q / BSA
TiO2 530,1 2,0
O1s COOH, CONH 531,6 15,2
C-OH, C-O 532,6 8,9
N1s -O=C-NH- 399,9 12,0
C-C, C-H 284,7 26,0

C-NH 286,0 23,1
C1s
C=N 287,0 4,1
COOH, CONH 288,2 6,8
Ti-Q / FBS
TiO2 529,9 2,7
O1s COOH, CONH 531,6 16,2
C-OH, C-O 532,4 7,2
N1s -O=C-NH- 399,9 14,6

Figura 25. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q después de 7 días de
inmersión en a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG).
Cuando las muestras de Ti-Q se sumergen en la disolución de glucosa el

espectro general cambia drásticamente (Figura 24 d). La cantidad de glucosa
adsorbida sobre la superficie del Ti-Q es tan grande que la señal del Ti2p no se
detecta. El espectro de alta resolución del C1s muestra un ensanchamiento con una
contribución de tres componentes que corresponden al carbono en diferentes
entornos: la primera componente con la energía de ligadura más baja (284,9 eV) es
asignada al carbono enlazado a C e H (C-C y C-H); la segunda componente (286,5 eV)
es atribuida al carbono en el enlace C-OH; y la tercera componente a energía de
ligadura más alta (287,8 eV) es asignada al enlace -HC=O (Tabla 9). La forma del
espectro del O1s (Figura 25 c) también cambia. La componente principal a 532,8 eV es
la correspondiente al enlace C-OH. El % atómico de esta banda es cuatro veces
superior al % atómico de la banda correspondiente al enlace -C=O, que aparece a
531,5 eV, lo cual confirma la estructura molecular de la glucosa (Tabla 9). En este
caso, la presencia de fosfatos y calcio no es significativa, debido a los bajos
porcentajes obtenidos, que indican que la adsorción de la glucosa sobre la superficie
del Ti-Q impide la formación de los enlaces Ca-O y Ti-O-P, o bien que la capa
adsorbida de glucosa es lo bastante gruesa para que no sea posible la detección de
estos elementos.
El espectro general del Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA,

es similar al espectro obtenido para el Ti-Q sumergido en la disolución de glucosa
(Figura 24 e), en el sentido de que prácticamente no aparece la banda
correspondiente al TiO2, en este caso debido a la adsorción de la proteína. Sin
embargo, el espectro de alta resolución del C1s es completamente diferente,
mostrando las bandas características de la estructura de la proteína. La deconvolución
del espectro del C1s se realizó siguiendo el mismo procedimiento que Frateur y
[113, 114]
Pradier . Las bandas obtenidas son las siguientes: 1) 284,7 eV para los enlaces
C-C y C-H, 2) 286,0 eV para el enlace C-O y para los grupos amino (C-NH-), 3) 287,0 eV
para los grupos C=N o N-C=C y 4) 288,2 eV para los grupos ácido (COOH) y para los
enlaces peptídicos (CO-NH-).
Figura 26. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q sumergido, durante 7
días, en a) BSA y b) FBS.
Estos enlaces bien definidos corresponden a los diferentes grupos químicos

presentes en la molécula de BSA. El número de átomos de carbono en cada grupo
[115]
químico fue calculado a partir de los diferentes fragmentos de la proteína y
comparado con los % atómicos de XPS, obteniendo la evidencia de que las moléculas
de BSA adsorbidas sobre la superficie del Ti-Q están intactas químicamente. Igual que
en el caso del C1s, la banda del N1s proviene de las proteínas adsorbidas. La banda del
N1s es simétrica y centrada en 399,9 eV, correspondiendo a la contribución del enlace
peptídico (-O=C-NH-) y el grupo –NH2, como se esperaba para los grupos amida y
amina de la BSA (399,9 eV). En concordancia con estos resultados, la banda del O1s
muestra los siguientes componentes: TiO2 (530,1 eV), O=C-OH y –O=C-NH- (531,6 eV)
y C-OH y C-O (532,6 eV) (Figura 26 a). Hay que resaltar la ausencia de fosfato y calcio
[55, 116, 117]
sobre la superficie del Ti-Q en presencia de BSA. Estudios previos indican
que existe una competición entre la adsorción de los iones fosfato y la albúmina,
puesto que estos iones fosfato pueden competir con los grupos carboxílicos de la BSA
por intercambiarse con los grupos hidroxilo básicos de la superficie del Ti-Q. También
sabemos que el calcio aumenta la adsorción de la BSA, probablemente debido a que
actúa como puente entre el Ti y la BSA [118].
Cuando el Ti-Q se sumerge, durante 7 días, en la disolución de FBS, el espectro

de XPS no muestra diferencias significativas con respecto al espectro de la BSA, a
pesar de la complejidad de dicha composición (Figura 26 b, Anexo 7.2).
Si se estudia la variación del porcentaje atómico (Tabla 10), se observa que a

medida que aumenta la complejidad del medio, el porcentaje de Ti en la superficie va
decreciendo, sin ser significativo en presencia de glucosa, BSA y FBS. Después de la
inmersión del Ti-Q durante 7 días en BSA y FBS en la superficie no se detecta la
presencia de fósforo ni de calcio, aunque se conoce la capacidad que tienen los iones
Ca2+ de establecer un enlace puente entre los grupos COO - de la BSA y la carga
negativa superficial del Ti-Q. Posiblemente el espesor de la capa de proteínas impida
dicha detección. Además, los porcentajes atómicos del carbono y el nitrógeno
alcanzan su valor máximo para el Ti-Q sumergido en BSA y FBS manifestando la
presencia de proteínas adsorbidas sobre la superficie de dicho material.
Tabla 10. Tabla de % atómico de cada elemento, en la superficie de Ti-Q, sumergido durante 7 días en
cada uno de los componentes del DMEMc.
Muestra Ti (at%) O (at%) C (at%) P (at%) Ca (at%) N (at%)
Ti-Q 19,0 55,1 25,9 - - -

Ti-Q/P 13,5 54,3 30,8 1,5 - -
Ti-Q/PCa 6,1 43,0 46,0 3,3 1,6 -
Ti-Q/PCaG 0,3 44,0 54,7 - - -
Ti-Q/BSA 0,5 26,1 60,9 - - 12,0
Ti-Q/FBS 1,1 26,1 60,0 - - 14,6
4.1.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en los distintos componentes
del DMEMc
4.1.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de inmersión
El primer parámetro electroquímico estudiado fue la evolución del potencial de

corrosión (Ecorr) en función del tiempo de inmersión (1-7 días) del Ti-Q en cada una de
las disoluciones: NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa
(PCaG), albúmina (BSA) y suero fetal bovino (FBS) (Figura 27).
En la Figura 27 se puede observar la evolución del potencial de corrosión, Ecorr,

a lo largo del tiempo de inmersión. Durante los dos primeros días de inmersión
aumenta rápidamente hacia valores anódicos, hasta alcanzar un valor prácticamente
constante a partir del cuarto día de ensayo. Este aumento del Ecorr, indica que, al
sumergir el Ti-Q en cualquiera de las disoluciones de los componentes del DMEMc, se
produce un ennoblecimiento de la superficie en mayor o menor grado dependiendo
de la disolución. Para el Ti-Q sumergido en las disoluciones de P y PCaG se obtienen
resultados muy parecidos. Los valores de Ecorr para estas dos disoluciones son más
anódicos que en el caso de la disolución PCa (Figura 27), lo que indica que en
presencia de glucosa el efecto de los iones Ca2+ está apantallado. Para el caso de las
disoluciones de BSA y FBS se obtienen valores de Ecorr más catódicos que para el resto
de las disoluciones, lo que indica que el Ti-Q tiene una mayor actividad electroquímica
o tendencia a corroerse en estas disoluciones, debido probablemente al efecto
acomplejante de las proteínas con los iones Ti4+.
Figura 27. Evolución del Ecorr con el tiempo de inmersión para el Ti-Q en (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4
+ CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦) suero fetal bovino (FBS).
Para evaluar la respuesta a la corrosión del Ti-Q en cada una de las disoluciones
(P, PCa, PCaG, BSA y FBS) de los componentes del medio celular (DMEMc), se
obtuvieron las curvas de polarización (± 0,5 V respecto al Ecorr) después de 7 días de
inmersión en cada una de ellas (Figura 28). Asimismo, en la Tabla 11 aparecen el Ecorr y
las pendientes de Tafel anódica y catódica para el Ti-Q después de 7 días de inmersión
en cada una de las disoluciones en estudio.
Tabla 11. Pendientes de Tafel y Ecorr para el Ti-Q después de 7 días de inmersión en cada una de las
disoluciones de los componentes del DMEMc.
Disoluciones Ecorr (V) c (V) a (V)
P 0,192 0,124 0,522
PCa 0,007 0,261 1,154
PCaG 0,176 0,126 0,469
BSA -0,040 0,379 0,368
FBS -0,016 0,512 0,744
Si se comparan las curvas de polarización catódica (Figura 28 a), tanto para la

disolución de fosfato como en presencia de iones Ca2+ (PCa) y con glucosa (PCaG), se
distinguen dos intervalos de sobrepotencial. En el primero (de 0 V a -0,200 V) tiene
lugar la reducción del oxígeno disuelto en el electrolito [119]. En el segundo intervalo de
sobretensión (de -0,200 V a -0,500 V) tiene lugar la transferencia de carga debida a la
reducción de los protones presentes en la disolución (pH = 7,4), así como la reducción
del oxígeno, ya que se trata de un medio aireado (diagrama de Pourbaix Anexo 7.3).
La pendiente de Tafel catódica para el Ti-Q sumergido en la disolución de

fosfato fue de 0,124 V. Según Gnanamuthu [120] habría diferentes mecanismos para la
reducción del oxígeno que justificarían este valor de la pendiente de Tafel. Es difícil,
por no decir imposible, determinar un mecanismo de reacción por medio de un único
[120]
parámetro de Tafel. Los mecanismos propuestos para otros metales incluyen la
formación de un intermediato O2H- en una etapa lenta.
O2 + H2O + e- + M → MHO2 + OH-
Las posibles reacciones posteriores implican la formación de un óxido metálico

y el recubrimiento por OH-. Por ejemplo:
Figura 28. Curvas de polarización del Ti-Q después de 7 días en (a) (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 +
CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG) y (b) (●) albúmina (BSA) y (▲) suero fetal bovino
(FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s.
M + O2 + e- → MO + OH-
MO + H2O + e- → MOH + OH-
MOH + e- → M + OH-
-------------------------------------------------------------
O2 + 2H2O + 4e- → 4OH-
La adición de CaCl2 a la disolución de fosfato da lugar a una significativa

disminución de la corriente catódica con un aumento en la pendiente de Tafel (Tabla
11). Esta disminución en la icat puede estar relacionada con la formación de
compuestos de fosfato y calcio sobre la superficie del Ti-Q, detectados por XPS. En
presencia de glucosa (disolución PCaG), la curva de polarización catódica obtenida
para la reducción del oxígeno es similar a la obtenida en fosfato, aunque estén
presentes los iones Ca2+, manteniendo el valor de 0,126 V para la pendiente de Tafel.
Podemos decir que la glucosa parece inhibir la formación de esos compuestos de
fosfato y calcio.
Por otro lado, en cuanto al comportamiento anódico (Figura 28 a), se puede

observar una respuesta muy similar para el Ti-Q sumergido en las disoluciones de
fosfato (P) y de glucosa (PCaG). La densidad de corriente aumenta debido a la
formación de la capa de óxido de titanio. Sin embargo, en la disolución de PCa se
obtiene un valor de la pendiente de Tafel anódica que es, prácticamente, el doble
(Tabla 11), indicando que el proceso cinético de la oxidación está todavía más
impedido debido a la incorporación de los iones Ca2+ y PO43- a la capa pasiva de TiO2.
Si se comparan los valores de las pendientes de Tafel anódicas y catódicas para las
disoluciones de P, PCa y PCaG, se observa que en todos los casos existe un control
anódico, que estará determinado por la resistencia a la corrosión de la capa pasiva de
TiO2 con los iones o moléculas incorporadas.
En la Figura 28 b, se muestran las curvas de polarización del Ti-Q después de 7

días sumergido en las disoluciones de BSA y FBS. Para la disolución de BSA, tanto la
corriente catódica como la anódica alcanzan valores superiores a los obtenidos para la
disolución de FBS, además de una disminución en los valores de las pendientes de
Tafel correspondientes (Tabla 11). El FBS además de la albúmina, contiene muchos
otros componentes como aminoácidos, proteínas, hormonas, etc. (Anexo 7.2) que
parecen bloquear los sitios activos donde tiene lugar la reducción del oxígeno [49].
Por otra parte, es conocido que las proteínas (como la BSA) pueden acelerar la
[121, 122]
disolución de los metales por sus efectos quelantes , favoreciendo la reacción
anódica. Los valores de las pendientes de Tafel anódica y catódica para las
disoluciones de BSA y FBS (Tabla 11), indican que existe un control mixto del proceso
de corrosión.
Figura 29. Densidad de corriente catódica calculada a  = -0,2 V para el Ti-Q en cada una de las
Otra manera de estudiar el efecto de cada uno de los componentes del DMEMc
sobre el Ti-Q fue medir la densidad de corriente catódica para una sobretensión de
[119]
-0,2 V respecto al Ecorr (Figura 29). A dicho potencial tiene lugar la reducción del
oxígeno. Los resultados muestran que en presencia de Ca2+ la densidad de corriente

disminuye con respecto al valor obtenido para la disolución de iones fosfato; es decir,
los iones calcio bloquean los sitios activos para la reducción del oxígeno. Es
importante resaltar, que dicha reacción catódica está algo más favorecida para el Ti-Q
tratado con BSA que para el Ti-Q tratado con FBS, aunque ambos medios contengan
proteínas.
En la Figura 30 se muestra la evolución en los diagramas de Bode del módulo

de impedancia y del ángulo de fase frente a la frecuencia, para las muestras de Ti-Q
sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de iones fosfato (P) (Figura 30 a y b) y
de iones fosfato e iones calcio (PCa) (Figura 30 c y d). A altas frecuencias se observa un
valor constante del módulo de impedancia, con °correspondiente a la
resistencia del electrolito (Re) de cada disolución. Para valores de frecuencia entre
100 y 10-2Hz se obtiene una recta de pendiente -0,91 que puede ser atribuida a un
condensador en paralelo con una resistencia. En el intervalo de frecuencias más bajas
(10-2 - 10-3Hz) se obtiene una recta de pendiente -0,83 y el valor del ángulo de fase se
acerca a -90°, aproximándose a un comportamiento capacitivo.
Los diagramas de la Figura 30 se ajustaron al circuito eléctrico equivalente de la

Figura 30 e, donde Re es la resistencia del electrolito medida entre el electrodo de
referencia y el electrodo de trabajo; R2 es la resistencia; CPE2 es un elemento de fase
constante o CPE (constant phase element), que simula un comportamiento no lineal
de un condensador, asociados ambos elementos con la interfase electrolito/P-TiO2 o
bien electrolito/PCa-TiO2; R1 y CPE1 son la resistencia y la pseudocapacidad asociada
con la interfase electrolito/TiO2-Ti.
Figura 30. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 (a)
módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c)
módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados
experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).
En presencia de glucosa (Figura 31), se observa un comportamiento que en

principio, parecía muy similar al del Ti-Q en las disoluciones de iones fosfato (P) y de
iones fosfato y calcio (PCa). Sin embargo, el intervalo de frecuencias donde el valor del
ángulo de fase está próximo a -90° aumenta, alcanzándose dicho valor a frecuencias
más altas (102 Hz). El valor de la pendiente (-0,90) así como el valor de ángulo de fase
le confieren a la interfase electrolito/glucosa-TiO2 un carácter capacitivo, siendo el
proceso de adsorción de la glucosa bastante rápido, ya que los resultados no varían
prácticamente durante los siete días de ensayo. Los resultados experimentales se
ajustaron utilizando el circuito de la Figura 31 c. Dicho circuito representa la superficie
de Ti-Q recubierta prácticamente por la glucosa adsorbida durante los 7 días de
ensayo. Conviene recordar que los resultados de XPS indicaban que el % Ti era
prácticamente cero y la banda correspondiente al TiO 2 no aparecía (Figura 25). Los
dos módulos RC en serie representan las dos interfases existentes en el sistema Ti-
Q/PCaG, siendo Re la resistencia del electrolito, R2 y CPE2 la resistencia y la
pseudocapacidad de la interfase externa electrolito/glucosa adsorbida sobre el TiO 2-Ti
y R1 y CPE1 la resistencia y la pseudocapacidad asociadas con la interfase interna
glucosa/TiO2-Ti.
Figura 31. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 +
CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los
resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (c).
Figura 32. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA a)
módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de FBS c) módulo de
impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―)
son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente e).
En la Figura 32, se muestran los diagramas de Bode para el Ti-Q sumergido en

las disoluciones de BSA (Figura 32 a y b) y FBS (Figura 32 c y d), así como el circuito
eléctrico equivalente (Figura 32 e) utilizado para ajustar los resultados experimentales
de impedancia obtenidos para ambas disoluciones. En presencia de BSA, a altas
frecuencias, aparece el valor de la resistencia del electrolito (Re) (Figura 32 a). A

frecuencias intermedias, entre 104 y 10-1 Hz, el módulo de impedancia aumenta
linealmente con una pendiente de -0,81; esta respuesta es asignada a un
pseudocondensador en paralelo con una resistencia. A frecuencias bajas, entre 10-1 y
10–3 Hz, se observa un cambio de pendiente en el módulo de impedancia (-0,73) para
todos los tiempos de ensayo, que se corresponde con una disminución en el ángulo
de fase (Figura 32 b) de  = -73° a -65° a una frecuencia de 10-1 para aumentar hasta
alcanzar otro máximo a 4·10-3Hz de frecuencia y un valor de  = -68°. En este caso los
diagramas de impedancia se mantienen desde el primer día de ensayo en los mismos
valores de impedancia y ángulo de fase. Esto indica que la albúmina se adsorbe sobre
el Ti-Q en los primeros instantes de la inmersión sin modificación a lo largo del tiempo
de ensayo, alcanzándose un recubrimiento completo de la superficie como muestran
los resultados de XPS. Teniendo esto en cuenta, los resultados experimentales se han
ajustado con dos constantes de tiempo (Figura 32 e): la primera (= CPE2·R2) se
asocia con la interfase externa electrolito/proteínas-TiO2 y la segunda (= CPE1·R1)
está asociada a la respuesta de la interfase interna proteínas/TiO2-Ti. El mismo efecto
se obtiene para el FBS (Figura 32 c y d) pero el cambio de pendiente, en el módulo de
impedancia, se da a frecuencias más altas (entre 0,04 y 10-3 Hz) que para la BSA y, por
consiguiente, el ángulo también cambia en base a ese intervalo.
En la Tabla 12 se muestran los resultados obtenidos del ajuste de los resultados

experimentales a los respectivos circuitos eléctricos equivalentes, para las muestras
de Ti-Q sumergidas en fosfatos, fosfatos e iones calcio y en glucosa. Para el Ti-Q
sumergido en la disolución P (Tabla 12), en general, los valores de CPE1 y CPE2
disminuyen ligeramente y por tanto, R1 y R2 aumentan levemente con el tiempo de
ensayo, sobre todo del primer al tercer día de inmersión. CPE2 está asociada con la
interfase formada entre el electrolito y los grupos Ti-OH (algunos pueden haber sido
reemplazados por grupos Ti-OP). El ligero descenso de los valores de CPE1 puede
corresponder al lento crecimiento de la película de óxido de titanio con el
consiguiente enriquecimiento en iones fosfato de la película, indicando una gran

estabilidad de la fina capa pasiva de TiO2 en la disolución de fosfatos. Los valores de
R1 son muy altos (cerca de 7-25 MΩ) y aumentan ligeramente con el tiempo de
ensayo. Estos valores tan altos para R1, implican una alta resistencia a la corrosión, es
decir, una baja velocidad de disolución del Ti y crecimiento del óxido de titanio. Un
dato a tener en cuenta es que la interfase formada por el electrolito/Ti-OP tiene una
baja resistencia (R2), lo que hace pensar que la contribución de esta interfase a las
propiedades electroquímicas es baja y por tanto, la respuesta en impedancia va a
estar dominada por la interfase electrolito/TiO2-Ti.
Cuando se añade CaCl2 a la disolución de NaH2PO4 (disolución PCa), las medidas

de impedancia durante los siete días de ensayo muestran la misma respuesta
independientemente del tiempo de medida (Figura 30 c y d). Los valores de CPE2 y
CPE1 disminuyen y, por tanto, R2 y R1 aumentan ligeramente con el tiempo de
ensayo, especialmente del primer al segundo día de inmersión (Tabla 12). Esta
disminución en los valores de CPE2 puede corresponder con la adsorción de los iones
Ca2+ por medio de los grupos hidroxilo ácidos, a la superficie del titanio, así como a la
adsorción de iones fosfato por medio de los iones Ca2+ o los grupos hidroxilo básicos
(Ti2OH+) [38, 123]
como se muestra en las medidas de XPS (Tabla 9). Los valores de R1
son mayores que los obtenidos para la disolución de fosfatos y aumentan ligeramente
con el tiempo de inmersión. La adición de calcio a la disolución de fosfato aumenta al
doble la resistencia del óxido de titanio (R1), ya que se incorporan a la capa pasiva
aumentando su resistencia frente a la corrosión. Estos resultados están de acuerdo
con los obtenidos por Cheng y Roscoe [119].
2
Super- t Re R2 % Error CPE2 % Error n2 R1 % Error CPE1 % Error n1 
ficie 2 -2 -(1-n) 2 -2 -(1-n)
días  cm (R2) Fcm s (CPE2) cm (R1) Fcm s (CPE1)
6 -4
1 57,9 95,6 25,5 16,37 37,7 0,93 7,5·10 2,5 20,10 31,4 0,92 3,2·10
7 5,5 -4
3 61,7 104,7 24,7 15,17 35,3 0,93 2,1·10 16,99 30,1 0,92 6,8·10
Ti-Q/ P 7 6,2 -4
4 62,0 102,8 24,7 14,79 36,1 0,93 2,7·10 16,50 32,3 0,92 6,6·10
7 7,2 -4
6 73,9 113,6 26,4 13,72 37,7 0,93 1,7·10 15,95 33,2 0,92 4,5·10
7 8,7 -4
7 63,0 118,4 24,1 13,61 33,4 0,93 2,6·10 14,94 30,1 0,92 5,8·10
7 15,8 -4
1 61,3 59,6 29,2 9,59 61,0 0,88 3,7·10 15,23 38,3 0,87 6,0·10
7 12,0 -3
2 68,2 70,7 39,2 7,99 83,8 0,88 3,3·10 12,97 51,5 0,87 1,4·10
7 18,1 -3
3 63,0 71,6 35,5 7,23 83,9 0,88 5,1·10 13,02 46,3 0,87 1,4·10
Ti-Q/
7 22,3 -3
4 64,7 74,0 35,6 6,94 87,0 0,88 3,9·10 12,97 46,1 0,87 1,6·10
PCa
7 33,1 -3
5 64,9 73,5 34,5 6,51 88,1 0,88 6,3·10 13,34 44,4 0,87 1,8·10
7 26,1 -3
6 64,2 76,8 32,9 5,53 85,0 0,88 7,5·10 13,12 42,1 0,87 1,7·10
7 21,6 -3
7 63,4 75,8 32,1 6,39 85,3 0,88 6,1·10 13,32 41,0 0,87 1,8·10
7 13,5 -3
1 92,2 51,0 9,5 8,31 40,6 0,90 1,6·10 33,10 10,4 0,91 1,4·10
7 3,7 -4
2 91,5 54,9 4,0 9,17 12,6 0,88 1,4·10 29,47 4,4 0,91 3,9·10
7 4,1 -4
3 92,4 53,0 9,6 7,58 36,6 0,90 1,2·10 26,20 10,7 0,91 8,8·10
Ti-Q/
7 4,9 -4
4 92,3 57,9 7,1 7,09 26,9 0,90 1,6·10 24,40 8,0 0,91 7,3·10
PCaG
las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG).
7 3,8 -4
5 84,8 58,0 6,8 8,03 21,9 0,90 1,6·10 22,40 8,0 0,91 4,8·10
7 3,9 -4
6 83,0 58,2 5,6 7,85 17,5 0,90 1,7·10 21,60 6,5 0,92 4,8·10
Tabla 12. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en
7 4,6 -4
7 83,6 59,3 6,4 8,04 18,6 0,90 1,8·10 20,60 7,4 0,92 6,2·10
2
Super- t Re R2 % Error CPE2 % Error n2 R1 % Error CPE1 % Error n1 
ficie
2 -2 -(1-n) 2 -2 -(1-n)
7 -4
1 74,0 55,4 4,5 85,83 20,6 0,72 9,0·10 34,4 37,04 0,2 0,92 4,2·10
8 -4
2 74,0 47,6 2,7 66,41 13,8 0,76 2,0·10 33,2 37,19 0,1 0,92 2,0·10
8 -4
3 73,8 47,6 3,1 74,82 14,9 0,75 4,0·10 73,8 37,25 0,1 0,92 2,8·10
las disoluciones de BSA y FBS.
Ti-Q/ 8 -4
4 72,2 47,2 3,0 87,81 14,6 0,73 2,6·10 69,5 37,81 0,1 0,91 2,0·10
BSA
8 -4
5 71,5 46,4 3,6 92,70 17,2 0,72 1,3·10 27,4 39,34 0,2 0,91 3,0·10
8 -4
6 71,4 45,9 2,4 86,35 11,7 0,73 1,6·10 23,5 38,98 0,1 0,91 1,4·10
8 -5
7 73,4 49,0 2,3 90,51 10,8 0,72 1,2·10 22,8 38,03 0,1 0,91 9,3·10
7 -3
1 65,7 61,6 3,5 117,52 5,1 0,71 3,6·10 33,0 71,61 0,1 0,91 1,6·10
7 -4
2 65,4 79,4 3,3 235,77 11,4 0,61 4,3·10 19,6 76,64 0,2 0,91 3,0·10
7 -4
3 66,1 129,9 5,1 413,87 10,7 0,54 4,0·10 24,2 81,75 0,2 0,90 4,2·10
Ti-Q/ 7 -4
4 69,4 160,2 6,3 519,71 10,6 0,52 5,7·10 33,0 80,29 0,2 0,91 3,7·10
FBS
7 -4
5 69,4 169,3 7,7 556,20 11,9 0,51 4,8·10 32,8 81,02 0,3 0,90 5,0·10
7 -4
6 70,1 186,5 8,3 591,97 11,3 0,50 5,1·10 35,7 80,29 0,3 0,90 6,1·10
7 -4
7 68,8 193,9 8,0 569,34 10,7 0,51 3,9·10 29,4 83,94 0,3 0,90 6,1·10
Tabla 13. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en
En presencia de glucosa, las medidas de impedancia durante los siete días de

ensayo muestran la misma respuesta independientemente del tiempo de inmersión.
Es necesario recordar que, en este caso, el circuito eléctrico equivalente consta de dos
módulos RC en serie (Figura 31 c). Los valores de CPE2 no cambian con el tiempo,
indicando que la adsorción de la glucosa sobre la superficie del Ti-Q es rápida y llega al
estado estacionario a tiempos cortos de inmersión. Sin embargo, los valores de CPE1
disminuyen con el tiempo de ensayo, indicando que la glucosa adsorbida en el Ti-Q
permite la difusión iónica y/o de oxígeno a su través, dando lugar a un aumento del
espesor del óxido de titanio. Este efecto concuerda con el ligero aumento que se
obtiene para R1 con el tiempo de inmersión a partir del segundo día, debido al lento
crecimiento del óxido superficial. La resistencia del electrolito (Re) se mantiene en
valores similares a los de las disoluciones anteriores (Tabla 12).
Cuando el Ti-Q se sumerge en una disolución de BSA, NaH2PO4 y CaCl2

(disolución de BSA) (Figura 32 a y b) los resultados obtenidos se ajustaron a dos
módulos RC en serie (Figura 32 e), en el que el más externo corresponde a la interfase
electrolito/BSA y el más interno se asocia con la interfase BSA/TiO2-Ti. La resistencia
del electrolito (Re) aumenta si se compara con los valores obtenidos sin BSA (Tabla
13) debido a la incorporación de la albúmina a la disolución. R2 y CPE2 se mantienen
prácticamente constantes a lo largo del tiempo de ensayo, indicando que la BSA se
adsorbe en los primeros instantes y no evoluciona a lo largo del mismo. Por otro lado,
R1 y CPE1 también se mantienen estables con el tiempo de ensayo, lo que indica que
la BSA no permite la difusión de oxígeno a su través con tanta facilidad como la
glucosa, y la capa pasiva de TiO2 se mantiene inalterada durante el experimento.
Por último, cuando las muestras de Ti-Q se sumergen en una disolución de FBS,
los diagramas de impedancia son muy similares a los obtenidos para la disolución de
BSA; además, los espectros de impedancia se han ajustado utilizando el mismo
circuito eléctrico equivalente. Sin embargo, R2, la resistencia asociada a la interfase
externa electrolito/proteínas, aumenta con el tiempo de inmersión adquiriendo
valores mucho mayores que en presencia de BSA al cabo de 7 días de ensayo. El valor
de n2, asociado con CPE2, disminuye, indicando que existe una mayor contribución de
difusión iónica a través de la película proteínica. Otra diferencia importante es que R1,
resistencia de la interfase interna proteínas/TiO 2-Ti, es un orden de magnitud menor
que en presencia de BSA, lo que indica que existen en el FBS otros componentes que
activan la superficie del Ti-Q disminuyendo la resistencia de la capa de óxido de
titanio.
Transformadas de Kramers-Kronig (K-K)
Una vez analizados y ajustados los diagramas de impedancia obtenidos para el

Ti-Q sumergido en las disoluciones de los distintos componentes del DMEMc, se
procedió a calcular las transformadas de Kramers-Kronig (K-K) [100], con el objetivo de
evaluar la fiabilidad de los resultados experimentales obtenidos.
En la Figura 33, se muestran los diagramas en los que se representan los

resultados experimentales y los calculados a partir de las transformadas de K-K, para
el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones P, PCa y PCaG. De la misma
manera, en la Figura 34, se muestran los resultados para el Ti-Q sumergido, durante 7
días, en las disoluciones de BSA y FBS.
Como se puede observar en las Figura 33 y 34, la consistencia de los resultados

experimentales es excelente. No obstante, se han calculado los errores medios
comparando los resultados obtenidos de las transformadas de K-K con los resultados
originales utilizando la ecuación (9) (Tabla 14).
∑ | |
̅ (9)
Figura 33. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las
disoluciones de: a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), y
resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).
donde N es el número de puntos, Zex es el valor de la impedancia experimental, ZKK es

el valor de la impedancia obtenido por medio de los K-K y Zmax el valor máximo de la
impedancia.
Figura 34. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las
disoluciones de: a) BSA y b) FBS, y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig
(K-K)(+).
[124]
Dougherty y Smedley consideran que, la fiabilidad de los resultados
obtenidos de las medidas de impedancia es buena o aceptable cuando el error medio,
tanto de la componente real como de la imaginaria, se encuentran por debajo del 3%.
El error medio obtenido para cada una de las transformadas de K-K no supera el 0,8%,
por tanto los resultados experimentales satisfacen las transformadas de K-K.
Carece de interés incluir los diagramas de las transformadas de K-K para todos
los días de medida, aunque sí han sido calculados dando resultados también en
excelente concordancia.
Tabla 14. Errores medios calculados, por medio de la expresión (9), de las representaciones de
Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el Ti-Q
sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 +
CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS.
Error medio (%)
Disoluciones Componente real (Z´) Componente imaginaria (Z”)
P 0,792 0,167
PCa 0,681 0,062
PCaG 0,463 0,547
BSA 0,528 0,072
FBS 0,471 0,514
4.1.5 Discusión
Cuando una superficie de titanio se expone al aire, se forma espontáneamente

una fina capa de óxido en su superficie. Los análisis de XPS muestran que en la
interfase óxido/metal los estados de oxidación del titanio son predominantemente
Ti2+ y Ti3+, mientras que en la interfase aire/óxido predomina el estado de oxidación
Ti4+ [33, 125]. Sin embargo, en el caso del Ti evaporado sobre la superficie del cristal de
cuarzo, se han detectado fundamentalmente TiO2 y en muy baja proporción Ti2O3.
Parker y Kelly [126] han demostrado que la aparición de subóxidos puede ser debido a
la reducción del TiO2 por medio del haz de iones de argón dentro del equipo de XPS.
No obstante, la cantidad de Ti2O3 es muy pequeña con respecto al TiO2. Además, se
[118]
obtiene una banda que corresponde al enlace Ti-OH. Hughes-Wassell y col.
sugieren que existen dos tipos de grupos hidroxilo coexistiendo en la superficie del
TiO2-Ti debido a la quimisorción del agua que hace que la superficie esté cargada
negativamente a pH fisiológico.
Después de sumergir una muestra de Ti-Q en una disolución que contiene

NaH2PO4, se obtiene un crecimiento de la película de óxido de titanio en la superficie
del electrodo, aumentando su resistencia a la corrosión y disminuyendo la corriente
de disolución anódica. El Ecorr se mueve de 0,017 V a valores anódicos hasta llegar a un
valor estable de 0,192 V después de siete días (Figura 27). Los resultados de EIS para
este tiempo de ensayo, muestran que la respuesta de impedancia está dominada por
la alta resistencia (R1 ≈ 7-25 MΩ) asignada a la interfase electrolito/TiO2-Ti con una
baja contribución de la interfase electrolito/Ti-OP. No obstante, la presencia de los
iones fosfato en la superficie del electrodo ha sido confirmada tanto por los
resultados obtenidos por XPS (Tabla 9) como por la ganancia de masa observada a
través de la QCM. Es conocido que el H2PO4- y el HPO42- pueden formar complejos con
el Ti mediante una reacción de intercambio con los grupos hidroxilos básicos, según la
siguiente reacción [38, 56]:
(Ti-OH2+)sólido + H2PO4- ac ↔ (Ti...H2PO4)sólido + H2O
La adición de CaCl2 a la disolución de NaH2PO4, desplaza el Ecorr hacia valores

más catódicos y disminuye la corriente catódica y la anódica. En efecto, la pendiente
de Tafel catódica aumenta de 0,124 V para la disolución de NaH 2PO4, hasta 0,261 V
para la disolución en presencia de Ca2+, reflejando que la reducción del oxígeno está
más impedida (Tabla 11). Esto puede ser atribuido al efecto bloqueante de
compuestos de calcio y fosfato para la reacción catódica. Si la presencia de estos iones
disminuye la corriente catódica, se espera una disminución en la corriente anódica
que provoque una disminución de la velocidad de corrosión. Dicho comportamiento
es verificado por la alta resistencia asociada con la interfase electrolito/TiO 2-Ti, ya que
aumenta prácticamente al triple con respecto a la disolución con fosfatos, como
muestran los resultados obtenidos por impedancia (Tabla 12). De acuerdo con Lima y
[55]
col. , la formación de compuestos de fosfato y calcio es un proceso relativamente
lento que necesita un período de 1 o 2 semanas, controlado probablemente por la
velocidad de nucleación. De hecho, los resultados de QCM obtenidos para la
disolución de NaH2PO4 + CaCl2, confirman la baja velocidad de formación de los
compuestos de fosfato y calcio (Figura 21). Además, los resultados de XPS muestran
que después de siete días en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2, en la superficie del Ti-Q
hay solo un 1,6% de Ca y un 3,3 % de P, aunque la adsorción de los iones fosfato se ve
claramente aumentada por la presencia de los iones calcio (Tabla 10). Por tanto, la
presencia de estos iones en la superficie del Ti-Q, después de los siete días de
inmersión, no es suficiente para inducir la nucleación y crecimiento de precipitados de
Ca/P. De hecho, la relación Ca/P es demasiado baja (0,48) para inducir la precipitación
[44]
del fosfato tricálcico o la apatita (1,67) . La incorporación de los iones calcio y
fosfato a la película de óxido de titanio se ha encontrado tanto “in vivo” [127] como “in
vitro” [42]. Según la bibliografía, la velocidad de precipitación “in vitro” de una capa de
hidroxiapatita sobre el titanio fue varios órdenes de magnitud más lenta que, por
[56, 128]
ejemplo, sobre las cerámicas bioactivas . Además, la osteointegración de los
implantes de Ti, normalmente requiere muchos meses [129], lo cual nos da una idea de
lo lenta que es la cinética de crecimiento del hueso.
En presencia de glucosa, los iones calcio no parecen tener ningún efecto ya que
las curvas de polarización son muy similares a las obtenidas para la disolución de
NaH2PO4, como se puede comprobar por los valores de las pendientes de Tafel (Tabla
11). Esto indica que la reacción de reducción del oxígeno no está impedida. Según los
espectros de XPS (Tabla 9, Figura 24), la superficie del electrodo está completamente
cubierta por la glucosa adsorbida. Sin embargo, permite la difusión iónica del oxígeno
hacia el electrodo, así como el crecimiento lento del óxido, según indican los valores
de la resistencia asociada con la interfase interna glucosa/TiO2-Ti que aumentan muy
lentamente con el tiempo de ensayo.
Existen otros componentes del medio fisiológico, que también intervienen en

el mecanismo de corrosión de las superficies de Ti-TT: las proteínas. De todas las que
existen en este medio celular, la más abundante es la albúmina. Por ello, se eligió la
albúmina como modelo para estudiar y comprender cómo afecta la presencia de las
proteínas en el comportamiento frente a la corrosión del sistema. La presencia de la
BSA junto con los iones calcio y fosfato provoca un cambio en los valores de E corr hacia
valores más anódicos a medida que aumenta el tiempo de tratamiento. Para esta
disolución se obtiene un valor de la pendiente de Tafel catódica de 0,379 V, indicando
que la adsorción de BSA inhibe la difusión del oxígeno hacia la superficie del
electrodo. Las medidas de QCM muestran que se forman 1,5 monocapas de BSA en 14
horas de inmersión en ausencia de iones calcio y fosfato. Por otra parte, los valores de
la capacidad asociada con la interfase externa electrolito/proteínas-TiO2 indican que
se llega al estado estacionario en periodos cortos de tiempo. Estos resultados indican
que las moléculas de BSA adsorbidas sobre la superficie podrían prevenir la liberación
del titanio al seno de la disolución (verificado por análisis de ICP masas).
[130]
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Khan y col. que
muestran que la resistencia de corrosión no se ve afectada por la presencia de las
proteínas. En nuestro caso, tanto la resistencia asignada a la interfase externa
electrolito/BSA como la de la interfase interna BSA/TiO 2-Ti permanecen constantes
con el tiempo de inmersión en las medidas de impedancia. La presencia de iones Ca 2+
en la disolución de BSA da lugar a una mayor disminución de la frecuencia (Figura 22
b) según muestran las medidas de QCM, confirmando que la adsorción de la BSA está
favorecida cuando en el medio se encuentran los iones Ca2+. A pH fisiológico, la
albúmina está cargada negativamente (PI = 4,7- 4,9). La incorporación de los iones de
calcio a la molécula de BSA puede favorecer la atracción de ésta hacia la superficie de
Ti-Q, ya que se encuentra cargada negativamente debido a los grupos hidroxilo ácidos
presentes en el óxido de Ti. Por tanto, los iones Ca2+ intervienen en la adsorción
electrostática de la BSA con la superficie de titanio actuando como puente. Sin
embargo, este modelo electrostático no explica por qué la BSA se adsorbe en ausencia
de estos iones (a potencial a circuito abierto) sobre la superficie de titanio, como
muestran los resultados de QCM. De acuerdo con Hughes y col. [118] los efectos de la
hidratación tienen un papel muy importante, permitiendo que entren en juego
fuerzas atractivas de corto alcance.
Los resultados de XPS obtenidos para el Ti-Q después de 7 días de inmersión en

FBS, no muestran diferencias significativas cuando se comparan con los obtenidos
para las muestras sumergidas en BSA. Es más, sólo se detecta la adsorción de BSA
(Figura 26, Tabla 9). Sin embargo, la pendiente de Tafel catódica es mayor que la
obtenida para la BSA, indicando, en este caso, que la difusión del oxígeno hacia la
superficie de Ti-Q está más impedida. Además, la disminución de la frecuencia, en los
experimentos de QCM, es mayor en valor absoluto para el FBS (-66Hz) que en
presencia de BSA (-57 Hz), reflejando que tiene lugar la adsorción de otras moléculas
presentes en el FBS.
Los valores de la resistencia asociada con la interfase externa

electrolito/proteínas-TiO2 de las muestras sumergidas en FBS, aumentan ligeramente
a lo largo del tiempo de inmersión y son mayores que los obtenidos para la BSA (Tabla
13). Este hecho se puede justificar porque la cantidad de proteínas en esta disolución
y adsorbidas, es mayor que para el caso de las muestras sumergidas en BSA. De hecho
si se comparan los valores obtenidos para la resistencia de dicha interfase (R2) (Tabla
13), después de 7 días de ensayo, se observa que para el FBS es prácticamente cinco
veces mayor que para la disolución de BSA (193,9 vs 49,0 ·cm2). Esto explicaría que
la corriente catódica, debido a la reducción de oxígeno, sea menor para el FBS que
para la BSA. Además, a partir de las medidas de impedancia (Tabla 13), la evolución a
lo largo del tiempo de inmersión del valor de n2, asociado a la interfase externa
electrolito/proteínas, muestra que no se trata de un capacitor puro sino que, al
mismo tiempo, se está dando un proceso de difusión iónica a través de la película
orgánica. Dado que la resistencia de la interfase interna proteínas/TiO 2 ha disminuido
con respecto a la de la BSA, es posible que existan procesos de corrosión en esta

interfase debido al efecto corrosivo de algún componente presente en el FBS.
4.2 Estudio de la interfase Ti-Q/Osteoblastos Saos-2
Uno de los momentos más importantes en el proceso de osteointegración de

un implante en un medio vivo es el contacto de las células osteoblásticas con la
superficie metálica del mismo. Este contacto determinará la adhesión, extensión y
proliferación celular, y será decisivo para el éxito del implante. En este capítulo se van
a estudiar las modificaciones que sufre la superficie del Ti-Q como consecuencia de la
interacción con las células formadoras de hueso como son los osteoblastos Saos-2.
4.2.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM)
La microscopía electrónica de barrido se ha utilizado para caracterizar la

morfología superficial de las muestras de Ti-Q y observar la adhesión, morfología y
extensión de los osteoblastos Saos-2 sobre la superficie de las muestras de Ti-Q
después de ser sumergidas 1, 3, 5 y 7 días en un cultivo de osteoblastos Saos-2. En
una suspensión celular, la forma de un osteoblasto es esférica, pero para poder
proliferar y sobrevivir en el medio de cultivo, es necesario que se adhieran a una
superficie. Cuando los osteoblastos toman contacto con la superficie de Ti se
producen cambios en su morfología celular. El osteoblasto se deforma, se extiende
sobre la superficie dando lugar a prolongaciones denominadas filopodios, que junto
con las proteínas de adhesión segregadas por los propios osteoblastos darán lugar a
una buena adhesión celular (Figura 35 a).
El mecanismo de adhesión celular sobre superficies sólidas transcurre a lo

largo de distintas etapas, en las que los osteoblastos cambian su morfología e
[131]
interaccionan entre sí . Lo primero que ocurre cuando se sumerge el biomaterial
en el cultivo celular es la adsorción de proteínas a la superficie. En la etapa I, los
osteoblastos, que aún tienen forma esférica, toman contacto con la superficie del
biomaterial y van anclándose a la misma (Figura 35 a); en la etapa II, empiezan a
extenderse sobre la superficie hasta tener una forma más plana, aunque aún se
120 4.2 Estudio de la interfase Ti-Q/Osteoblastos Saos-2
aprecia el citoplasma elevado y el núcleo; finalmente, en la etapa III, los osteoblastos

están muy extendidos y planos, aunque se sigue distinguiendo el núcleo (Figura 35 b).
Figura 35. Imágenes SEM de un osteoblasto Saos-2: a) en una de las etapas iniciales del proceso de
adhesión celular y b) un osteoblasto completamente extendido sobre la superficie.
Una vez que el osteoblasto se ha adherido, empieza a proliferar, es decir, a

llevar a cabo la división celular (Figura 36 a) y a relacionarse con el entorno
moviéndose sobre la superficie e interaccionando con los osteoblastos vecinos (por
medio de los filopodios, Figura 36 b).
Figura 36. Imágenes SEM de los osteoblastos Saos-2: a) en la etapa de proliferación o división celular y
b) adhiriéndose a la superficie de Ti e interconectando por medio de los filopodios con los
osteoblastos vecinos.
En la Figura 37, se muestran las imágenes de la superficie de Ti-Q después de 1,

3, 5 y 7 días de incubación en cultivo celular de osteoblastos Saos-2. Se puede
observar cómo después de las primeras etapas de adhesión (Figura 37 a), los
osteoblastos se multiplican hasta llegar a cubrir casi por completo toda la superficie
con el tiempo (Figura 37 d). Sin embargo, a pesar de este recubrimiento progresivo,
no se consiguió la confluencia celular en toda la superficie de Ti-Q el último día de
ensayo.
Figura 37. Imágenes SEM del Ti-Q con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de incubación en el
cultivo celular.
Un hecho importante en la biocompatibilidad de un material es la adhesión y

proliferación celular sobre su superficie. Con el objetivo de examinar la cinética de
adhesión celular sobre la superficie de Ti-Q, se llevaron a cabo ensayos con la
microbalanza de cristal de cuarzo (QCM). Para ello, se midió la variación de la

frecuencia con el tiempo en ausencia y presencia de osteoblastos Saos-2.
La Figura 38 muestra la variación de la frecuencia con el tiempo para 5·10 4

osteoblastos/cm2 añadidos después de un periodo inicial de incubación de 2 horas en
DMEMc en ausencia de osteoblastos. La disminución de la frecuencia debida al medio
[47]
de cultivo celular (DMEMc) fue de -863 Hz en la etapa previa a la incubación con
los osteoblastos. Este valor es mayor que el correspondiente al agua (f = -776 Hz,
Figura 21), debido a la presencia de sales y proteínas capaces de adsorberse sobre el
Ti-Q. Dicho valor de frecuencia (f = -863 Hz) sirve para establecer la línea base
correspondiente a f = 0 Hz y evaluar la variación en frecuencia causada únicamente
por los osteoblastos.
Figura 38. Medida de QCM del Ti-Q con 5·104 Saos-2/cm2 y despegue celular con tripsina.
Después de inyectar los osteoblastos sobre el Ti-Q en el medio de cultivo, hay

una etapa inicial (10 minutos) durante la cual la frecuencia no varía debido a que tiene
lugar la sedimentación celular (por gravedad). Posteriormente la frecuencia disminuye

debido al contacto y a la adhesión de los osteoblastos sobre la superficie de Ti-Q [84],
hasta alcanzar un valor constante de f = -421 Hz después de 24 horas, tiempo
necesario para completar el proceso de adhesión. Teniendo en cuenta que las
viscosidades del DMEMc y del DMEMc con Saos-2 son muy similares, este cambio en
el f fue asignado a la respuesta de los osteoblastos adsorbidos sobre el cristal de Ti-
Q. Para demostrar que los osteoblastos realmente se han adherido a la superficie se
añadió tripsina al medio, para así romper las uniones de los osteoblastos a la
superficie y provocar el despegue celular [85]
: se obtuvo un f positivo de 243 Hz. Es
necesario resaltar que no se ha obtenido el mismo valor de f para la adhesión (-421
Hz) que para el despegue con tripsina, debido a que los osteoblastos en el proceso de
adhesión segregan matriz extracelular, quedando adherida a la superficie cuando los
[76]
osteoblastos se despegan de ella . Debido al comportamiento viscoelástico de los
[75]
osteoblastos, la ecuación de Sauerbrey no se puede aplicar (apartado 3.3.4), pero
es posible a efectos comparativos considerar que los Saos-2 se comportan como un
medio viscoso. Así se puede utilizar la disminución de la frecuencia en función del
tiempo para estudiar la cinética de adsorción.
El proceso de disminución en frecuencia puede estar controlado por el

transporte (difusión) o por la cinética de adsorción, lo que predice dependencias con
el tiempo de t1/2 o exponenciales, respectivamente. El ajuste cinético de los resultados
experimentales (línea roja de la Figura 38) sigue una cinética de primer orden:
Δf = Δfm (1-e-kt)
Donde Δf es el cambio de frecuencia a un tiempo t, Δfm (-421 Hz) es el cambio

de frecuencia entre el estado inicial y el final y k es la constante cinética de primer
orden expresada en min-1 (k= 2·10-3 min-1). Este comportamiento indica que la
velocidad de adhesión es de primer orden, es decir, el proceso no está controlado por
la difusión sino por la velocidad de adsorción de los osteoblastos a la superficie

metálica.
Con el fin de establecer si existe una relación lineal entre el número de

osteoblastos añadidos y la variación de la frecuencia de oscilación, se realizaron
ensayos con diferente número de osteoblastos. Aunque algunos autores han concluido
que existe una relación lineal entre el número de osteoblastos adheridos a la superficie
metálica y la variación en frecuencia [80-82]. Sin embargo, no se ha podido establecer esa
relación debido al gran número de variables a tener en cuenta en cultivos celulares. Así
por ejemplo, es extremadamente difícil partir de cultivos que tengan exactamente el
mismo grado de diferenciación; es decir, células que estén programando su muerte
(apoptosis) y no se adhieran a la superficie y otras en estado adecuado para adherirse y
sobrevivir, en los mismos porcentajes en cada etapa. Teniendo esto en cuenta, la
actividad celular en cada “ensayo” será distinta, lo que provoca que la variabilidad en la
medida sea muy alta y la reproducibilidad baja. Todo ello, provocó que los resultados
obtenidos no fueran concluyentes.
4.2.4 Estudio electroquímico del Ti-Q sumergido en cultivos de osteoblastos
Saos-2
El estudio de las distintas etapas de adhesión y proliferación celular mediante

técnicas electroquímicas han ayudado a comprender cómo se modifican las
propiedades electroquímicas de la superficie metálica como consecuencia de la
interacción de un organismo vivo, que provoca cambios tanto en la composición del
medio de cultivo (consumiendo substancias presentes y agregando otras nuevas)
como en la superficie metálica.
4.2.4.1 Evolución del potencial de corrosión con el tiempo de inmersión
En la Figura 39 se puede observar la evolución con el tiempo del Ecorr del Ti-Q
sumergido en medio de cultivo DMEMc en ausencia y presencia de osteoblastos. El
Ecorr de la muestra sumergida en DMEMc disminuye desde -0,144 V vs Pt hasta
alcanzar un potencial estable a -0,336 V vs Pt; es decir, el Ti que recubre el cristal de
cuarzo, tiene tendencia a activarse con el tiempo de inmersión.
Figura 39. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-Q sumergido, durante 7
días, en la disolución de (■) DMEMc y (●) presencia de osteoblastos Saos-2.
Al añadir los osteoblastos al medio de cultivo, el Ecorr se sitúa por debajo del
valor de referencia (DMEMc) durante los tres primeros días y permanece constante
hasta el final de los ensayos. Los valores obtenidos para el E corr (desde -0,214 a -0,235
[68]
V) son consistentes con los datos bibliográficos . Dicha conducta sugiere que la
cantidad de proteínas adsorbidas directamente sobre la superficie de Ti-Q disminuye
debido a la reordenación de la estructura proteínica durante la adhesión celular: los
osteoblastos reordenan las proteínas adsorbidas a su alrededor para adherirse al Ti,
posiblemente disminuyendo las proteínas presentes previamente sobre la superficie.
Llama la atención en esta gráfica la gran variabilidad en los potenciales de corrosión
obtenidos en los distintos ensayos realizados. Esto puede ser debido como
comentamos anteriormente, a muchos factores inherentes al trabajo con cultivos

celulares, tales como distintos pases de osteoblastos o diferentes porcentajes de
estos en distintas etapas de diferenciación [68]. Además, no hay que olvidar que el Ecorr
se mide con respecto a un pseudoreferencia de Pt.
Con el objetivo de evaluar electroquímicamente cómo influye la presencia de

los osteoblastos en la superficie de Ti-Q, se registraron las curvas de polarización para
el Ti-Q, después de 7 días de inmersión, en DMEMc en ausencia y presencia de
osteoblastos (Figura 40).
Figura 40. Curvas de polarización del Ti-Q sumergido en (■) DMEMc y (●) presencia de osteoblastos
Saos-2 a los 7 días de incubación.
Las curvas de polarización catódicas, tanto en ausencia como en presencia de

Saos-2, muestran dos intervalos de potencial. A bajo sobrepotencial (entre 0,000 V y -
0,300 V) tiene lugar la transferencia de carga atribuida a la reducción del oxígeno

disuelto en el medio. A altos sobrepotenciales respecto al Ecorr (entre -0,300 V y -0,500
V), tendrían lugar simultáneamente la reducción de oxígeno y el desarrollo de
hidrógeno, este último poco probable, como ya se ha mencionado anteriormente,
tanto por el pH de la disolución (pH =7,4) como por la fortaleza del enlace Ti-H. La
densidad de corriente catódica para el DMEMc, es inferior a la obtenida en presencia
de osteoblastos. Como comentamos anteriormente, los osteoblastos tienen un
metabolismo muy activo y además, para adsorberse a la superficie segregan matriz
extracelular, (compuesta fundamentalmente por proteínas de adhesión) que
desplazan a las proteínas previamente adsorbidas sobre la superficie. Esta actividad
celular promueve que el sistema sea muy dinámico, permitiendo la llegada de oxígeno
a la superficie con mayor facilidad que en el caso del DMEMc en susencia de Saos-2.
Por otro lado, la pendiente de Tafel catódica en DMEMc, es de 0,240 V. Este

valor es más alto que los 0,120 V obtenidos para la reducción del oxígeno sobre la
[132]
superficie de Ti en medio fisiológico pero es similar al valor obtenido para la BSA
adsorbida en Ti-Q (Tabla 11) [133].
Con respecto a la rama anódica (Figura 40), el valor de la pendiente de Tafel

obtenida para el DMEMc después de 7 días de inmersión es de 0,772 V (Tabla 15).
Este valor tan alto de la pendiente anódica es similar al obtenido para el Ti-Q
sumergido en la disolución de FBS (Tabla 11), lo que confirma la presencia de una
capa pasiva protectora de óxido de Ti cubierta por una capa de proteínas adsorbidas
sobre la superficie. La densidad de corriente anódica es constante al variar el
potencial aplicado, lo que nos indica que dicha reacción está limitada por la pasividad
de la capa de óxido (cubierta por moléculas orgánicas). El crecimiento de la capa de
óxido en la interfase DMEMc/Ti-Q no está limitado por la difusión a través de la capa
adsorbida de biomoléculas sino por la difusión a través de la capa de óxido nativa que
protege al biomaterial.
Tabla 15. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-Q sumergido en DMEMc en
presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.
Ecorr (V) c (V) a (V)

Ti-Q / DMEMc -0,336 0,240 0,772
Ti-Q / Saos-2 -0,223 0,314 0,244
En presencia de osteoblastos Saos-2, la rama anódica muestra densidades de

corriente más altas y valores para la pendiente de Tafel más bajos que para las
muestras de Ti-Q/DMEMc (Tabla 15). Este resultado confirma la alta reactividad del
metabolismo celular, produciendo superóxidos, óxidos nitrosos y protones que
[59]
pueden atacar a la superficie metálica . La presencia de estos compuestos no solo
no favorece la formación de la capa de óxido sobre la superficie del titanio, sino que
parece dañarla, puesto que la densidad de corriente aumenta cuando el valor del
potencial aplicado es más anódico. Por tanto, la presencia de la capa pasiva deja de
controlar el proceso, alcanzándose un control mixto en presencia de osteoblastos.
En las Figura 41 a y b se muestra la evolución del módulo de impedancia y del

ángulo de fase frente a la frecuencia, para el Ti-Q sumergido en la disolución de
DMEMc durante 1, 3, 5 y 7 días de ensayo. Estas medidas de impedancia muestran
una respuesta similar independientemente del tiempo de ensayo: el sistema muestra
una única constante de tiempo desde el primer día. En la región de altas frecuencias
(105 Hz - 100 Hz), se observa la resistencia del electrolito, Re; a frecuencias medias y
bajas (100 – 10-3 Hz), la pendiente del módulo de impedancia es -0,87, pudiendo ser
atribuida a la interfase formada por la disolución de DMEMc (electrolito) y las
proteínas procedentes del DMEMc adsorbidas sobre el electrodo de Ti-Q (interfase
electrolito/proteínas-TiO2).
Figura 41. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a) módulo de
impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia de Saos-2 c) módulo de
son los ajustes con los circuitos eléctricos equivalentes e), f) y g).
La presencia de los osteoblastos Saos-2 en el medio de cultivo modifica la

interfase electrolito/proteínas-TiO2. Las Figura 41 c y d muestran el módulo de
impedancia y el ángulo de fase frente a la frecuencia respectivamente, de las
muestras de Ti-Q sumergidas en un cultivo de osteoblastos Saos-2 durante 1, 3, 5 y 7
días de ensayo. Desde el primer día de incubación hasta el último, la interfase
electrolito/Saos-2-proteínas-TiO2 cambia significativamente, alterando la respuesta
de los valores de impedancia frente a la frecuencia con respecto a los obtenidos en
ausencia de osteoblastos.
El sistema electroquímico se puede ajustar a dos constantes de tiempo, con un

desplazamiento a valores de frecuencia más altos del max con el tiempo de ensayo
(Figura 41d). A altas frecuencias, el módulo de impedancia del diagrama de Bode
muestra la resistencia del electrolito (Re) que es más alta que para el DMEMc en
ausencia de osteoblastos (Tabla 16). A frecuencias intermedias, se obtiene una
pendiente de -0,85 (Tabla 16), que puede ser atribuida a un condensador en paralelo
con una resistencia asociado con la interfase formada entre el medio de cultivo y la
capa de adsorción biomolecular (integrada por los Saos-2 y su matriz extracelular
adsorbidas sobre la película pasiva de la superficie de Ti-Q, interfase electrolito/Saos-
2-proteínas-TiO2). A frecuencias bajas (10-2 Hz - 10-3 Hz), se observa un cambio en la
pendiente definiéndose claramente una resistencia (tramo horizontal) para el séptimo
día de ensayo. Este cambio, se puede observar claramente en el diagrama de Bode del
ángulo de fase (Figura 41 d), en el que se aprecia un mínimo a 10-3 Hz,
correspondiente a la respuesta de la interfase más interna electrolito/proteínas-TiO2.
Los resultados de los diagramas de impedancia, para el Ti-Q en DMEMc, se

ajustaron considerando el circuito eléctrico equivalente de la Figura 41 e, donde Re es
la resistencia del electrolito entre el electrodo de trabajo y el de referencia; CPE2 es
un elemento de fase constante que simula el comportamiento no lineal de un
condensador, correspondiente a la interfase formada por el medio de cultivo DMEMc
(electrolito) y las proteínas adsorbidas sobre el Ti-Q (electrolito/proteínas-TiO2); R2 es

la resistencia asociada con ella.
Para estudiar los cambios en los diagramas de impedancia para las muestras de
TiQ en presencia de osteoblastos, se consideraron los circuitos eléctricos equivalentes
de las Figura 41 f y g. Teniendo en cuenta las imágenes de SEM (Figura 37) que
muestran un recubrimiento parcial de la superficie de Ti por Saos-2 para los días 1, 3 y
5 de muestreo, los resultados experimentales de EIS se ajustaron al circuito de la
Figura 41 f. Considerando que el cultivo celular es prácticamente confluente al
séptimo día (Figura 37 d), el circuito eléctrico equivalente utilizado para el ajuste fue
el que se muestra en la Figura 41 g. Los componentes electrónicos de ambos circuitos
tienen su significado habitual, con una salvedad: R2 y CPE2 representan la resistencia
y la pseudocapacidad asociadas a la interfase externa DMEMc/Saos-2-proteínas-TiO2,
y R1 y CPE1 son la resistencia y la pseudocapacidad de la interfase DMEMc/TiO 2-Ti (1,
3 y 5 días, Figura 41 f) que simula la superficie sin recubrimiento celular, y para el
séptimo día simulan la interfase interna Saos-2-proteínas/TiO2-Ti (Figura 41 g).
La Tabla 16 muestra los resultados del ajuste de las medidas de impedancia

para las muestras sumergidas en DMEMc en ausencia y en presencia de Saos-2
durante 1, 3, 5 y 7 días. En ausencia de Saos-2, los valores de CPE2 aumentan
ligeramente con el tiempo, debido, probablemente, a que la capa de proteínas se
hace más compacta. En consecuencia, R2 disminuye a partir del tercer día de ensayo.
Estos resultados indican que en los primeros instantes de inmersión se produce la
adsorción rápida de las proteínas sobre la superficie del Ti-Q; pero a tiempos de
inmersión más largos, la presencia de aminoácidos y proteínas aumenta la velocidad
de corrosión de los biomateriales metálicos [134, 135]. Además, está documentdo que el
Ti se puede disolver selectivamente por la formación de complejos con las proteínas
[122, 136]
.
% % %
Super- t Re R2 CPE2 % Error R1 CPE1
Error Error Error
2
n2 n1 
2 -2 -(1-n) 2 -2 -(1-n)
ficie días  cm (R2) Fcm s (CPE2) cm (R1) Fcm s (CPE1)
6 -2
1 132,7 3,3·10 12,3 38,54 1,2 0,84 - - - - - 1,1·10
6 -2
3 139,6 3,6·10 17,9 48,18 1,2 0,83 - - - - - 1,2·10
Ti-Q/
DMEMc
6 -2
5 138,2 2,9·10 16,0 52,26 1,2 0,82 - - - - - 1,2·10
6 -2
7 114,6 2,1·10 12,3 53,28 1,2 0,83 - - - - - 1,1·10
6 6 -3
1 183,5 1,4·10 10,5 40,89 2,5 0,91 2,9·10 9,4 65,96 7,6 0,71 2,0·10
5 5 -3
3 194,3 3,3·10 12,3 44,89 4,5 0,90 6,1·10 11,5 136,64 4,0 0,71 1,7·10
días, en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.
Ti-Q/
Saos-2
5 5 -3
5 194,2 3,3·10 13,0 36,61 4,6 0,87 6,4·10 13,6 136,60 4,8 0,73 1,9·10
5 4 -3
7 180,9 1,2·10 14,8 52,43 1,2 0,98 1,2·10 21,4 203,21 6,7 0,78 2,4·10
Tabla 16. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 1, 3, 5 y 7
De acuerdo con los ajustes de los resultados de EIS (Tabla 16), la

pseudocapacidad (CPE2) de la capa de adsorción biomolecular integrada con Saos-2
aumenta con el tiempo de inmersión, sugiriendo que la cantidad de proteínas
adsorbidas directamente sobre la superficie del Ti-Q disminuye durante la adhesión
[59]
celular . De igual modo, los valores de R2 disminuyen a medida que la
concentración de las proteínas adsorbidas disminuye. La resistencia del óxido (R1)
disminuye y CPE1 aumenta considerablemente desde el primer día de incubación con
Saos-2. Estos resultados indican que los componentes que generan los osteoblastos,
como óxido nitroso y superóxidos, pueden disolver, por medio de reacciones
[137]
químicas, el óxido de titanio acelerando la corrosión de la superficie del Ti-Q ,
como ya habíamos observado a través de las curvas de polarización.
Transformadas de Kramers-Kronig (K-K)
Una vez analizados y ajustados los diagramas de impedancia obtenidos para el

Ti-Q sumergido en DMEMc en ausencia y en presencia de osteoblastos Saos-2, se
[100]
procedió a calcular las transformadas de Kramers-Kronig , para así evaluar la
fiabilidad de las medidas de impedancia.
En la Figura 42, se muestran los diagramas que representan los resultados

experimentales y los resultados calculados a partir de las transformadas de K-K para el
Ti-Q sumergido en DMEMc durante 1, 3, 5 y 7 días, en ausencia y presencia de Saos-2.
Como se puede observar, la consistencia de los resultados experimentales es bastante
buena. No obstante, se han calculado los errores medios de los resultados de las
transformadas de K-K con respecto a los resultados originales utilizando la ecuación
(9).
El error medio obtenido para cada una de las transformadas de K-K no supera
el 0,7% (Tabla 26); por tanto los resultados experimentales satisfacen las
transformadas de K-K.
Figura 42. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días, en: a)
DMEMc y b) DMEMc con Saos-2, y los resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-
Kronig (K-K)(+).
Carece de interés incluir los resultados de las transformadas de K-K para todos
los días de medida. Éstos resultaron también con buena concordancia.
Tabla 17. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones de
Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el DMEMc en
presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo.
Error medio (%)
Medios Componente Real (Z´) Componente Imaginaria (Z”)
DMEMc 0,517 0,207
Saos-2 0,545 0,614
4.2.5 Discusión
La adhesión celular es un proceso dinámico que comienza con el contacto

inicial de la célula con las proteínas adsorbidas sobre la superficie. Este hecho implica
la acción conjunta de varias moléculas, que inducen a la posterior respuesta celular en
términos de migración, proliferación y diferenciación, así como el remodelado sobre
la superficie de las proteínas adsorbidas o de la matriz extracelular. Es evidente que
este complejo mecanismo de adhesión y proliferación celular modifica continuamente
tanto la interfase osteoblastos/TiO2, como la superficie del material metálico.
En los estudios de QCM, teniendo en cuenta que las viscosidades del DMEMc y
del DMEMc con Saos-2 son muy parecidas, el cambio en la frecuencia se debe
fundamentalmente a la adsorción de los osteoblastos sobre el cristal de Ti-Q. Es
destacable la gran sensibilidad de la microbalanza de cristal de cuarzo, ya que es capaz
de detectar ganancias de masa en los momentos iniciales de la adhesión celular a
través de la adhesión de “puntos localizados” de las extensiones o filopodios que los
osteoblastos utilizan para adherirse a las superficies y cuyo mecanismo progresa hasta
el posterior recubrimiento de la superficie metálica.
El mecanismo de adhesión celular de los osteoblastos es un proceso que sigue

una cinética de primer orden, es decir, está controlado por la velocidad de adsorción de
los osteoblastos. Redepenning y col. [77], utilizando la ecuación de Kanazawa [78, 79] han
obtenido un comportamiento similar para una monocapa de osteoblastos. Los valores
obtenidos de la constante de velocidad reflejan valores correspondientes a una cinética
lenta, acorde con la cinética de adhesión de otraslíneas celulares como pueden ser los
fibroblastos.
Transcurridas 24 horas de ensayo, el proceso de tripsinización para despegar los

osteoblastos de la superficie de Ti no permitió la recuperación de los valores de
frecuencia característicos del cultivo DMEMc, lo cual se debe a la generación de la
matriz extracelular por parte de los osteoblastos, que queda adsorbida sobre la
superficie de Ti.
Galli Marxer y col. [81] han detectado un aumento en los valores de la frecuencia
para tiempos de incubación superiores a las 24 horas que han asociado a un cambio en
las propiedades viscoelásticas de los osteoblastos, es decir, a un aumento de la rigidez
propia de un estado más avanzado del proceso de adhesión celular.
Por otra parte, las propiedades electroquímicas de la superficie de Ti-Q se ven

alteradas como consecuencia de su interacción con el medio de cultivo celular y con las
células osteoblásticas. La interacción electroquímica de la superficie de Ti-Q con las
células osteoblásticas y el medio de cultivo DMEMc dio lugar a valores de potencial de
corrosión negativos, que incluso tienden a evolucionar hacia valores más negativos a lo
largo del tiempo de ensayo, lo que indica que hay una tendencia a que el material sea
más activo, es decir, mayor tendencia hacia la corrosión. Esta tendencia se puede
explicar teniendo en cuenta la asociación de dos procesos que ocurren
simultáneamente en el medio de cultivo celular. Por una parte, considerando
únicamente el DMEMc, el medio de cultivo celular contiene iones inorgánicos que
disminuyen el potencial, como es el caso de los fosfatos y el calcio, y proteínas como la
albúmina que compiten por la adsorción sobre la superficie metálica. Además no hay
que olvidar que ciertas proteínas pueden formar complejos que faciliten la disolución
del Ti [68]. Y por otra parte, considerando la presencia de las células osteoblásticas, hay
que tener en cuenta que en el proceso de adhesión sobre la superficie metálica, los
osteoblastos sustituyen las proteínas adsorbidas del medio celular por proteínas
específicas de adhesión [59], generando matriz extracelular que actúa como un colchón
idóneo para su anclaje en la superficie de Ti-Q. Este metabolismo tan activo y dinámico,
no sólo genera estas proteínas sino que también generan productos de desecho muy
[137]
reactivos, como superóxidos, óxido nitroso, protones, etc . Todos ellos actúan
activamente sobre la superficie de óxido de Ti, atacándola y disminuyendo la
protección del material metálico. Este proceso se ve reflejado en la disminución de los
valores de la pendiente de Tafel (Tabla 15) tanto catódica como anódica respecto al
DMEMc, así como en los mayores valores de la densidad de corriente anódica y
catódica en las curvas de polarización (Figura 40). En este último caso, parece que la
adhesión celular y los procesos implicados facilitan la llegada del oxígeno a la superficie
del Ti-Q obteniéndose densidades de corriente un orden de magnitud mayor que para
el DMEMc (Figura 40).
Los valores de la capacidad para la interfase electrolito/proteínas-TiO2, para las

muestras de Ti-Q en DMEMc, aumentan ligeramente a lo largo de los 7 días de ensayo
(Tabla 16). Consecuentemente, la resistencia asociada a dicha interfase disminuye a
partir del tercer día. Como ya se ha mencionado anteriormente, la adsorción de las
proteínas es un proceso rápido que aumentaría la resistencia para tiempos cortos de
inmersión. Sin embargo, la presencia de proteínas facilitaría la formación de
complejos aumentando la velocidad de corrosión para tiempos más largos.
La misma tendencia se observa para la interfase externa e interna del sistema

DMEMc/Saos-2/TiO2-Ti durante los 7 días de inmersión (Tabla 16). Por una parte, en
la interfase externa la cantidad de proteínas adsorbidas sobre la superficie de Ti-Q
disminuye debido al reordenamiento de proteínas que llevan a cabo los osteoblastos
[59]
. En consecuencia, disminuye la resistencia y aumenta la capacidad. Los
compuestos que generan los osteoblastos pueden modificar la capa pasiva de TiO 2
acelerando su disolución y por tanto, adelgazando el espesor del óxido y
disminuyendo su capacidad protectora, como muestran las curvas de polarización. Por
otro lado, la pendiente de Tafel anódica es menor que para el Ti-Q en DMEMc, lo que
indica que la actividad metabólica de los osteoblastos promueve fenómenos de
corrosión en mayor medida que el DMEMc.
4.3 Estudio de la interfase Ti-TT/componentes del DMEMc
4.3.1 Caracterización de las superficies de Ti
La caracterización de la morfología superficial de las muestras de Ti antes (Tim)

y después del tratamiento térmico (Ti-TT) fue examinada por microscopía electrónica
de barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM), y la composición superficial
por dispersión de energía de rayos X (EDX) y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X
(XPS).
4.3.1.1 Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microanálisis por

dispersión de energía de rayos X (EDX)
La Figura 43 a muestra una imagen de SEM de la superficie de titanio después

del tratamiento térmico a 277°C durante 5 h. (Ti-TT).
Figura 43. (a) Imagen de SEM del titanio tratado térmicamente (Ti-TT) y (b) análisis por EDX.
La superficie metálica oxidada presenta una topografía homogénea en la que

todavía se revelan surcos paralelos del proceso de pulido, sobre los que se aprecian
precipitados blancos diseminados por toda la superficie de la muestra. El análisis por
140 4.3 Estudio de la interfase Ti-TT/componentes del DMEMc
EDX de estos precipitados refleja dos picos asociados a titanio y oxígeno (Figura 43 b),
lo que indica que se trata de óxidos de titanio.
La Figura 44 muestra, a modo de ejemplo, una imagen de AFM de 10 m x 10

m de la topografía de la superficie de titanio antes del tratamiento térmico (Ti-m).
Figura 44. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti antes del tratamiento térmico (Ti-m) y
perfil de Ti-m de uno de los surcos de la superficie.
La superficie presenta crestas y valles de aproximadamente 350 nm de alto y

unas 2 m de ancho como consecuencia del pulido de la superficie. A lo largo del
surco y en sus alrededores, la rugosidad superficial (RMS) varía entre 12,38 y 91,68
nm (Tabla 18).
La Figura 45 muestra, a modo de ejemplo, una imagen de AFM de 10 m x 10

m de la superficie de Ti después del tratamiento térmico (Ti-TT).
Figura 45. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti-TT después del tratamiento térmico y
perfil de Ti-TT de uno de los surcos de la superficie.
De nuevo, al igual que en la superficie de Ti-m, se observan crestas cuya altura

se ha reducido a aproximadamente 200 nm y valles que se mantienen con un ancho
de 2 m, como observamos en el perfil de uno de los surcos de la superficie (Figura 45
b). Comparando la topografía de las muestras de Ti-m y Ti-TT (Figura 44 y 45), se
puede concluir que la superficie de Ti después del tratamiento térmico presenta una
topografía aparentemente más rugosa, con pequeñas protuberancias, que no se
observan en el Ti-m. Sin embargo, al contrario de lo que cabría esperar, la rugosidad
(RMS) arroja valores similares a la superficie de titanio sin tratar (Tabla 18).
Tabla 18. Resultados de rugosidad (RMS) del titanio antes (Tim) y después del tratamiento térmico
(Ti-TT).
Tim Ti-TT
28,42 56,06
51,09 92,40
78,50 66,63
RMS (nm)
42,69 29,99
32,92 70,77
12,38 19,43
91,68 52,52
46,44 59,07
4.3.1.3 Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)
Con propósitos comparativos, se analizó la composición superficial de las

muestras de titanio antes (Ti-m) y después del tratamiento térmico (Ti-TT) mediante
espectroscopía electrónica de rayos X (XPS).
La composición química de las superficies de Ti-m y Ti-TT analizadas por XPS, se

muestra en la Tabla 19, donde se resumen las energías de ligadura de los picos y los %
atómicos correspondientes. Los espectros de XPS obtenidos para ambas muestras,
son similares en cuanto a composición, pero difieren en la proporción de las especies

presentes.
El pico de XPS correspondiente al Ti2p confirma que la composición química de

la película de óxido es TiO2 (Ti2p 458,6 eV) para el Ti-m y Ti-TT. Sin embargo, el
aumento en el % atómico de dicho pico para el Ti-TT nos indica que el tratamiento
térmico ha favorecido el crecimiento de TiO2.
Tabla 19. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s y del
Ti2p para las muestras de Ti-m y Ti-TT.
Energía de ligadura
Superficie Elemento Asignación % atómico
(eV)
C1s C-C, C-H 284,8 34,8
Ti-m TiO2 530,2 33,9

O1s
Ti-OH 531,6 16,1
Ti2p TiO2 458,6 15,3
C1s C-C, C-H 284,8 3,5
TiO2 529,9 58,2

Ti-TT O1s
Ti-OH 531,4 14,8
Ti2p TiO2 458,6 23,5
El espectro de alta resolución para el Ti-TT de O1s (Figura 46) muestra que la
banda del O1s puede deconvolucionarse en dos componentes. El primer pico se
asigna al enlace Ti-O en el TiO2 y el segundo al enlace del Ti-OH. Es interesante
observar que, como consecuencia del tratamiento térmico, el % atómico del pico
asociado al enlace TiO2 aumenta, y por consiguiente, aumenta el % atómico del pico
del Ti2p. Es decir, el tratamiento térmico favorece el crecimiento de la capa de TiO 2,
mientras el % atómico de los enlaces Ti-OH permanece prácticamente constante en la
superficie.
Figura 46. Espectros de alta resolución de XPS del O1s para el Ti-m y el Ti-TT.
4.3.1.4 Cálculo del espesor de óxido de titanio mediante espectroscopía de

impedancia electroquímica.
La capacidad de un condensador puede expresarse como:
(11)
donde A es el área de cada placa, d la distancia entre ellas, ε0 la permitividad en el

vacío (8,9·10-12 F m-1) y εY la constante dieléctrica relativa del medio existente entre
las placas, en este caso εY = 80 relativa al TiO2 [138]. A partir de esta ecuación, se puede
realizar una estimación del espesor del óxido formado sobre el titanio al tratarlo
térmicamente y compararlo con el valor del óxido nativo en una disolución de fosfato.
Para ello se ha calculado la capacidad a partir de medidas de impedancia a altas
frecuencias, aplicando el método de frecuencia fija.
(12)
Donde fi = 100 Hz y Z” es la componente imaginaria del valor de la impedancia Z a esa

frecuencia. El espesor del óxido obtenido para el Ti-m es de aproximadamente 2,2 nm
correspondiéndose con el óxido nativo, y de 12,0 nm para el Ti-TT. El tratamiento

térmico ha aumentado en aproximadamente 10 nm el espesor de la capa de TiO 2.
4.3.2 Caracterización del Ti-TT en los distintos componentes del DMEMc por
espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)
La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) se utilizó para obtener la

información necesaria a cerca de los elementos presentes sobre la superficie de Ti-TT,
después de siete días de tratamiento, en cada uno de los componentes del DMEMc.
Dicha información, será útil, posteriormente, para escoger el circuito eléctrico
equivalente más adecuado para simular los resultados experimentales obtenidos con
la espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS), en cada caso.
En la Figura 47 se muestran los espectros de alta resolución del C1s y del O1s
para el Ti-TT después de estar inmerso en una disolución de NaH2PO4 (P/Figura 47 a),
NaH2PO4 +CaCl2 (PCa/Figura 47 b) y NaH2PO4 +CaCl2 + glucosa (PCaG/Figura 47 c). En
la Tabla 20 se muestran las energías de ligadura así como los % atómicos
correspondientes a cada uno de los componentes del espectro de XPS.
En presencia de iones fosfato (disolución P) y de iones fosfato y calcio

(disolución PCa), el espectro del C1s puede ser resuelto en tres componentes que
corresponden al carbono en diferentes entornos. El primer pico, a más baja energía
de ligadura, es asignado a un carbono enlazado a C o H (C-C, C-H); el segundo, es
atribuido al carbono en el enlace sencillo C-O; el tercero, al carbono en C=O (-HC=O)
[112]
(Tabla 20). El espectro de alta resolución del O1s muestra la deconvolución de la
banda del O1s en dos componentes asignados a TiO2 y Ti-OH. También, se aprecia una
banda a 133,3 eV correspondiente al PO43- y además, en presencia de Ca2+, se observa
la incorporación de estos iones a la composición superficial como CaHPO 4 [139] a 347,9
eV.
Figura 47. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y O1s para el Ti-TT sumergido 7 días en las
disoluciones: (a) NaH2PO4, (b) NaH2PO4+ CaCl2 y (c) NaH2PO4+ CaCl2 + glucosa.
Tabla 20. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS, para el Ti-TT al
cabo de 7 días sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4+ CaCl2 (PCa), NaH2PO4+ CaCl2 +
glucosa (PCaG), NaH2PO4+ CaCl2 + BSA y FBS.
Superficie Elemento Asignación Energía de ligadura (eV) % atómico
C-C, C-H 284,8 24,5

C1s C=O 286,3 6,7
O-C=O 288,4 5,5
Ti-TT / P O1s
TiO2 529,9 29,6
Ti-OH 531,4 12,7
Ti2p TiO2 458,5 18,9

3-
P2p PO4 133,3 1,5
C-C, C-H 284,8 16,3

C1s C=O 286,5 6,1
O-C=O 288,5 4,3
TiO2 529,9 38,9

O1s
Ti-TT / PCa Ti-OH 531,4 15,0
Ti2p TiO2 458,6 16,8
3-
P2p PO4 133,5 1,3
Ca2p CaHPO4 347,9 1,4
C-C, C-H 284,8 26,0

C1s C=O 286,3 20,3
O-C=O 288,4 14,1
TiO2 530,1 17,6
O1s
Ti-TT / PCaG O-C=O 531,8 13,1
Ti2p TiO2 458,6 7,5

3-
P2p PO4 133,5 0,8
2+
Ca2p Ca 347,1 0,6
C-C, C-H 284,8 28,4

C1s C-NH-, C=O 286,0 19,9
CO-NH-, COOH 288,1 15,0
Ti-TT / BSA TiO2 529,9 5,1

O1s
CO-NH-, COOH 531,6 8,6
Ti2p TiO2 458,6 5,2
N1s -O=C-NH-, –NH2 399,9 17,8
C-C, C-H 284,8 26,2

C1s C-NH-, C=O 286,0 18,6
CO-NH-, COOH 288,1 12,9
TiO2 530,1 8,3
O1s
C=O 531,9 15,5
Ti-TT / FBS Ti2p TiO2 458,6 3,4

3-
P2p PO4 133,6 0,3
2+
Ca2p Ca 347,7 0,2
N1s -O=C-NH-, –NH2 399,9 14,6

Cuando se añade glucosa a la disolución de PCa se observan dos diferencias

notables en los espectros del C1s y del O1s. En el caso del C1s, aunque las energías de
ligadura asignadas son las mismas, la contribución de los picos C=O y O-C=O ha
incrementado considerablemente. En el espectro de alta resolución del O1s las
energías de ligadura que se han utilizado para resolver el espectro se asignaron a TiO 2
y O-C=O (Tabla 20), confirmando la presencia de glucosa adsorbida sobre la superficie
de Ti-TT, aunque sin llegar a alcanzar un recubrimiento total puesto que está presente
el TiO2 representando la superficie libre se sigue detectando Ti en los espectros de
XPS.
El % atómico de la componente Ti2p asociada a la banda del TiO2 es

prácticamente la misma para las muestras que han estado sumergidas en las
disoluciones de iones fosfato y de iones fosfato y calcio; sin embargo, disminuye a
más de la mitad en las muestras que han estado sumergidas en la disolución de
glucosa (PCaG). Asimismo, se observa un % atómico similar del pico del O1s para el
enlace Ti-OH en las disoluciones de iones fosfato y de iones fosfato y calcio, aunque
esta contribución ha desaparecido cuando la disolución contiene glucosa. La
adsorción de la glucosa sobre la superficie de las muestras de Ti-TT queda reflejada en
la mayor contribución de los picos asociados a los enlaces C=O y O-C=O, presentes en
la molécula de glucosa. El hecho más reseñable es la presencia de iones PO43- y Ca2+
después de la inmersión del Ti-TT en la disolución que contiene glucosa, aunque el
porcentaje atómico del P2p y Ca2p se ha reducido a la mitad. Hay que tener en cuenta
que la glucosa adsorbida podría impedir la detección de dichos iones así como del
TiO2 y Ti-OH, como muestra la disminución del % atómico obtenido, llegando en algún
caso a desaparecer (Ti-OH). Otra posibilidad es que en presencia de glucosa disminuya
la adsorción tanto del PO43- como del Ca2+. Sin embargo, el % atómico determinado
para el P2p y el Ca2p representaría la adsorción de PO43- y Ca2+ sobre la superficie de
TiO2 libre, debido a que la adsorción de la glucosa sobre el Ti-TT es un proceso más
rápido que la adsorción iónica y además solo se alcanza un recubrimiento superficial

parcial.
Figura 48. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y del O1s de las muestras de Ti-TT sumergido,
durante 7 días, en (a) BSA y (b) FBS.
En la Figura 48 se muestran los espectros de alta resolución del C1s y del O1s
para el Ti-TT sumergido durante 7 días, en las disoluciones de BSA y FBS. En principio,
el espectro del C1s parecería similar al obtenido en presencia de glucosa; sin
embargo, la deconvolución es ligeramente diferente, mostrando las bandas
características de la estructura de la proteína (Tabla 20). El espectro del C1s se puede
descomponer en tres picos: 284,8 eV para los enlaces C-C, C=C y C-H; 286,0 eV para el
enlace C=O y para el grupo amino (C-NH-); y el pico que aparece a 288,1 eV que se
asigna a los enlaces peptídicos (CO-NH-) y grupos ácidos (COOH). Estas energías de
ligadura corresponden a los diferentes grupos químicos presentes en la molécula de la
BSA. El espectro del O1s confirma también la presencia de la albúmina sobre el Ti-TT.
En la Figura 48 se muestra la contribución de dos componentes, la correspondiente a
la superficie de titanio oxidada (TiO2/529,9 eV) y la de los grupos característicos de la
BSA. Al igual que el C1s, la señal del N1s proviene de las proteínas adsorbidas. El pico
del N1s es simétrico y centrado a 399,9 eV; su principal contribución corresponde al
enlace peptídico (–O=C-NH-) y al grupo –NH2, como se espera para los grupos amida y
amina de la BSA. Es importante destacar la ausencia de fosfato y calcio en presencia
de BSA, contrariamente a lo que sucede cuando la superficie de Ti-TT es tratada con
FBS. Esto se explica por la gran variedad de compuestos del FBS, frente a una única
proteína presente en la disolución de BSA.
Tabla 21. Porcentaje atómico de los elementos que aparecen en XPS sobre las superficies de Ti-TT,
después de 7 días de inmersión en cada uno de los componentes del DMEMc.
Muestra Ti (at%) O (at%) C (at%) P (at%) Ca (at%) N (at%)
Ti-TT 23,5 73,0 3,5 - - -
Ti-TT/P 18,9 42,7 36,9 1,5 - -
Ti-TT/PCa 16,8 53,8 26,7 1,3 1,4 -
Ti-TT/PCaG 7,5 30,7 60,4 0,8 0,6 -
Ti-TT/BSA 5,2 13,7 63,3 - - 17,8
Ti-TT/FBS 3,4 23,8 57,7 0,3 0,2 14,6
Por otro lado, si se centra la atención en el porcentaje atómico (Tabla 21) de

cada elemento, se puede observar que a medida que el medio en el que están
sumergidas las muestras de Ti-TT es más complejo, el % Ti va disminuyendo. Esto es
debido principalmente a la adsorción de los diferentes iones, moléculas y
biomoléculas a la superficie del Ti-TT. Hay que resaltar también que en la muestra que
ha estado sumergida en la disolución de iones fosfato y calcio (PCa), la relación Ca/P
es de 0,9; superior para la obtenida para el Ti-Q (0,48). Estos valores son más bajos
que el que se considera estándar para la formación de apatita (1,67).
En presencia de albúmina no se observa ninguno de estos dos elementos (P2p

o Ca2p), lo que induce a pensar que la adsorción de esta impide que se detecten
dichos iones, aunque hayan sido incorporados a la capa de óxido. En este caso, el
porcentaje atómico del Ti ha disminuido respecto a las disoluciones anteriores,
alcanzando un valor mínimo en presencia de FBS. En este caso se puede apreciar un
0,3% de fosforo y un 0,2% de calcio. Estos resultados indican que a pesar de la
presencia de la albúmina en la disolución de FBS, existen otros iones y/o moléculas
que compiten con la BSA por adsorberse sobre la superficie de Ti-TT. Por lo tanto, la
capa de biomoléculas adsorbida es más homogénea y estructurada para las muestras
de Ti-TT inmersas en BSA que en FBS. Pudiéndose detectar en este último caso el
fósforo y el calcio. Por otra parte, los porcentajes atómicos del C y el N alcanzan su
valor máximo cuando se sumerge el Ti-TT en albúmina, debido al contenido en C y N
de dicha proteína.
4.3.3. Estudio electroquímico del Ti-TT sumergido en los distintos

componentes del DMEMc
4.3.3.1 Evolución del potencial de corrosión (E corr ) con el tiempo de inmersión
El primer parámetro electroquímico estudiado, fue la evolución del potencial

de corrosión (Ecorr) en función del tiempo de ensayo (1-7 días), del Ti-TT sumergido en
cada una de las siguientes disoluciones: NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4
+ CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS (Figura 49).
En la Figura 49 se observan dos tendencias diferentes dependiendo de la

disolución utilizada. Por una parte, se observa un desplazamiento del Ecorr desde
valores catódicos hacia valores anódicos, a medida que aumenta el tiempo de
inmersión del Ti-TT, en la disolución muestreada. Dicha conducta es seguida por el Ti-
TT sumergido en las disoluciones de iones fosfato (P), iones fosfato y calcio (PCa) y
glucosa (PCaG). Durante los primeros días, el potencial de corrosión aumenta
rápidamente hasta alcanzar un valor prácticamente constante, a partir del sexto día.
En resumen, destacamos que, como consecuencia de la inmersión de las muestras de
Ti-TT en las disoluciones con fosfato, fosfato y calcio y glucosa, la superficie sufre un
ennoblecimiento, debido fundamentalmente a su interacción con los iones fosfato y
calcio.
Figura 49. Evolución del Ecorr con el tiempo para el Ti-TT en (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa),
(▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦) suero fetal bovino (FBS).
La segunda tendencia, se observa para el Ti-TT inmerso en BSA y FBS. La

evolución del potencial de corrosión presenta un comportamiento diferente cuando
en el medio están presentes las proteínas, como por ejemplo la albúmina, BSA. En
este caso, el Ecorr se sitúa en valores por debajo de los potenciales obtenidos para las
muestras de Ti-TT sumergidas en PCa y PCaG, y permanece constante en -0,08 V vs
Ag/AgCl desde el primer día hasta los 7 días de inmersión. Este comportamiento
indica que la superficie del Ti-TT alcanza un estado estacionario el primer día de
ensayo, en el cual permanece hasta el final del mismo; es decir, la interacción de las
proteínas con la superficie de Ti-TT se produce en los primeros momentos de la
inmersión y no se altera con el tiempo de ensayo. La disolución de suero fetal bovino
(denominada como FBS) contiene albúmina en las mismas proporciones que la
disolución de BSA, además de otros muchos nutrientes necesarios para la vida celular,
entre los que se encuentran sales inorgánicas y vitaminas. No obstante, la respuesta
del potencial de corrosión es idéntica a la encontrada con la disolución de albúmina,
por lo que se puede concluir que la lectura del potencial de corrosión o la
espontaneidad de la reacción de corrosión, parece estar controlada por la presencia
de la albúmina.
En la Figura 50, se muestran las curvas de polarización (± 0,5 V respecto al Ecorr)

para el Ti-TT, después de siete días de inmersión en cada una de las disoluciones en
estudio: P, PCa y PCaG, BSA y FBS.
Tabla 22. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT en cada una de las
Disoluciones Ecorr (V) c (V) a (V)

P 0,038 0,121 0,466
PCa 0,079 0,187 0,421
PCaG 0,104 0,160 0,360
BSA -0,082 0,228 0,454
FBS -0,081 0,213 0,416
Figura 50. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) (■) NaH2PO4 (P), (●)
NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), y (b) (■) NaH2PO4 (P), (●) albúmina
(BSA) y (▲) suero fetal bovino (FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s.
El primer hecho reseñable es el desplazamiento anódico del E corr, que se

produce al sumergir 7 días el Ti-TT en PCa y PCaG, con respecto a la disolución de
fosfato (P); este hecho confirma el efecto protector generado por los iones presentes
en ambas disoluciones (Tabla 22, Figura 49 a los 7 días). Por el contrario, en presencia
de BSA y FBS, el Ecorr adquiere valores más catódicos que en ausencia de proteínas,
poniendo de manifiesto el efecto corrosivo de las mismas, posiblemente debido a la
capacidad para acomplejar los iones Ti4+.
El segundo hecho reseñable es que, independientemente de que el Ti-TT esté

sumergido en P, PCa, PCaG, BSA o FBS, la rama anódica es prácticamente la misma
para todas las disoluciones, los valores de pendientes de Tafel anódica, a (Tabla 22),
son muy similares y siempre superiores a los valores de las pendientes catódicas, lo
que nos indica que el proceso está controlado anódicamente. Se observa que las
densidades de corriente anódicas en presencia de fosfato y calcio (PCa) y glucosa
(PCaG) son ligeramente menores que para el Ti-TT en disolución de fosfato,
confirmando el efecto bloqueante de los iones calcio y de la glucosa. Por el contrario,
la densidad de corriente anódica para el Ti-TT en presencia de BSA y FBS es mayor que
en la disolución de fosfato, confirmando el efecto acomplejante de la albúmina, a
pesar de la capa de óxido (TiO2) que protege la superficie del biomaterial (≈ 10 nm).
En cuanto a la rama catódica, se pueden diferenciar dos zonas en las curvas de

polarización: una región de sobrepotencial comprendida entre 0 V y -0,200 V y otra a
sobrepotenciales más catódicos entre -0,200 V y -0,500 V. Teniendo en cuenta el
diagrama de Pourbaix para el Ti (Anexo 7.3) a pH de 7,4 [140], en la primera zona tiene
[119]
lugar la reducción del oxígeno disuelto en la disolución , mientras que en la
segunda se da la reducción del oxígeno, así como la de los protones, aunque la
contribución de esta última reacción no sea muy significativa. La pendiente de Tafel
catódica para las muestras de Ti-TT sumergidas en la disolución de fosfatos es de
0,121 V, correspondiente a la reducción del oxígeno:
O2 + 4H+ + 4e- → 2H2O
La adición de CaCl2 a la disolución de fosfato (disolución PCa) da lugar a una

significativa disminución de la corriente catódica (Figura 50 a), así como a un aumento
en el valor de la pendiente de Tafel catódica, c (0,187 V vs 0,121 V); esto refleja la
dificultad que tiene el oxígeno para reducirse debido, probablemente, a la presencia
de iones fosfato e iones calcio adsorbidos sobre la superficie.
Cuando evaluamos la respuesta a la polarización catódica del Ti-TT en una

disolución que contiene glucosa (disolución PCaG), tanto la pendiente de Tafel
catódica como la densidad de corriente alcanzan valores intermedios entre las
disoluciones de fosfato (P) y fosfato y calcio (PCa) (Tabla 22). Esto indica que en
presencia de glucosa la reacción de reducción de oxígeno no está tan impedida como
en el caso de la disolución de fosfato y calcio (PCa); de hecho, el porcentaje atómico
de ambos iones ha disminuido para el Ti-TT en presencia de glucosa, como indican los
resultados obtenidos por XPS.
En el caso de la disolución de BSA, la presencia de los iones Ca 2+ favorece su

adsorción, así como la de los iones fosfato sobre la superficie del Ti-TT, la cual está
cargada negativamente debido a la presencia de los grupos hidroxilo. Por otro lado,
en presencia de BSA y FBS (Figura 50 b) los valores de las pendientes catódicas son
más altas que en los casos tratados anteriormente, indicando que los procesos
catódicos están menos favorecidos en presencia de proteínas. Sin embargo, los
valores de las pendientes de Tafel catódicas para las disoluciones de BSA y FBS son
muy similares entre sí: queda claro que la albúmina controla el mecanismo de
reacción sobre el resto de los componentes del suero fetal bovino. No obstante, la
densidad de corriente catódica es mayor para la disolución que contiene únicamente
albúmina, BSA, que para el suero fetal bovino, FBS. Esto puede ser debido a que los
compuestos presentes en la disolución de FBS bloquean con mayor eficiencia los sitios
de reducción de O2 impidiendo que se de dicha reacción.
Figura 51. Densidad de corriente catódica calculada a -0,2 V para el Ti-TT sumergido en cada una
de las disoluciones de los componentes del DMEMc.
Otra manera de estudiar el efecto de cada uno de los componentes del DMEMc
sobre el Ti-TT, fue medir la densidad de corriente catódica a un sobrepotencial
constante de -0,2 V respecto al Ecorr (Figura 51). Se aprecia cómo a medida que
aumenta la complejidad del medio la densidad de corriente catódica va
disminuyendo, debido, principalmente, a la interacción con la superficie de los
distintos compuestos que bloquean de una u otra manera la difusión de oxígeno hacia
la superficie de titanio, impidiendo la reducción del mismo. Por otra parte, el valor de
densidad de corriente catódica para la disolución de FBS es el más bajo de todos,
indicando que los componentes de dicha disolución bloquean más eficientemente los
sitios en los que se produce la reducción del oxígeno.
En la Figura 52 se muestran los diagramas de Bode del módulo de impedancia y

del ángulo de fase frente a la frecuencia, para las muestras de Ti-TT sumergidas,
durante 7 días, en la disolución de fosfato (P) (Figura 52 a y b) y en la disolución de

fosfato y calcio (PCa) (Figura 52 c y d).
Figura 52. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 (a)
módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c)
módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados
experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).
El módulo de impedancia frente a la frecuencia (Figura 52 a y c) muestra un

valor constante a altas frecuencias. El valor de la impedancia en esta zona, que
coincide con un valor del ángulo de fase igual a cero (Figura 52 b), corresponde al
valor de la resistencia del electrolito (Re) en cada disolución. A medida que va

disminuyendo la frecuencia, desde 102 a 10–2 Hz (Figura 52 a y c), se obtiene una recta
de pendiente –0,9 con valores del ángulo de fase de –90˚ en el mismo intervalo de
frecuencias (Figura 52 b y d). Los valores de ángulo cercanos a –90˚ indican, que la
interfase electrolito/P-TiO2 tiene un comportamiento capacitivo debido, a la capa
oxidada protectora y resistente generada a 277˚C.
La pendiente de –0,9 se puede atribuir a la respuesta eléctrica de un

condensador en paralelo con una resistencia, según se muestra en el circuito eléctrico
equivalente de la Figura 52 e; es decir, el sistema está controlado por una única
constante de tiempo, o lo que es lo mismo, un solo proceso. Finalmente, en la región
de frecuencias más bajas, entre 10–2 y 10–3 Hz, aunque no se aprecian diferencias en
el diagrama de Bode del módulo de impedancia, se observa que el ángulo (Figura 52 b
y d) evoluciona desde –60° del primer día, hasta los cerca de –90° del séptimo: en
lugar de definir una resistencia hacia ángulos de fase cercanos a 0, a medida que
aumenta el tiempo de inmersión, evoluciona hacia un comportamiento capacitivo
más protector. La conducta descrita es, por tanto, similar para el Ti-TT en presencia de
iones fosfato (disolución P) y de iones fosfato y calcio (disolución PCa).
Para ajustar los resultados experimentales de EIS se utilizó el circuito eléctrico

equivalente de la Figura 52 e, donde Re es la resistencia del electrolito medida entre
el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo, R1 y CPE1 son la resistencia y la
pseudocapacidad asociadas a la interfase electrolito/TiO 2-Ti.
En primera instancia, el comportamiento que se observa para el Ti-TT cuando

se sumerge en la disolución que contiene glucosa (PCaG) (Figura 53), parecería similar
al descrito para las disoluciones de iones fosfato (P) y de iones fosfato y calcio (PCa).
Sin embargo, en este caso, a las frecuencias más bajas entre 10 –2 y 10–3 Hz, el ángulo
varía de -70° a aproximadamente -90° (Figura 53 b), y el valor de la impedancia
alcanzado a bajas frecuencias (Z = 1·107 Hz) (Figura 53 a) es menor que en los casos de
las disoluciones de fosfato (P) y fosfato y calcio (PCa) (Figura 52). Además, la
pendiente de la recta obtenida a frecuencias intermedias en el diagrama del módulo
de impedancia es de -0,96.
Figura 53. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de NaH2PO4 +
CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los
resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (c).
Para ajustar los resultados de impedancia, se utilizó el circuito eléctrico

equivalente de la Figura 53 c. Éste refleja la superficie de titanio oxidada (Ti-TT)
recubierta parcialmente por glucosa adsorbida, en los siete días de ensayo, en
presencia de iones fosfatos y de iones Ca2+. Re es la resistencia del electrolito; R2 y
CPE2 son la resistencia y la pseudocapacidad asociadas a la interfase
electrolito/glucosa; y R1 y CPE1 son la resistencia y la pseudocapacidad de la interfase
electrolito/TiO2-Ti, representando lasuperficie de Ti-TT libre.
Figura 54. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA (a)
módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de FBS (c) módulo de
impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―)
son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).
En la Figura 54, se muestran los diagramas de Bode para el Ti-TT sumergido en

las disoluciones de BSA (Figura 54 a y b) y FBS (Figura 54 c y d), así como el circuito
eléctrico equivalente (Figura 54 e) utilizado para ajustar los resultados experimentales
de impedancia obtenidos en ambas disoluciones. En presencia de albúmina, a
frecuencias intermedias, entre 102 y 10–2 Hz, el módulo de impedancia aumenta

linealmente, con una pendiente de -0,97; esta respuesta es asignada a un
pseudocondensador en paralelo con la resistencia de la interfase externa (Figura 54
e). Finalmente, en esta misma disolución, a las frecuencias más bajas, entre 10 -2 y 10-3
Hz, se observa un cambio de pendiente cuyo valor es -0,71, en el módulo de
impedancia, para todos los tiempos de ensayo; este hecho se corresponde con una
disminución en el ángulo de fase () hasta -20° aproximadamente (Figura 54 b). En
este caso, los diagramas de impedancia en la región de bajas frecuencias no
evolucionan con el tiempo hacia un comportamiento capacitivo más protector, sino
que se mantiene desde el primer día de ensayo, en los mismos valores de impedancia
y ángulo de fase, intentando definir una resistencia. Esto indica que la albúmina se
adsorbe sobre el Ti-TT en los primeros instantes de la inmersión, alcanzándose un
recubrimiento prácticamente completo de la superficie, sin modificación a lo largo del
tiempo de ensayo, como muestran los resultados de XPS. Teniendo esto en cuenta,
los resultados experimentales se han ajustado con dos constantes de tiempo (Figura
54 e). La primera de ellas ( = CPE2·R2) se asocia con la interfase externa
electrolito/proteínas-TiO2 y la segunda ( = CPE1·R1) está asociada a la respuesta de la
interfase proteínas/TiO2-Ti. El mismo efecto se obtiene para el FBS (Figura 54 c y d)
pero el cambio de pendiente, en el módulo de impedancia se da a frecuencias más
altas (entre 0,04 y 10-3 Hz) que para la BSA y; por consiguiente, el ángulo también
disminuye a dicha frecuencia.
En la Tabla 23, se muestran los ajustes de los resultados experimentales a los

circuitos eléctricos equivalentes del Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las
disoluciones de fosfato (P), fosfato y calcio (PCa) y glucosa (PCaG). Si consideramos los
resultados obtenidos con los ajustes de las medidas de impedancia para el Ti-TT/P
(Tabla 23), se observa que la resistencia del electrolito (Re), así como la capacidad
(CPE1) y la resistencia (R1) asociadas con la interfase formada por la superficie de
titanio oxidada (TiO2) en contacto con la disolución de fosfato, permanecen estables,
a lo largo de los 7 días de ensayo, con valores similares a los obtenidos por otros
autores [141, 142].
Cuando la disolución utilizada es de fosfato y calcio (PCa), no se observan
grandes variaciones en los resultados de capacidad a lo largo de los 7 días de ensayo.
Sin embargo, el valor de R1 aumenta en un orden de magnitud comparando el primer
y el último día de ensayo (Tabla 23). Dicho aumento se puede asociar a la adsorción
de los iones calcio y fosfato a la superficie del Ti-TT. El efecto de la adición de calcio a
la disolución de fosfato se refleja en valores de CPE1 más bajos que para las muestras
Ti-TT/P, lo que lleva asociadas unas resistencias más altas a los tiempos de ensayo
más largos. Es decir, no sólo interaccionan los iones fosfato con la capa de óxido, sino
también los iones Ca2+, que debido a su efecto puente entre los iones fosfato de carga
negativa y los grupos OH- existentes sobre el Ti-TT, dan lugar a una capa más
resistente frente a la corrosión. El cambio en la capacidad de la doble capa más
externa puede ser un indicador del cambio en el espesor de dicha capa. El inverso de
la capacidad es directamente proporcional al espesor de la capa porosa. Por tanto, la
disminución en la capacidad es consistente con un aumento en el espesor de dicha
capa debido a la interacción con el electrolito.
En presencia de glucosa (disolución de PCaG), el circuito eléctrico equivalente

propuesto para el ajuste de los resultados de EIS cambia con respecto al utilizado en
el caso de las disoluciones de fosfato (P) y de fosfato y calcio (PCa) (Figura 52 e). CPE2
es la capacidad debida a la adsorción de glucosa sobre la superficie del Ti-TT. Los
valores de CPE2 se mantienen prácticamente constantes a lo largo del tiempo (Tabla
23), indicando que la adsorción de la glucosa a la superficie del Ti-TT es rápida. Los
valores de R2, asociados a la formación de esta capa, aumentan ligeramente a lo largo
del tiempo de inmersión, lo que quiere decir que la glucosa se reorganiza sobre la
superficie de Ti-TT aumentando su resistencia. A su vez, como observamos en la Tabla
23, el valor de R1 asociada a la interfase electrolito/TiO 2-Ti aumenta con el tiempo de
exposición. En este caso, tanto los iones fosfato como los iones calcio pueden ser
incorporados a la superficie libre de Ti-TT aumentando su resistencia.
2
Super- t Re R2 % Error CPE2 % Error R1 % Error CPE1 % Error 
n2 n1
ficie 2 -2 -(1-n) 2 -2 -(1-n)
día  cm (R2) Fcm s (CPE2) cm (R1) Fcm s (CPE1)
8 -3
1s 141,9 - - - - - 1,8·10 11,6 9,48 1,0 0,96 9,3·10
7 -3
2 140,7 - - - - - 5,5·10 19,1 9,53 0,9 0,95 8,7·10
7 -3
4 140,3 - - - - - 3,0·10 16,1 9,49 0,9 0,96 8,9·10
Ti-TT/P
7 -2
5 139,8 - - - - - 9,7·10 19,9 9,11 0,9 0,96 1,3·10
8 -2
6 140,6 - - - - - 1,9·10 20,2 8,92 1,0 0,97 1,4·10
- 8 -2
7 141,4 - - - - 1,4·10 19,8 9,20 1,0 0,96 1,5·10
7 -2
1 104,4 - - - - - 4,5·10 18,1 6,72 0,8 0,96 1,4·10
7 -2
2 122,7 - - - - - 3,8·10 24,9 7,24 0,9 0,96 1,5·10
8 -2
3 115,9 - - - - - 1,1·10 22,1 7,04 0,9 0,96 1,5·10
Ti-TT/
8 -2
4 127,9 - - - - - 1,9·10 19,7 7,10 0,8 0,97 2,0·10
PCa
7 -2
5 128,2 - - - - - 9,2·10 19,3 7,28 0,7 0,97 1,1·10
8 -2
6 124,6 - - - - - 2,6·10 15,2 7,29 1,1 0,97 1,8·10
8 -2
7 125,8 - - - - - 4,9·10 17,4 7,27 1,2 0,97 2,1·10

7 -3
1 99,2 148,6 11,5 4,50 6,5 0,97 7,3·10 5,9 3,73 7,6 0,93 1,1·10
7 -3
2 105,4 155,8 13,3 4,61 8,1 1,00 6,1·10 5,8 3,62 10,0 0,94 1,5·10
8 -3
3 106,9 161,1 14,0 4,54 8,8 1,00 1,3·10 13,1 3,52 11,0 0,94 1,9·10
Ti-TT/
7 -3
4 105,0 160,5 14,9 4,58 9,2 1,00 4,6·10 5,1 3,64 11,4 0,94 1,9·10
PCaG
las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG).
7 -3
5 106,7 165,9 16,0 5,05 9,9 0,99 5,0·10 5,3 3,37 14,4 0,94 1,8·10
8 -3
6 112,8 188,2 11,5 4,95 6,8 1,00 3,5·10 25,8 3,24 10,2 0,94 1,2·10
8 -3
Tabla 23. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT, sumergido, durante 7 días, en
7 119,3 198,2 11,7 5,02 7,1 1,00 3,1·10 22,6 3,27 10,2 0,94 1,1·10
t Re R2 % Error CPE2 % Error R1 % Error CPE1 % Error
Super- 2
n2 n1 
ficie 2 -2 -(1-n) 2 -2 -(1-n)
6 6 -4
1 93,7 3,4·10 30,3 118,21 88,4 0,99 4,2·10 7,6 9,84 7,5 0,97 5,1·10
6 6 -4
2 89,1 2,5·10 2,8 96,83 5,4 1,00 3,9·10 1,4 9,35 0,5 0,97 2,3·10
6 6 -4
3 88,0 2,5·10 3,5 1,00 3,9·10 1,2 9,15 0,4 2,1·10
111,91 5,0 0,97

Ti-TT/ 6 6 -4
4 88,6 2,4·10 4,3 123,90 5,1 1,00 3,9·10 1,1 9,00 0,4 0,97 2,2·10
BSA
6 6 -4
5 88,2 2,4·10 4,3 123,68 5,4 1,00 3,9·10 1,1 9,01 0,4 0,97 2,4·10
6 6 -4
6 86,2 2,2·10 7,6 113,05 8,8 1,00 3,8·10 1,7 9,07 0,7 0,97 2,2·10
6 6 -4
7 85,0 2,1·10 6,8 112,06 9,2 1,00 3,8·10 1,8 9,05 0,7 0,97 2,1·10
6 6 -3
1 97,1 1,3·10 3,6 12,25 2,4 0,98 2,4·10 10,6 55,36 10,6 0,93 1,3·10
5 6 -3
2 96,6 9,2·10 16,2 13,61 11,9 0,97 2,4·10 29,3 34,59 29,6 0,96 2,3·10
5 6 -3
3 95,8 9,7·10 16,2 13,26 12,0 0,97 2,3·10 34,0 38,73 34,0 0,96 2,3·10
Ti-TT/ 5 6 -3
4 96,3 8,0·10 16,6 14,46 11,9 0,97 2,7·10 23,9 29,91 23,9 0,96 2,7·10
FBS
5 6 -3
5 95,1 5,9·10 16,8 16,91 11,4 0,98 3,4·10 14,4 22,00 14,4 0,96 2,9·10
5 6 -3
6 94,0 5,3·10 15,2 17,64 10,1 0,98 3,2·10 11,9 21,40 11,9 0,95 2,6·10
5 6 -3
7 92,7 4,8·10 13,9 18,33 9,0 0,98 3,1·10 9,8 20,51 9,8 0,95 2,3·10
Tabla 24. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en
Cuando el Ti-TT se sumerge en la disolución de BSA, el circuito eléctrico

equivalente que en principio mejor simularía el comportamiento de los resultados
experimentales de impedancia es el que se muestra en la Figura 54 e. Re es la
resistencia del electrolito, CPE2 y R2 son la capacidad y la resistencia debida a la
interfase externa electrolito/BSA-TiO2 y CPE1 y R1 son la capacidad y la resistencia
asociadas a la interfase interna proteínas/TiO2-Ti. El primer resultado que llama la
atención es el valor de R2 del orden de 106cm2. Dicho valor no corresponde a la
resistencia de una interfase electrolito/BSA, más bien parece tener una cierta
contribución del óxido TiO2. Por otra parte, la resistencia R1 de la interfase interna
BSA/TiO2-Ti es del mismo orden de magnitud que para R2. Por tanto, aunque dos
circuitos RC en serie parecerían ser la mejor opción para ajustar los resultados de EIS
para el Ti-TT inmerso en BSA, los resultados obtenidos del ajuste no parecen tener
sentido físico. En consecuencia, se utilizó un circuito simplificado donde Re es la
resistencia del electrolito, y CPE1 y R1 son la capacidad y la resistencia de la interfase
electrolito/proteína-TiO2 (los resultados se muestran en la Tabla 25). En este caso, el
valor de CPE1 presenta valores de 8-9 µFcm-2s-(1-n), obteniéndose valores similares
para el primer y último día de ensayo. Los valores de CPE1 asociados a la BSA son el
doble de los obtenidos para el Ti-TT en la disolución que contiene glucosa. Esto es
debido, probablemente, a que la BSA es una proteína altamente polar que incrementa
la constante dieléctrica de la disolución cuando se disuelve en agua (comportamiento
atípico). Puesto que la capacidad y la constante dieléctrica son proporcionales, es
lógico que se obtengan valores de capacidad mayores para la disolución de BSA que
para la disolución que contiene glucosa. Asimismo, el valor de la R1 es muy elevado (≈
106 cm2) si la comparamos con la resistencia asociada a la interfase glucosa/TiO 2 (≈
150 cm2), lo que induce a pensar que existe una contribución de la capa de TiO2.
Además, esta resistencia disminuye con el tiempo de inmersión en BSA. No hay que
olvidar el efecto quelante de la albúmina que puede hacer disminuir la resistencia del
óxido de Ti, resultado que ya observamos en las mayores densidades de corriente
anódicas, en las curvas de polarización obtenidas para las muestras sumergidas en

BSA (Figura 50 b).
Tabla 25. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en
Super- t Re R1 % Error CPE1 % Error

n1 2
ficie días  cm 2
(R1) Fcm s-2 -(1-n)
(CPE1)
6
1 93,5 5,3·10 1,4 9,24 0,5 0,97 5,3·10-4
2 88,9 5,1·106 1,4 8,68 0,5 0,97 5,1·10-4
3 87,7 4,9·106 1,3 8,61 0,5 0,97 5,0·10-4
Ti-TT /
4 88,4 4,9·106 1,3 8,52 0,5 0,97 4,7·10-4
BSA
5 87,9 4,8·106 1,3 8,53 0,5 0,97 4,7·10-4
6 86,0 4,7·106 1,0 8,51 0,4 0,97 2,3·10-4
7 84,8 4,7·106 1,0 8,47 0,3 0,97 2,2·10-4
1 97,1 2,2·106 2,8 10,46 1,3 0,96 2,4·10-3
2 96,6 2,6·106 3,3 10,49 1,5 0,95 3,5·10-3
3 95,8 2,5·106 3,3 10,59 1,6 0,95 3,5·10-3
Ti-TT /
4 96,3 2,8·106 3,5 10,54 1,6 0,95 3,7·10-3
FBS
5 95,1 3,3·106 3,8 10,47 1,6 0,95 3,8·10-3
6 94,0 3,1·106 3,6 10,59 1,6 0,95 3,6·10-3
7 92,7 3,0·106 3,6 10,61 1,5 0,95 3,5·10-3
Finalmente, cuando las muestras de Ti-TT se sumergen en la disolución de FBS,

el circuito eléctrico equivalente utilizado para ajustar estos resultados es el mismo
que para la disolución de BSA. En este caso, los valores de R1 son también muy
elevados, aunque prácticamente la mitad que en el caso de la disolución de BSA; esto
es debido a la mayor competencia que existe entre la BSA y el resto de los
componentes del FBS por adsorberse a la superficie. CPE1 se mantiene constante con
el tiempo de ensayo, indicando que la adsorción de los componentes del FBS se
produce en los primeros momentos. Efectivamente, si R1 tiene cierta contribución de
la capa oxidada presente sobre la superficie de Ti-TT, el ligero aumento que se
observa para los valores de R1 con el tiempo de ensayo indicaría que la capa de óxido
crece paulatinamente. No obstante, estos valores de R1 en presencia de BSA son

mayores que para la disolución de FBS debido a la existencia de otros componentes
en el FBS que aumentan la corrosión del Ti-TT.
Trasformadas de Kramers-Kronig (K-K)
Una vez analizados los diagramas de impedancia obtenidos para el Ti-TT

tratado con cada uno de los componentes del DMEMc y ajustados a los circuitos
eléctricos equivalentes, se procedió a calcular las transformadas de Kramers-Kronig
[100]
, con el objetivo de evaluar la fiabilidad de los resultados experimentales
obtenidos.
En las Figura 55 y 56 se muestran los diagramas donde se representan los

resultados experimentales, así como los calculados a partir de las transformadas de K-
K, para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de: P, PCa y PCaG, y BSA
y FBS, respectivamente. Además, se han calculado los errores medios comparando los
resultados obtenidos de las transformadas de K-K con los resultados experimentales
utilizando la ecuación (9) (Tabla 26):
∑ | |
̅ (9)
donde N es el número de puntos, Zex es el valor de la impedancia experimental, ZKK es

el valor de la impedancia obtenido por medio de los K-K y Zmax el valor máximo de la
impedancia.
Por regla general, la consistencia de los resultados experimentales es

excelente.
Figura 55. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a)
NaH2PO4 (P), (b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y (c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG) y resultados obtenidos
utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).
Figura 56. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a)
BSA y (b) FBS y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+).
En la Tabla 26 se muestran los errores medios calculados de las

representaciones de K-K con respecto a los resultados experimentales para el Ti-TT en
las disoluciones de P, PCa, PCaG, BSA y FBS.
[124]
Como se ha comentado anteriormente, Dougherty y Smedley consideran
que la fiabilidad de los resultados obtenidos de las medidas de impedancia es buena o
aceptable cuando el error medio, tanto de la componente Real como de la Imaginaria,
se encuentra por debajo del 3%. En la Tabla 26 vemos que el error medio obtenido
para cada una de las transformadas de K-K no supera el 0,9%; por tanto, los
resultados experimentales satisfacen las transformadas de K-K [143-145].
Tabla 26. Errores medios calculados, ec. (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K) con
respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en
las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS.
Error medio (%)

Disoluciones Componente real (Z´) Componente imaginaria (Z´´)
P 0,878 0,021
PCa 0,598 0,086
PCaG 0,599 0,150
BSA 0,246 0,259
FBS 0,414 0,679
4.3.4 Discusión
Cuando una superficie de Ti recién pulida se pone en contacto con la

atmósfera, se forma espontáneamente una capa pasiva de TiO 2 [33], como ha quedado
reflejado en los análisis de XPS para el titanio másico (Ti-m) (Tabla 19). El buen
comportamiento frente a la corrosión tanto “in vitro” como “in vivo” de esta capa
pasiva de óxido de titanio, ha propiciado que existan numerosos estudios acerca de
los diferentes métodos para aumentar el espesor de la capa y aumentar así su
estabilidad en contacto con los medios fisiológicos. El tratamiento térmico a 277˚C
[30]
durante 5 h, aumenta ligeramente el espesor de esta capa de TiO 2 según la
estimación mediante EIS, en 10 nm con respecto al Ti sin tratamiento térmico. Este
aumento de espesor, quedó reflejado en el aumento del % atómico de la banda
correspondiente al TiO2 de los espectros de O1s y Ti2p, en los análisis de XPS (Tabla
19), así como a partir de las medidas de capacidad. Según Hwang y col. [28] cuando el
titanio se trata a temperaturas inferiores a 600°C se obtienen capas de TiO2 amorfas y
de tipo anatasa que favorecen la precipitación de depósitos Ca-P.
Asimismo, el tratamiento térmico promueve una modificación en la topografía

de la superficie que, aunque no afecta a la rugosidad media medida (RMS) (Tabla 18),
sí resulta apreciable en las imágenes obtenidas mediante el AFM (Figura 44 y 45). En
las aplicaciones biomédicas, la modificación superficial llevada a cabo sobre los

[83, 146-148]
implantes se focaliza en la nanoestructuración de la superficie , ya que la
existencia de cierta nanorugosidad en la superficie favorece el anclaje y/o la adhesión
de las células osteoblásticas.
Cuando el Ti-TT se sumerge en la disolución que contiene fosfatos, la lectura

del potencial de corrosión durante los 7 días de ensayo evoluciona hacia valores
anódicos (Figura 49). Teniendo en cuenta que el potencial de corrosión nos suministra
información acerca de la espontaneidad de la reacción de corrosión, su aumento nos
indica que el material disminuye su tendencia a corroerse, es decir, se ennoblece, o lo
que es lo mismo, la capa de óxido que recubre la superficie se va haciendo menos
[149] [56]
activa . Según Ouerd y col. , cuando el Ti se sumerge en una disolución de
fosfatos, se producen interacciones entre los grupos -OH2+ de la superficie del Ti y los
fosfatos de la disolución que se traduce en un aumento del Ecorr.
La excelente estabilidad de la capa de óxido formada sobre la superficie de Ti

en este medio queda reflejada en las curvas de polarización obtenidas a los 7 días de
inmersión. Centrándonos en la rama anódica, se observa que, a pesar de aumentar la
polarización, la densidad de corriente permanece prácticamente constante. Este es un
comportamiento típico de materiales pasivos, muy resistentes a la formación de
picaduras, como es el caso del Ti. Prueba de ello es que la pendiente de Tafel anódica
es mayor que la catódica (Tabla 22), indicando que es el proceso anódico, es decir, la
presencia de esta capa de óxido, el que controla el sistema. La gran estabilidad de la
superficie, también quedó reflejada en los valores de capacidad y resistencia
asociados con la interfase electrolito/TiO2-Ti, que se mantienen prácticamente
constantes a lo largo de los 7 días (Tabla 23), indicando que se trata de un sistema
estable debido al control anódico que ejerce la capa de TiO 2. La incorporación de P en
la capa de óxido se observó a través de los espectros de XPS después de 7 días de
inmersión (Tabla 20). Así, el % atómico del pico del O1s asignado al enlace Ti-OH para
el Ti-TT, aumenta para el Ti-TT después del tratamiento con la disolución de fosfatos.
Dicho pico podría tener una contribución del enlace P=O-, cuya energía de ligadura es
similar (531,3 eV). Como el porcentaje atómico del fósforo en esta muestra es solo del
1,5% (Tabla 21), dicha contribución no sería muy significativa. Sin embargo,
basándonos en los resultados de Helsen y Healy [36, 38], es más probable que al ponerse
en contacto el Ti-TT con una disolución acuosa, en este caso de fosfatos, se haya
formado mayor número de grupos Ti-OH.
La presencia de Ca2+ en las disoluciones fisiológicas juega un papel importante

en la interacción del medio con las superficies de los implantes de Ti. Como ocurría
con la disolución de fosfatos, el potencial de corrosión de las muestras de Ti-TT
aumenta a medida que aumenta el tiempo de inmersión: la superficie se ennoblece
con el tiempo. La presencia de los iones Ca2+ favorece la atracción de los iones fosfato
hacia la superficie de Ti-TT, que está cargada negativamente [38, 128]. Los grupos Ti-OH
ácidos (Ti-O-) del Ti-TT interaccionan con los iones Ca2+ [123] para formar una capa de
titanato de calcio. Esta capa facilita la incorporación de los iones fosfato a la superficie
[32]
que, con el tiempo, forman los núcleos de hidroxiapatita . La incorporación de los
iones Ca2+a la superficie se pone de manifiesto en la disminución de la corriente
catódica [119] (Figura 50) y en el aumento de un orden de magnitud que se obtiene en
el valor de la resistencia asociada con la interfase electrolito/TiO 2-Ti al cabo de 7 días
(Tabla 23). Este aumento puede corresponder, además de a la adsorción de calcio
sobre la superficie de Ti-TT, por medio de los grupos hidroxilo ácidos (Ti-O-), a la
adsorción de los iones fosfato por medio de los grupos hidroxilo básicos (Ti-OH2+) [38,
123]
o a la formación de CaHPO4 [139], como muestran los espectros de XPS (Tabla 20).
Como se puede observar por los resultados obtenidos, la presencia de iones fosfato y
calcio en el medio fisiológico modifica, aunque sea lentamente, la composición
química de la superficie de Ti-TT. Teniendo en cuenta que estos dos iones están
directamente implicados en la formación de la hidroxiapatita que compone el hueso,
es evidente que su interacción con las superficies metálicas, con el resultado final de
formar fosfatos de calcio de estequiometria similar a la del hueso, es muy favorable

para conseguir una superficie que sea biocompatible con el entorno fisiológico.
Otros iones inorgánicos con porcentajes importantes en el medio fisiológico

son los cloruros. En general, estos iones despasivan los materiales metálicos mediante
la formación de picaduras, con la consiguiente liberación de iones metálicos al medio
circundante; como consecuencia provocan la acumulación en los alrededores del
implante o incluso en órganos alejados de la localización del mismo.
Afortunadamente, la superficie de los materiales metálicos de base Ti están
recubiertas por una capa de óxido de titanio que es resistente a la acción de estos
iones.
La gran complejidad del medio fisiológico reside, no sólo en el alto contenido

de sales inorgánicas, sino en la presencia de un gran número de compuestos
orgánicos cuya interacción con las superficies metálicas difiere de la encontrada para
los iones inorgánicos. La interacción con la superficie de estas moléculas más grandes
puede venir dada por la adsorción de las mismas mediante enlaces físicos o químicos,
o bien pueden formar complejos con los iones metálicos de la superficie, dando lugar
a la disolución del metal.
Cuando las muestras de Ti-TT se sumergen en una disolución que, además de

iones Ca2+ y PO43-, contiene glucosa, el aumento del potencial de corrosión a lo largo
de los 7 días de ensayo indica que sigue la misma tendencia que con las que contenían
fosfatos y calcio; es decir, la superficie se ennoblece. Sin embargo, el efecto de la
glucosa sobre la superficie de las muestras parece ser diferente a los otros dos iones.
De la misma manera que para las disoluciones anteriores, el sistema está

controlado anódicamente; por tanto, es la capa de TiO 2 la que impide o retarda la
corrosión. En presencia de glucosa, la densidad de corriente catódica para el Ti-TT es
menor que en la disolución de fosfatos y mayor que en la disolución de NaH2PO4 +
CaCl2 (Figura 50), por lo tanto, la reacción de reducción de oxígeno está menos
impedida en presencia que en ausencia de glucosa. Este hecho, se ve corroborado por
el valor de la pendiente de Tafel catódica (PCaG/0,160 V), que es ligeramente menor
que en ausencia de glucosa (PCa/0,187 V) (Tabla 22). Por otra parte, el espectro de
XPS (Figura 47) muestra que existe aproximadamente la mitad de la superficie del Ti-
TT libre de glucosa, además de estar presentes los iones calcio y fosfato. En
concordancia, los resultados de impedancia (que se han ajustado a un circuito que
refleja un recubrimiento parcial de glucosa) muestran que la resistencia asociada a la
interfase electrolito/TiO2-Ti aumenta con el tiempo de inmersión (Tabla 23)
posiblemente debido a la incorporación de los iones fosfato y calcio a la superficie del
óxido libre de glucosa.
La adsorción de la albúmina sobre el Ti-TT sumergidos en las disoluciones de

[150]
BSA y FBS es muy rápida , manteniéndose estable a lo largo del tiempo, lo que
bloquea la posible interacción con otros componentes de la disolución [59]. Es por esto
que el potencial de corrosión para ambos casos se mantiene constante durante los 7
días de ensayo (Figura 49). Además, en presencia de proteínas, los valores de las
pendientes anódicas son superiores a los de las pendientes catódicas (Tabla 22). Estos
[150]
resultados concuerdan con los obtenidos por Williams y col. y por tanto el
proceso, de nuevo, está controlado anódicamente, debido por un lado, a la capa de
[151]
óxido superficial, y por otro a la capa de biomoléculas adsorbidas a la superficie .
Ahora bien, no hay que olvidar que las proteínas pueden acelerar la disolución de los
[121, 122]
metales por sus efectos quelantes , acelerar la reacción anódica y disminuir la
densidad de corriente catódica con respecto a las disoluciones que no contienen
[117] [119]
proteínas . Esta disminución, es debida, según Cheng y Roscoe , a que las
moléculas de BSA adsorbidas cubren los sitios de reacción y/o bloquean el transporte
hacia la superficie de Ti del oxígeno disuelto en el electrolito. En la disolución de FBS
hay más competencia entre la albúmina y el resto de componentes por adsorberse o
interactuar con la superficie, y por consiguiente, habrá menor cantidad de albúmina
adsorbida que en el caso de la BSA. Esto justifica la ligera diferencia de densidad de

corriente anódica registrada para ambos casos (iFBS < iBSA) (Figura 50).
Centrándonos en los resultados obtenidos para las muestras sumergidas en la

disolución de BSA, los valores de la resistencia, son iguales para el primer y el último
día de ensayo, debido a que la adsorción de albúmina es muy rápida e impide que
tanto el fosfato como el calcio se adsorban a la superficie inmediatamente: siendo a
tiempos más largos de inmersión cuando estos iones podrían desplazar las moléculas
de albúmina, adsorberse y formar depósitos de CaP [116].
Es importante destacar, que las atracciones electrostáticas, entre la superficie

del Ti-TT y los diferentes iones presentes en el electrolito podrían ser las responsables
de la adsorción de la albúmina. En medio ácido la BSA tiene carga positiva, debido a
que los grupos amino (-NH2) se convierten en –NH3+. Sin embargo, en medios básicos
los grupos carboxílicos pierden un H+ convirtiéndose en –COO-, lo que contribuye a
que la proteína esté cargada negativamente. A pH fisiológico (pH = 7,4) la albúmina
está cargada negativamente, debido a que su punto isoeléctrico es de pI= 4,7-4,9 y a
que tiene además muchos sitios de unión para el Ca 2+: la incorporación de los iones de
calcio a la molécula de albúmina puede favorecer la atracción de la misma hacia la
superficie que está cargada negativamente (Ti-O-) [128]. De este modo, el Ca2+ actuaría
[55, 123]
como puente entre la albúmina y la superficie de Ti-TT . Los iones de calcio
deberían aumentar la adsorción de albúmina sobre la superficie del Ti, mientras que
los iones fosfato deberían disminuirla. La ausencia de fósforo así como de calcio en la
superficie de Ti-TT/BSA se puede explicar, según indican las medidas de XPS, por la
posible competencia entre los grupos carboxilo de la albúmina y los iones fosfato por
intercambiarse con los grupos hidroxilo básicos presentes en la superficie [54, 55, 117]. Sin
embargo, en presencia de iones Ca2+ la adsorción de la albúmina está favorecida, por
tanto, es la capa de proteínas (BSA) la que no permite su detección.
Finalmente, intentando simular el suero fisiológico completo, los resultados

obtenidos para el comportamiento de las muestras de Ti-TT sumergidas en la
disolución de FBS, parecen indicar que la capa de biomoléculas adsorbida es más
heterogénea que en el caso de las muestras sumergidas en la disolución de BSA. A
pesar de que la evolución del potencial de corrosión con el tiempo, refleja un
comportamiento idéntico al de la disolución con albúmina (Figura 49), (indicando que
la presencia de la albúmina es determinante en la tendencia frente a la corrosión del
sistema), tanto las curvas de polarización, como la impedancia y XPS no fueron
capaces de evidenciar diferencias entre las dos disoluciones (BSA y FBS). Por ejemplo,
los valores de la resistencia para las muestras sumergidas en FBS son algo más bajos
que para la disolución de BSA (Tabla 25). Por otro lado, en el caso del FBS, el valor de
la resistencia aumenta ligeramente, a la vez que la capacidad se mantiene constante
[48]
con el tiempo de inmersión, lo que indicaría, según Contu y col. , que el oxígeno
sería capaz de llegar a la superficie de las muestras haciendo crecer ligeramente el
óxido superficial. Sin embargo, los fenómenos de corrosión provocados por los
componentes del FBS hacen que se encuentre en equilibrio tanto la formación de la
capa de TiO2 como la destrucción de la misma. Además, nuestros resultados reflejan
que cuando sólo tenemos albúmina en la disolución los valores de resistencia y
capacidad permanecen constantes a lo largo del tiempo, por lo que no se favorece la
difusión a través de la capa de albúmina adsorbida, sino todo lo contrario. De alguna
manera, la presencia de otras proteínas (en menor proporción, iones y vitaminas
presentes en el FBS) impiden la adsorción completa de la albúmina sobre la superficie
(sistema dinámico) permitiendo una leve difusión del oxígeno a través de estos
puntos libres. Esta competencia de interacción con la superficie se comprobó
mediante XPS a través del cual pudimos detectar tanto fósforo como calcio sobre su
superficie (Tabla 20).
4.4 Estudio de la interfase Ti-TT/Osteoblastos Saos-2
Como ya se ha mencionado anteriormente (Capítulo 4.2) la etapa fundamental

para que tenga éxito un implante metálico es aquella donde se produce el contacto
con las células osteoblásticas. No todos los acabados superficiales de los materiales de
base Ti son adecuados para la osteointegración del biomaterial en el hueso. Es por
esto necesario hacer la superficie lo más apetecible posible para los osteoblastos. En
este capítulo se van a estudiar las interacciones que tienen lugar entre el acabado
denominado Ti-TT (descrito en el capítulo 4.3) y los osteoblastos humanos Saos-2.
4.4.1 Curva de crecimiento de Osteoblastos Saos-2
En la Figura 57 aparece la curva de crecimiento de osteoblastos de

osteosarcoma humano Saos-2 para una concentración celular inicial de 2,5·104
osteoblastos/ml (1,5·104 osteoblastos/cm2) sobre una placa de poliestireno utilizada
como control y sobre las superficies de Ti-m y Ti-TT. Estas curvas nos proporcionan
información sobre la predisposición y velocidad con la que proliferan los osteoblastos
sobre dichas superficies.
Figura 57. Curva de crecimiento (a) y diagrama de barras (b) de los osteoblastos Saos-2 en placa de
(●) plástico, (▲) Ti-m y (■) Ti-TT.
180 4.4 Estudio de la interfase Ti-TT/Osteoblastos Saos-2
En la Figura 57 podemos observar cómo partiendo en todos los casos de la

misma concentración celular, al cabo de 7 días, el valor máximo de osteoblastos
obtenido para el crecimiento en la placa de poliestireno es de, aproximadamente,
6,5·105 osteoblastos/ml; le siguen las superficies de Ti-TT y Ti-m, para las que se han
obtenido 4,5·105 y 3,6·105 osteoblastos/ml, respectivamente. Estos resultados indican
que el tratamiento térmico proporciona una superficie más adecuada para la
adhesión celular que la superficie sin tratamiento térmico, y que la proliferación
celular aumenta exponencialmente.
4.4.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM)
En la Figura 58 se muestran las imágenes de SEM para el Ti-TT después de 1, 3,

5 y 7 días de incubación en el cultivo celular.
Figura 58. Imágenes de SEM del Ti-TT con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de incubación
en el cultivo celular.
Desde los primeros estadíos de adhesión (Figura 58 a) los osteoblastos se

multiplican con el tiempo aumentando el grado de recubrimiento sobre la superficie
metálica (Figura 58 d). A pesar de este recubrimiento progresivo, no se llega a
alcanzar la confluencia celular sobre la superficie de Ti-TT. La adhesión celular y la
desorción continúan con un mecanismo dinámico sin cubrir la superficie en su
totalidad.
4.4.3 Caracterización del Ti-TT sumergido en DMEMc y en cultivos de Saos-2
por espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)
Para evaluar y entender las interacciones que se producen entre un implante y

el entorno biológico en el que se va a alojar, es necesario conocer la composición de
la superficie después de exponerla al medio del cultivo celular. En la Tabla 27
aparecen los picos característicos de XPS de la superficie de una muestra de Ti-TT
después de haber estado sumergida 7 días en DMEMc. Lo primero que llama la
atención es que la señal correspondiente al Ti2p no aparece, demostrando que la
cantidad de proteínas adsorbidas es tan grande (mayor que el recorrido libre medio
del electrón para los fotoelectrones del Ti2p que es de aproximadamente 3 nm) que
enmascara la superficie de Ti; la consecuencia es que dicho pico no se registra. Sin
embargo, el espectro de alta resolución del C1s muestra las bandas características de
la estructura de una proteína (es decir, aminoácidos unidos por enlaces peptídicos en
una cadena lineal). La deconvolución del espectro del C1s está realizada en base a
[113, 114, 152]
estudios previos ; se puede descomponer en tres picos (Tabla 27): el
primero a energía de ligadura más baja (284,8 eV) correspondiente a los enlaces C-C,
C=C y C-H; uno atribuido a los enlaces del grupo amino (C-NH-) y al enlace C=O (286,4
eV); y por último, a energía de ligadura más alta el pico asignado al enlace peptídico
(CO-NH-) y a los grupos ácidos (COOH) de las proteínas adsorbidas (288,3 eV).
Tabla 27. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-TT después de 7 días
sumergido en DMEMc y para 1, 3, 5 y 7 días en presencia de Saos-2.
Energía de
Superficie Elemento Asignación % atómico
ligadura (eV)
C-C, C-H 284,8 19,6

C1s C-NH-, C=O 286,4 15,0
CO-NH-, COOH 288,3 11,4
O=C-OH, C=O,
531,5 25,0
-O=C-NH-
O1s
Ti-TT 9,0
-C=O, COOH,
/DMEMc 533,0
C-OH
-O=C-NH-, –NH2 399,9 7,4

N1s
-NH3+ 401,5 2,6
Ca2p Ca2+ 347,7 3,0
P2p PO4-3 133,5 7,0
Tiempo (Días)
1 3 5 7
C-C, C-H 284,8 16,7 13,5 20,7 21,8

C1s C-NH-, C=O 286,2 30,7 34,3 26,7 31,8
CO-NH-, COOH 288,2 20,5 17,2 18,3 19,6
TiO2 529,9 4,1 4,2 4,5 2,0

O1s N-C=O 531,6 4,2 4,1 4,0 3,5
C-O 532,8 1,3 1,8 1,5 1,9
Ti-TT /
Saos-2 -O=C-NH-,–NH2 400,1 11,9 12,4 12,5 12,0
N1s
–NH3+ 401,6 2,8 2,9 3,3 3,2
Ti2p3/2 TiO2 458,6 7,3 7,9 7,8 3,6
P2p PO4-3 133,5 0,2 1,0 0,4 0,4
Ca2p3/2 CaHPO4 347,4 0,3 0,7 0,3 0,2

Figura 59. Espectros de alta resolución de XPS del O1s de Ti-TT y de Ti-TT con Saos-2 a diferentes
tiempos de incubación una vez retirados los osteoblastos Saos-2.
De acuerdo con estos resultados, el espectro de alta resolución del O1s

muestra a 531,5 eV el pico correspondiente a los enlaces O=C-OH, C=O y -O=C-NH-; y
a 533,0 eV el pico asignado a los enlaces -C=O, COOH y C-OH. De la misma forma que
el C1s, la banda del N1s proviene de las proteínas adsorbidas (Tabla 27). El pico del
N1s es asimétrico y se deconvoluciona a su vez en dos picos, el correspondiente a –
NH3+ (401,5 eV) y la principal contribución (399,9 eV) del enlace peptídico (-O=C-NH-)
y del grupo amino (-NH2) (Tabla 27). Asimismo, aparecen las bandas asociadas al Ca y
al P con % atómicos muy superiores a las observadas en el caso de las disoluciones de
fosfato (P), fosfato y calcio (PCa) y FBS (Tabla 20 y Tabla 27).
Una vez analizada por XPS la superficie de Ti-TT sumergido, durante 7 días, en
DMEMc, se procedió a evaluar las modificaciones superficiales del Ti-TT como
consecuencia de la actividad celular en presencia de Saos-2 durante 7 días. En la Tabla
27, aparecen la energía de ligadura de los picos correspondientes a las muestras
sumergidas durante 1, 3, 5 y 7 días en un cultivo celular con una densidad celular
inicial de 1,5·104 osteoblastos/cm2.
En este caso, a diferencia de lo que sucedía con las muestras sumergidas en

DMEMc, aparece claramente el pico del Ti2p a 458,6 eV correspondiente al TiO2. De
hecho, el espectro de alta resolución del O1s muestra la banda que se asigna al TiO 2 a
una energía de ligadura más baja (529,9 eV) (Figura 59). El séptimo día de incubación
el % atómico de esta banda disminuye, lo que podría indicar que la capa de TiO 2 ha
disminuido de espesor por la acción de los osteoblastos ya que la contribución debida
a las proteínas es prácticamente constante a lo largo del tiempo de ensayo. El pico
principal que aparece a 531,6 eV se atribuye al oxígeno en los enlaces N-C=O [114], y la
señal a 532,8 eV se asigna a los átomos de oxígeno que forman el enlace C-O (Tabla
27). La banda del oxígeno podría recibir contribuciones debidas al oxígeno presente
[70, 110]
en iones carbonato, iones fosfato y grupos carboxílicos . Sin embargo, el pico
correspondiente al enlace peptídico a 400,1 eV domina el espectro del N1s
observándose también el grupo –NH3+ a 401,6 eV (Tabla 27). Asimismo, aparecen las
bandas correspondientes al P2p y al Ca2p (Tabla 27), aunque con muy poco %
atómico. La asignación de las bandas del C1s es la misma que en el caso del DMEMc.
4.4.4. Caracterización electroquímica del Ti-TT sumergido en DMEMc y en
cultivos de osteoblastos Saos-2
4.4.4.1 Evolución del potencial de corrosión (E corr ) con el tiempo de inmersión
En la Figura 60, se muestra la variación del Ecorr, durante 7 días, de las

superficies de Ti-TT sumergidas en el medio de cultivo DMEMc sin osteoblastos (Ti-
TT/DMEMc) y con osteoblastos Saos-2 (Ti-TT/Saos-2). El Ecorr para el DMEMc aumenta
levemente desde -0,014 V vs Pt hasta estabilizarse al cabo de 7 días en +0,016 V vs Pt.
Cuando se añaden Saos-2 al medio, el potencial varía de -0,145 V a -0,071 V vs Pt
como puede observarse en la Figura 60. Es decir, en los dos casos se observa una
ligera tendencia hacia valores de potencial anódicos con el tiempo de inmersión. En
general, el Ecorr para las muestras sumergidas en el cultivo de Saos-2 toma valores más
catódicos que en ausencia de osteoblastos.
Figura 60. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-TT sumergido, durante 7
días, en la disolución de (■) DMEMc y en (●) presencia de osteoblastos Saos-2.
Es destacable la gran variabilidad de los valores de potencial de corrosión en el

medio con osteoblastos para cada día de ensayo, en comparación con el potencial de
corrosión cuando los osteoblastos no están presentes en el medio.
En la Figura 61, se han representado las curvas de polarización registradas para

el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en DMEMc en ausencia y presencia de Saos-2.
Figura 61. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido en DMEMc en presencia (●) y ausencia (■) de
osteoblastos Saos-2 a los 7 días de ensayo.
Tanto la densidad catódica como anódica son superiores en presencia de

células, lo que indica que la actividad celular y los productos generados por ellas
alteran el comportamiento frente a la corrosión de la superficie de Ti-TT. Este
comportamiento es similar al observado para el Ti-Q. En presencia de osteoblastos, se
pueden identificar dos zonas en la región catódica. La primera zona, comprendida

entre 0 V y -0,300 V de sobretensión respecto al Ecorr, es atribuida a la reducción del
oxígeno disuelto en la disolución. La segunda, comprendida entre -0,300 V y -0,500 V
de polarización, puede ser atribuida según los diagramas de Pourbaix para el Ti a pH
7,4, a una combinación de reducción de oxígeno y de reducción de los protones. Sin
embargo, en ausencia de osteoblastos no se diferencian claramente estas dos zonas:
lo que se estará produciendo es la reacción catódica de reducción de oxígeno.
Figura 62. Curvas de polarización de Ti-TT sumergido durante 1 (■), 3 (●), 5 (▲) y 7 (▼) días en un
cultivo de osteoblastos Saos-2.
Si se comparan las curvas de polarización en presencia de células obtenidas a lo

largo de 7 días (Figura 62) se puede observar que, a medida que aumenta el tiempo
de inmersión, la densidad de corriente anódica también aumenta. Estos resultados
indican que el fenómeno de transferencia de carga está menos impedido en las
superficies de Ti-TT en presencia de Saos-2, debido, probablemente, al efecto de las
especies generadas como consecuencia del metabolismo celular (H2O2, óxidos

nitrosos, etc.) que modifican la estabilidad de la capa oxidada de las muestras de Ti-
TT. Además, la densidad de corriente catódica aumenta del día 3 al 7, lo que indica
que el acceso del oxígeno a la superficie esta cada vez más favorecido.
En la Tabla 28, aparecen los valores de las pendientes de Tafel anódicas y

catódicas para las muestras de Ti-TT sumergidas de 1 a 7 días en DMEMc y en
presencia de osteoblastos. Si comparamos los valores de las pendientes de Tafel
anódicas y catódicas en DMEMc (Tabla 28), se puede decir que el primer día de
ensayo existe un control anódico, que evoluciona hacia un control mixto al séptimo
día de inmersión. El control anódico inicial viene determinado fundamentalmente por
la resistencia de la capa de óxido con la película orgánica adsorbida sobre la
superficie. Sin embargo, la disminución de la pendiente anódica indica que la acción
de los componentes del DMEMc repercute en la estabilidad de la capa de óxido
facilitando el flujo de corriente a su través. Por otra parte, en presencia de Saos-2 el
valor de la pendiente de Tafel catódica es 0,354 V para el primer día (pocas células
adheridas sobre la superficie, Figura 58 a), valor similar al obtenido cuando las
muestras están sumergidas en DMEMc. Con el tiempo de incubación, la pendiente de
Tafel catódica evoluciona de manera parecida al DMEMc (Tabla 28, Figura 58 d). Sin
embargo, los valores de las pendientes de Tafel anódicas indican que el mecanismo de
corrosión evoluciona desde un control anódico, el primer día de ensayo, hacia un
control mixto, a medida que aumenta el recubrimiento celular de la superficie en los
días 3 y 5, y finalmente, al séptimo día se da un control catódico (Figura 58). Podemos
decir que la capa va perdiendo resistencia con el paso del tiempo.
En presencia de Saos-2, el valor de la pendiente de Tafel catódica para el

séptimo día, es menor que en DMEMc, indicando que la reducción de oxígeno está
más favorecida.
Tabla 28. Pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT sumergido en DMEMc en
presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.
Tiempo (días) c (V) a (V)

1 0,336 0,957
3 0,661 0,540
Ti-TT /DMEMc
5 0,600 0,494
7 0,618 0,520
1 0,354 0,715
3 0,639 0,652
Ti-TT / Saos-2
5 0,562 0,470
7 0,511 0,387
En la Figura 63 (a y b) se muestran los diagramas de Bode obtenidos para el Ti-

TT sumergido en el medio de cultivo (DMEMc) a 1, 3, 5 y 7 días de ensayo. En estos
diagramas, podemos observar que la respuesta en impedancia es la misma
independientemente del tiempo de ensayo. A altas frecuencias, de 10 5 a 630 Hz,
aparece un valor constante en el módulo de impedancia seguido por un continuo
aumento desde aproximadamente 70 cm2 (Re) hasta 107 cm2 a frecuencias medias
y bajas (630 y 10-3 Hz) con una pendiente de -0,97. Los valores de (Figura 63 b)
aumentan desde 0° a -89° entre 105 y 10 Hz, manteniéndose en ese valor hasta el
final del ensayo. El ajuste de los resultados experimentales de impedancia se ha
realizado utilizando el circuito eléctrico equivalente de la Figura 63 e, donde Re es la
resistencia del electrolito entre el electrodo de referencia y el de trabajo, y R2 es la
resistencia de la superficie oxidada del Ti-TT y las proteínas adsorbidas. CPE2 está
asociada con una distribución de valores de capacidad que contiene la contribución
de la capacidad de la capa oxidada así como de las proteínas adsorbidas sobre la
superficie del Ti-TT.
Figura 63. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a) módulo
de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia de Saos-2 c) módulo de
son los ajustes con los circuitos eléctricos equivalentes e), f) y g).
%
% % %
t Re R2 CPE2 R1 CPE1
Error Error Error
Super- Error
n2 n1 2
ficie
días  cm2 (R2) Fcm-2 s-(1-n) (CPE2) cm2 (R1) Fcm-2 s-(1-n) (CPE1)
8 -4
1 76,3 2,2·10 15,3 9,05 0,2 0,97 - - - - - 9,8·10
8 -3
3 68,6 2,4·10 17,8 8,05 0,2 0,98 - - - - - 1,2·10
Ti-TT/
DMEM
c
8 -3
5 61,7 2,7·10 17,2 8,24 0,2 0,96 - - - - - 1,5·10
8 -4
7 57,3 2,9·10 16,2 8,62 0,1 0,96 - - - - - 1,7·10
7 -3
1 71,6 4,5·10 12,6 11,10 0,5 0,95 - - - - - 6,3·10
en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2.
5 8 -3
3 88,0 4,2·10 5,8 11,85 1,3 0,94 1,1·10 11,3 16,84 6,5 0,89 6,5·10
Ti-TT/
Saos-2
5 7 -3
5 79,0 2,1·10 5,3 11,56 1,6 0,94 7,2·10 11,9 23,42 6,4 0,97 8,4·10
4 7 -2
7 78,3 9,5·10 10,5 20,67 4,7 0,91 2,1·10 20,9 28,65 2,6 1,00 3,5·10
Tabla 29. Ajustes de los resultados experimentales de EIS del Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días,
La presencia de los osteoblastos Saos-2 en el medio de cultivo modifica la

interfase Ti-TT/proteínas adsorbidas del DMEMc, provocando cambios en la respuesta
de impedancia. En la Figura 63 (c y d), se muestra la evolución del módulo de
impedancia y del ángulo de fase frente a la frecuencia, respectivamente, para las
muestras de Ti-TT sumergidas en DMEMc con Saos-2 durante 1, 3, 5 y 7 días. De 1 a 3
días de incubación, la interfase del sistema Saos-2/Ti-TT ha cambiado
significativamente alterando los valores de impedancia frente a la frecuencia. El
sistema muestra una constante de tiempo para el primer día y dos constantes
claramente diferenciadas después del tercer día de ensayo, con max a 10 Hz y 10-3 Hz
en el ángulo de fase (Figura 63 d).
A frecuencias altas, el módulo de impedancia muestra un valor constante (Re, a

 = 0 en el ángulo de fase), cuya resistencia es ligeramente más alta que para DMEMc
(Tabla 29). A frecuencias medias, entre 240 y 1 Hz, la pendiente de aproximadamente
-0,9 puede ser atribuida a un condensador en paralelo con una resistencia asociados a
la interfase electrolito (DMEMc)/Saos-2. En el intervalo de frecuencias más bajas

(desde 10-2 a 10-3 Hz) se observa una pendiente de -0,83 en el módulo de impedancia
frente a la frecuencia. Esta pendiente puede ser atribuida a la interfaseelectrolito
(DMEM)/TiO2-Ti-TT representando la superficie libre del biomaterial en contacto con
Saos-2. El cambio de pendiente se ve reflejado en el diagrama de Bode del ángulo de
fase (Figura 63 c y d) apareciendo un mínimo a 10-1 Hz.
Los resultados de las medidas de impedancia del Ti-TT en presencia de Saos-2

se han ajustado teniendo en cuenta los circuitos eléctricos equivalentes de la Figura
63. Para el primer día de inmersión del Ti-TT en Saos-2, se ha propuesto el mismo
circuito que para el sistema DMEMc/Ti-TT (Figura 63 e), debido a que existe una sola
constante de tiempo y a que el recubrimiento celular de la superficie es escaso (Figura
58 a). Para los días 3 y 5 se propuso el circuito eléctrico equivalente de la Figura 63 f,
que representa una superficie de Ti-TT parcialmente cubierta por Saos-2 (Figura 58 b y
c). Para el séptimo día, aunque no se alcanza la confluencia celular (Figura 58 d), el
circuito equivalente que mejor representa este sistema es el que se muestra en la

Figura 63 g. Los componentes del circuito son: Re, la resistencia del electrolito; CPE2,
elemento de fase constante que puede ser asignado a la capacidad de la capa de
adsorción de las biomoléculas, que incluye osteoblastos y matriz extracelular; R2, la
resistencia asociada con ella; CPE1, un elemento de fase constante que simula la
conducta no ideal de un condensador de la interfase formada por el medio de cultivo
(DMEMc) y los aminoácidos, proteínas y matriz extracelular adsorbidos sobre la
superficie oxidada del Ti-TT; y R1 la resistencia asociada a la superficie de óxido
modificada libre de osteoblastos. Para el día 7, CPE1 y R1 corresponden a la interfase
interna Saos-2-proteínas/TiO2.
En la Tabla 29 se muestran los ajustes de los resultados experimentales y

teóricos de las medidas de EIS de Ti-TT en DMEMc en presencia y ausencia de
osteoblastos Saos-2 después de 1, 3, 5 y 7 días de incubación.
Para el Ti-TT inmerso en DMEMc, CPE2 es prácticamente constante a lo largo

de los 7 días de ensayo y sin embargo R2 aumenta ligeramente. No obstante, el orden
de magnitud 108 es característico de la capa de óxido existente sobre el Ti-TT.
En presencia de Saos-2 (Tabla 29), la CPE2 de la capa biomoléculas aumenta

con el tiempo de incubación; R2 disminuye sugiriendo que la cantidad de proteínas
adsorbidas directamente sobre el Ti-TT decrece igualmente durante la adhesión
celular como ya se ha mencionado con anterioridad para el sistema Saos-2/Ti-Q.
Además, la resistencia del óxido (R1) también disminuye y CPE1 aumenta con el
tiempo de ensayo. Esto indica que la presencia de osteoblastos altera la capa oxidada,
puesto que los compuestos secretados por éstos aceleran su disolución.
Trasformadas de Kramers-Kronig (K-K)
Una vez analizados y ajustados los diagramas de impedancia, las transformadas

[100]
de Kramers-Kronig (K-K) permitieron evaluar la fiabilidad de las medidas de
impedancia.
Figura 64. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido en: a) DMEMc y b)
DMEMc con Saos-2, y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+) para
el día 7 de ensayo.
A modo de ejemplo, en la Figura 64, aparecen representados los resultados

experimentales y los calculados a partir de las transformadas de K-K para el Ti-TT
sumergido en DMEMc durante 7 días en ausencia y presencia de Saos-2. Como se

puede observar en la Figura 64, la consistencia de los resultados experimentales es
bastante buena. En la Tabla 30 se muestran los errores medios calculados utilizando la
ecuación (9), de las transformadas de K-K con respecto a los resultados
experimentales para el DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos a los 7 días
de ensayo.
Tabla 30. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones de
Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el DMEMc en
presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo.
Error medio (%)
Medios Componente real (Z´) Componente imaginaria (Z”)
DMEMc 0,129 0,398
Saos-2 0,918 0,123
El error medio obtenido para cada una de las transformadas de K-K para todos
los días de ensayo, no supera el 1%, por lo que los resultados experimentales
satisfacen las transformadas de K-K.
4.4.5 Discusión
La interacción entre el medio fisiológico y la superficie del implante depende como

hemos visto, del estado superficial del biomaterial. Topografía, rugosidad o textura, y
composición química, condicionan la posterior adhesión celular a través de las
[153]
interacciones con receptores celulares . Las modificaciones superficiales
producidas por la oxidación del Ti consiguen, por un lado, modificar la composición
química de la superficie (como se comprobó mediante XPS (Figura 46) pero por otro,
se crean “nanotopografías” (Figura 44 Figura 45) que pueden ser relevantes para
[154]
favorecer la adsorción de proteínas previas a la adhesión celular . La tendencia
general de las investigaciones en curso parece indicar que las topografías del orden de
la nanoescala son capaces de, a corto y medio plazo, modular la respuesta celular. Por
otra parte, una vez que los osteoblastos comienzan su adhesión, la presencia de
microsurcos sobre la superficie metálica pueden “ordenar” dicha adhesión. De hecho,
teniendo en cuenta las dimensiones de los filopodios de estas células, que tienen un
diámetro en torno a 50-100 nm, se puede afirmar que los surcos por encima de los 2
µm de anchura y 500 nm de profundidad favorecen el punto de anclaje de los
osteoblastos y por tanto, su adhesión [155].
Por todo lo expuesto, queda claro que el tratamiento de oxidación da lugar a

una estructura superficial texturada y químicamente modificada, que podría favorecer
la adsorción de proteínas y la adhesión de los osteoblastos, como se pudo comprobar
en el estudio de la cinética de adhesión de osteoblastos sobre la superficie oxidada,
en comparación con la superficie sin oxidar (Figura 57). Estos resultados indicaron que
el tratamiento térmico proporciona una superficie más adecuada para la adhesión
celular que la superficie de titanio sin tratamiento térmico.
La etapa inicial implicada en la adhesión celular es la adsorción de proteínas y

la formación de biopelículas sobre la superficie. Esta adsorción de proteínas es el paso
intermedio en la adhesión celular con la superficie del biomaterial. La presencia de
estas proteínas sobre la superficie del Ti-TT, después de ser expuesta al DMEMc,
quedó confirmada a través del XPS con la detección de los grupos amino –NH2, grupos
[113,
ácidos –COOH y el grupo amida CO-NH-, asignado al enlace peptídico (Tabla 27)
114, 152]
. La superficie aparece totalmente recubierta por distintas proteínas y la matriz
extracelular después de 7 días de inmersión puesto que no se ha registrado la banda
correspondiente al Ti2p.
El enriquecimiento de la biopelícula fue también observado mediante

impedancia electroquímica. Los valores de resistencia (R2) atribuidos a la interfase
electrolito/proteínas-TiO2 para el Ti-TT sumergido en DMEMc, aumentan ligeramente
a lo largo de los 7 días de ensayo (Tabla 29). Este comportamiento también se ha
[156] [157]
observado sobre platino , electrodos de “glassy carbón” y otros electrodos
metálicos [158] inmersos en disoluciones de albúmina.
El complejo mecanismo competitivo de adsorción de proteínas y adhesión de

osteoblastos, quedó reflejado en la variabilidad del potencial de corrosión a lo largo
del tiempo de incubación. En el estudio del Ecorr con el tiempo, lo primero que llama la
atención es la gran variación que obtenemos cuando el medio contiene osteoblastos
(Figura 60). Esto es debido a muchos factores implicados en la investigación con
cultivos celulares, tales como distintos pases de osteoblastos o diferentes porcentajes
de estos en distintas etapas de diferenciación [68]. Es prácticamente imposible utilizar
en cada ensayo la misma proporción de osteoblastos en el mismo estadío de
diferenciación.
Para las muestras de Ti-TT sumergidas en el cultivo de Saos-2, el Ecorr adquiere

[59, 68]
valores más catódicos que en DMEMc durante los 7 días de incubación . Esto
puede ser debido a que tanto los iones y proteínas presentes en el medio (ej. PO 4-3,
Ca2+ y BSA) como la matriz extracelular segregada por los osteoblastos, se adsorben a
la superficie, como ha sido confirmado por XPS. En el proceso de adsorción los iones y
las proteínas compiten por unirse al sustrato; además, las proteínas pueden formar
complejos con los iones Ti4+ facilitando la disolución del Ti [68]
. Como se aha
comentado anteriormente, los osteoblastos tienen un metabolismo muy activo y son
[137]
muy reactivos produciendo superóxidos, óxido nitroso, protones, etc. . Para
adsorberse a la superficie segregan matriz extracelular, produciéndose el
desplazamiento o sustitución de las proteínas del medio adsorbidas por otras
segregadas por los osteoblastos en el intento de anclarse a la superficie del material
[59]
. Todos estos factores hacen que el Ecorr se desplace a valores más catódicos que en
ausencia de Saos-2, lo que nos indica una tendencia hacia un sistema activo. Este
movimiento de moléculas en la superficie del Ti-TT favorece la llegada del oxígeno a la
superficie con mayor facilidad que en el caso del DMEMc. Por esta razón, la densidad
de corriente catódica en presencia de Saos-2 aumenta con el tiempo de incubación
(Figura 62) siendo en cualquier caso superior a la obtenida para el Ti-TT en ausencia
de osteoblastos. De la misma forma, la densidad de corriente anódica es superior en
presencia de Saos-2 que en DMEMc y aumenta durante los siete días de ensayo
(Figura 62). Este hecho se debe, de nuevo, a la acción de los productos excretados por
los osteoblastos (superóxidos, óxidos nitrosos, protones, etc.) que parecen atacar con
mayor facilidad a la superficie oxidada del Ti disminuyendo el carácter protector de la
capa de óxido (TiO2).
Todos estos resultados concuerdan con los referidos en otros trabajos donde
las proteínas y aminoácidos aceleran la disolución del titanio (reacción anódica) [134], y
la presencia de Saos-2 aumenta la velocidad de corrosión de los biomateriales
[135]
metálicos . Así se pasa de un control anódico para el primer día a un control
catódico para el séptimo día. En este caso, la etapa limitante del proceso podría ser la
reducción del oxígeno bien por problemas de difusión, o bien porque los sitios donde
se produce esta reacción estén bloqueados.
La presencia de los osteoblastos sobre la superficie de Ti-TT fue también

evidenciada de forma indirecta por XPS puesto que aparecen los picos característicos
de las proteínas de adhesión después de la desorción celular. El estudio de XPS refleja
que el % atómico de la banda correspondiente al TiO2 disminuye a los siete días (Tabla
27), sin llegar a desaparecer. Dicha disminución se podría deber a la reducción del
espesor de la capa de TiO2 debido al efecto corrosivo de los productos de desecho
celular ya comentado anteriormente. El espectro de alta resolución del P2p sugiere la
presencia del fósforo en forma de fosfatos o pirofosfatos y el del Ca2p en forma de
CaHPO4. Por tanto, la presencia de estos dos iones (precursores de la hidroxiapatita)
en la superficie del Ti-TT, después de estar 7 días en contacto con los osteoblastos,
indica, al parecer, que han sido incorporados a la superficie del óxido. Esta
incorporación ha sido estudiada por otros autores in vivo [127] e in vitro [42], pero en el
caso que nos ocupa, el tiempo de incubación ha sido tan breve que no ha sido
suficiente para inducir la nucleación de precipitados de Ca/P. Es bien conocido que la
osteointegración de los implantes de titanio normalmente requiere varios meses [129].

[133]
De hecho, el cociente Ca/P en función del tiempo para la apatita es de 1,67 ,
mientras que el valor máximo de cociente obtenido en estas muestras ha sido de 0,74
para el día 1 y el mínimo para el día 7 de 0,54. A medida que pasa el tiempo se
obtiene que la relación Ca/P va disminuyendo. La razón pudiera ser los cambios que,
como hemos señalado, producen los osteoblastos en la superficie, sustituyendo las
proteínas del medio adsorbidas por otras que segregan ellos mismos [59], desplazando
a los iones de calcio y fósforo adsorbidos sobre la superficie [54].
De acuerdo con el ajuste de los resultados de impedancia en presencia de Saos-

2 (Tabla 29), el valor de capacidad (CPE2) asignada a la interfase electrolito
(DMEMc)/Saos-2-proteínas aumenta a lo largo de los 7 días de ensayo. Esto indica que
la cantidad de proteínas adsorbidas sobre la superficie de Ti-TT disminuye debido a la
[59]
presencia de osteoblastos . Como es lógico, a medida que aumenta el valor de la
capacidad disminuye el valor de la resistencia, debido a la disminución de la
concentración de proteínas adsorbidas. Por otra parte, el valor de la resistencia (R1)
asociada a la interfase electrolito (DMEMc)/TiO2-Ti disminuye con el consiguiente
aumento en el valor de la capacidad (CPE1) a lo largo del tiempo de incubación. Este
cambio es más drástico para el día 7 (Tabla 29) alcanzando un valor de R1 = 2,1·107
·cm2 para la interfase interna Saos-2-proteínas/TiO2. Estos resultados vuelven a
indicar que los compuestos generados por los osteoblastos modifican la capa de TiO2,
acelerando su disolución coincidiendo con el aumento de densidad de corriente
anódica observado en las curvas de polarización. Además, los valores de CPE1 son
muy similares a los obtenidos por otros autores en la bibliografía [59, 159].
5. Conclusiones
5. Conclusiones 203
Se han estudiado las interacciones de los componentes más significativos del

DMEMc, así como con el medio de cultivo en ausencia y en presencia de osteoblastos
Saos-2, con dos acabados diferentes de Ti. El primero de ellos (Ti evaporado sobre
cristales de cuarzo) de baja rugosidad (37 nm) y con una capa pasiva de óxido de
titanio de aproximadamente 2 nm de espesor; el segundo (Ti másico con tratamiento
térmico), de mayor intervalo de rugosidad (19-92 nm) con un espesor de la capa
oxidada de 12 nm debido al tratamiento térmico utilizado.
La interacción de ambas superficies con los distintos componentes presentes

en el medio fisiológico ha dado lugar a las siguientes conclusiones, dependiendo de la
naturaleza inorgánica u orgánica del componente utilizado:
 Naturaleza inorgánica:
- La inmersión de las superficies de Ti en la disolución que contiene NaH2PO4 da

lugar a la incorporación de iones fosfato a la superficie de TiO2, aumentando la
resistencia a la corrosión de la capa pasiva.
- La adición de CaCl2 a la disolución de NaH2PO4 favorece la incorporación de

iones calcio y fosfato a la capa pasiva de TiO2, lo que produce un aumento de la
resistencia del óxido. No obstante, la relación Ca/P es demasiado baja para
inducir la precipitación de la hidroxiapatita. Este resultado confirma la lenta
cinética de crecimiento de los núcleos Ca-P observada en las superficies de los
implantes de Ti en ensayos in vivo.
 Naturaleza orgánica:
- La glucosa se adsorbe rápidamente a la superficie de Ti-Q, manteniéndose en

un estado estacionario hasta el final del ensayo. No obstante, la espectroscopía
de impedancia electroquímica reveló que la glucosa permite la difusión del
oxígeno a su través que se traduce en un aumento de la resistencia de la capa
de óxido de titanio a lo largo del tiempo de ensayo. Sin embargo, la adsorción
204 5. Conclusiones
de glucosa sobre el Ti-TT no alcanza el recubrimiento total, permitiendo la

incorporación de iones fosfato e iones calcio sobre la superficie libre de Ti/TiO 2
aumentando su resistencia con el tiempo de inmersión.
- La albúmina se adsorbe sobre las superficies de titanio formando una capa

densa y homogénea que impide la difusión del oxígeno hacia la superficie del
electrodo, manteniendo la resistencia frente a la corrosión de la capa pasiva
inalterada con el tiempo de inmersión. En presencia de iones calcio, dicha
adsorción se ve favorecida ya que estos iones actúan como puente de unión
entre los grupos básicos de la superficie de Ti y los grupos ácidos de la proteína.
- El estudio de las interacciones del Ti con el suero fetal bovino, FBS, pone de
manifiesto la presencia de otras proteínas sobre la superficie del biomaterial
(XPS, QCM) produciendo un incremento de la resistencia de la interfase externa
con el tiempo de inmersión y una disminución de la corriente de reducción del
oxígeno.
- Las pendientes catódicas y anódicas del Ti-Q son menores que para el Ti-TT,
por tanto, los procesos anódicos y catódicos están más impedidos en el Ti-TT;
es decir, el tratamiento térmico promueve la formación de una capa de óxido
que resiste mejor los procesos de corrosión.
- En presencia de DMEMc la interacción de aminoácidos, proteínas y otros

componentes del medio con la superficie de Ti-Q provoca la disminución de la
resistencia a la corrosión de la capa de óxido de titanio. Por el contrario, la
superficie de Ti-TT no parece verse afectada por la presencia de estos
componentes, manteniendo una alta resistencia del óxido de Ti a lo largo del
tiempo de inmersión.
En presencia de células osteoblásticas:

5. Conclusiones 205
- Las superficies de Ti se recubren a medida que aumenta el tiempo de

inmersión, aunque en ninguno de los dos casos, Ti-Q o Ti-TT se observa un
recubrimiento confluente después de un tiempo de incubación de 7 días.
- Los compuestos que generan los osteoblastos modifican la capa de TiO 2

acelerando la disolución de la superficie de Ti, y por tanto, adelgazando la capa
de TiO2 para ambos acabados.
- La pendiente de Tafel anódica, tanto para el Ti-TT como para el Ti-Q,

disminuye en presencia de Saos-2 y además aumenta la densidad de corriente
anódica con el tiempo de incubación, lo cual confirma la agresividad de los
productos de desecho generados por los osteoblastos Saos-2, que son capaces
de alterar la superficies de Ti disminuyendo su resistencia frente a la corrosión.
- Los estudios con la QCM muestran que la cinética de adhesión de los

osteoblastos Saos-2 sobre Ti-Q es de primer orden con K = 2·10-3 min-1, lo que
significa que el proceso no está controlado por difusión, sino por la velocidad
de adsorción de los osteoblastos sobre la superficie metálica.
- Los análisis de XPS realizados sobre el Ti-TT después de estar en contacto con
los osteoblastos Saos-2, muestran claramente la presencia de proteínas en la
superficie, así como iones fosfato y calcio incorporados a la capa de óxido de
titanio después de siete días de incubación.
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7. Anexos
7. Anexos 223
7.1 Composición del DMEM
COMPONENTES Peso Concentración Concentración

molecular (mg/L) (mM)
Aminoácidos
Glycine 75 30 0,4
L-Arginine hydrochloride 211 84 0,398
L-Cystine 2HCl 313 63 0,201
L-Glutamine 146 584 4
L-Histidine hydrochloride-H2O 210 42 0,2
L-Isoleucine 131 105 0,802
L-Leucine 131 105 0,802
L-Lysine hydrochloride 183 146 0,798
L-Methionine 149 30 0,201
L-Phenylalanine 165 66 0,4
L-Serine 105 42 0,4
L-Threonine 119 95 0,798
L-Tryptophan 204 16 0,0784
L-Tyrosine disodium salt dihydrate 261 104 0,398
L-Valine 117 94 0,803
Vitaminas
Choline chloride 140 4 0,0286
D-Calcium pantothenate 477 4 0,00839
Folic Acid 441 4 0,00907
Niacinamide 122 4 0,0328
Pyridoxine hydrochloride 206 4 0,0194
Riboflavin 376 0,4 0,00106
Thiamine hydrochloride 337 4 0,0119
i-Inositol 180 7,2 0,04
Sales Inorgánicas
Calcium Chloride (CaCl2) 111 200 1,8

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404 0,1 0,000248
Magnesium Sulfate (MgSO4) 120 97,67 0,814
Potassium Chloride (KCl) 75 400 5,33
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 3700 44,05
Sodium Chloride (NaCl) 58 4750 81,9
Sodium Phosphate monobasic 138 125 0,906
(NaH2PO4-H2O)
Otros Componentes
D-Glucose (Dextrose) 180 4500 25

HEPES 238 5958 25,03
224 7.Anexos
7.2 Composición bioquímica y hormonal del FBS

Componentes Unidades Rango Mean
pH pH 7–7,3 7,07
Osmolality mosm/kg 308–334 315,82
Conductivity mS/cm 7
Total protein g/dl 3,8–4,4 4,08
Endotoxin EU/ml 0,03–4,8 1,20
Albumin g/dl 2,52
Alkaline phosphatase U/l 202–380 289,45
Bicarbonate mequiv/l 7–12 10
Bilirubin mg/dl 0,1–0,4 0,23
BUN mg/dl 12–21 16,32
Calcium mg/dl 11,1–24 14,32
Chloride mequiv/l 79–103 97,77
Cholesterol mg/dl 22–38 31,21
Creatinine mg/dl 2,4–3 2,77
 Globulin g/dl 1,19
_ Globulin g/dl
_ Globulin g/dl 0,378
GG-transpeptidase U/l 5–12 6,18
Glucose mg/dl 32–142 102,32
HD lipoproteins mg/dl 10–12 10,82
LD lipoproteins mg/dl 1,6–52,8 30,19
Phosphorus (inorganic) mg/dl 8,4–10,8 9,65
Potassium mequiv/l 10,1–14 12,22
SGOT U/l 31–60 44,5
Sodium mequiv/l 110–141 133,59
Transferrin mg/dl 153–271 190,22
Triglycerides mg/dl 46–83 65–91
Uric acid mg/dl 1,3–3 2,22
Hemoglobin mg/dl 6,4–23,3 13–11
Lactate dehydrogenase mg/dl 484–755 637,77
Vitronectin µg/ml 13–70
Cortisol µg/dl 0,1–2,24 0,82
Estradiol pg/ml 8,78–36 18,67
FSH ng/ml 7,0–115,1 51,1
Growth hormone ng/ml 34,3–221,5 180,8
Insulin nIU/ml 2,56–12,11 5,96
Lutinizing hormone ng/ml 0,1–1,16 71
Progesterone ng/ml 0,03–0,18 0,08
Prolactin ng/ml 1,16–45,68 14,04
Prostaglandin E pg/ml 0,25–5,20 0,60
Prostaglandin F pg/ml 0,76–18,2 1,85
Testosterone ng/ml 0,01–0,18 0,097
TSH mU/ml 0,39–1,40 0,83
Thyroxine (T4) µg/ml 12,05–21,22 15,18
Capacidad total de unir hierro g/dl 148–376 264,95
7. Anexos 225
7.3 Diagrama de Pourbaix para el titanio

226 7.Anexos
7.4 Curva de Volcano

7. Anexos 227
7.5 Índice de figuras
Figura 1. Estructuras cristalinas del titanio (fases α-Ti y β-Ti). ................................................... 5
Figura 2. Imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de superficies sin tratar,
tratadas con base, y con una base y posterior tratamiento térmico, de izquierda a
derecha respectivamente [21]............................................................................................ 12
Figura 3. Interfase formada entre la capa pasiva del Ti y una disolución acuosa. Marcado en
azul, coordinación simple del grupo OH- con el Ti (carácter básico); en rojo, coordinación
doble formando Ti2OH+ (carácter ácido). ......................................................................... 16
Figura 4. Fórmula molecular de la D-Glucosa. .......................................................................... 19
Figura 5. Estructura terciaria de la albúmina de suero bovino (BSA). ...................................... 20
Figura 6. Cristal de cuarzo con electrodos de Ti. ...................................................................... 35
Figura 7. Programa de temperatura aplicado a las muestras de titanio másico (Ti-m). .......... 36
Figura 8. Partes de la celda electroquímica [86] y muestras de los dos acabados de Ti (imagen
superior) y celda electroquímica en su conjunto (imagen inferior). ................................ 39
Figura 9. Cantilever y punta de AFM. ........................................................................................ 43
Figura 10. Esquema de un microscopio de fuerzas atómicas. .................................................. 44
Figura 11. Curvas de polarización para electrodos mixtos. ...................................................... 52
Figura 12. Diagrama de Tafel complete de un electrodo mixto en un medio neutro aireado. 54
Figura 13. Circuito equivalente de Randles simplificado y su respuesta en frecuencia,

representada en el plano complejo en forma de diagrama de Nyquist. ......................... 58
Figura 14. Fotografía del cristal de cuarzo y dibujo del corte AT. ............................................ 62
Figura 15. Brazo de QCM y sus componentes. ......................................................................... 66
Figura 16. Macrocelda electroquímica utilizada para realizar las medidas de QCM en
presencia de los osteoblastos Saos-2. .............................................................................. 67
Figura 17. Cámara Neubauer de contaje de células. ................................................................ 71
Figura 18. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la superficie del Ti-Q a
diferentes magnificaciones. .............................................................................................. 79
Figura 19. Imagen por microscopía de fuerza atómica (AFM) de la topografía superficial del
Ti-Q y perfil de rugosidad. ................................................................................................ 80
228 7.Anexos
Figura 20. Espectros de alta resolución de XPS del C1s, del O1s y del Ti2p para el Ti-Q. ........ 81
sumergido en la disolución P (NaH2PO4) y la disolución PCa (NaH2PO4 + CaCl2). ............ 84
sumergido en (a) una disolución de BSA y (b) una disolución de BSA + NaH 2PO4 + CaCl2.
.......................................................................................................................................... 86
sumergido en la disolución de FBS. .................................................................................. 87
Figura 24. Espectros generales de XPS para el Ti-Q sumergidos, durante 7 días en: (a) aire, (b)
NaH2PO4, (c) NaH2PO4 + CaCl2, (d) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa, (e) NaH2PO4 + CaCl2 + BSA
y (f) FBS. ............................................................................................................................ 88
Figura 25. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q después de 7
días de inmersión en a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 +
glucosa (PCaG). ................................................................................................................. 91
Figura 26. Espectros de XPS de alta resolución del C1s y del O1s para el Ti-Q sumergido,
durante 7 días, en a) BSA y b) FBS. ................................................................................... 93
Figura 27. Evolución del Ecorr con el tiempo de inmersión para el Ti-Q en (■) NaH2PO4 (P), (●)
NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦)
suero fetal bovino (FBS). .................................................................................................. 96
Figura 28. Curvas de polarización del Ti-Q sumergido, durante 7 días, en (a) (■) NaH2PO4 (P),
(●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG) y (b) (●) albúmina
(BSA) y (▲) suero fetal bovino (FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s. ................. 98
Figura 29. Densidad de corriente catódica calculada a  = -0,2 V para el Ti-Q en cada una de
las disoluciones de los componentes del DMEMc. ........................................................ 100
Figura 30. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de
NaH2PO4 (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la
disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la
frecuencia. Los símbolos son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con el
circuito eléctrico equivalente (e).................................................................................... 102
Figura 31. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de
NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la
circuito eléctrico equivalente (c). ................................................................................... 103
Figura 32. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA
a) módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de FBS
c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los
7. Anexos 229
resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente e).
........................................................................................................................................ 104
Figura 33. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-Q sumergido, durante 7 días,
en las disoluciones de: a) NaH2PO4 (P), b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y c) NaH2PO4 + CaCl2 +
glucosa (PCaG), y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-
K)(+)................................................................................................................................. 111
en las disoluciones de: a) BSA y b) FBS, y resultados obtenidos utilizando las relaciones
de Kramers-Kronig (K-K)(+). ............................................................................................ 112
Figura 35. Imágenes SEM de un osteoblasto Saos-2: a) en una de las etapas iniciales del
proceso de adhesión celular y b) un osteoblasto completamente extendido sobre la
superficie. ....................................................................................................................... 120
Figura 36. Imágenes SEM de los osteoblastos Saos-2: a) en la etapa de proliferación o división
celular y b) adhiriéndose a la superficie de Ti y relacionándose por medio de los
filopodios con los osteoblastos vecinos. ........................................................................ 120
Figura 37. Imágenes SEM del Ti-Q con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de
incubación en el cultivo celular. ..................................................................................... 121
Figura 38. Medida de QCM del Ti-Q con 5·104 Saos-2/cm2 y despegue celular con tripsina. 122
Figura 39. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-Q sumergido,
durante 7 días, en la disolución de (■) DMEMc y (●) presencia de osteoblastos Saos-2.
........................................................................................................................................ 125
Figura 40. Curvas de polarización del Ti-Q sumergido en (■) DMEMc y (●) presencia de
osteoblastos Saos-2 a los 7 días de incubación. ............................................................. 126
Figura 41. Diagrama de Bode para el Ti-Q sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a)
módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia
de Saos-2 c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos
son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con los circuitos eléctricos
equivalentes e), f) y g). ................................................................................................... 129
en: a) DMEMc y b) DMEMc con Saos-2, y los resultados obtenidos utilizando las
relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+). .......................................................................... 134
Figura 43. (a) Imagen de SEM del titanio tratado térmicamente (Ti-TT) y (b) análisis por EDX.
........................................................................................................................................ 139
Figura 44. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti antes del tratamiento térmico
(Ti-m) y perfil de Ti-m de uno de los surcos de la superficie. ......................................... 140
230 7.Anexos
Figura 45. Imagen de AFM de la topografía superficial del Ti-TT después del tratamiento
térmico y perfil de Ti-TT de uno de los surcos de la superficie. .................................... 141
Figura 46. Espectros de alta resolución de XPS del O1s para el Ti-m y el Ti-TT. .................... 143
Figura 47. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y O1s para el Ti-TT sumergido 7 días en
las disoluciones: (a) NaH2PO4, (b) NaH2PO4+ CaCl2 y (c) NaH2PO4+ CaCl2 + glucosa...... 146
Figura 48. Espectros de alta resolución de XPS del C1s y del O1s de las muestras de Ti-TT
sumergido, durante 7 días, en (a) BSA y (b) FBS. ........................................................... 149
Figura 49. Evolución del Ecorr con el tiempo para el Ti-TT en (■) NaH2PO4 (P), (●) NaH2PO4 +
CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), (▼) albúmina (BSA) y (♦) suero fetal
bovino (FBS). ................................................................................................................... 152
Figura 50. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido, durante 7 días, en (a) (■) NaH2PO4 (P),
(●) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), (▲) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), y (b) (■) NaH2PO4 (P),
(●) albúmina (BSA) y (▲) suero fetal bovino (FBS), a una velocidad de barrido de 1mV/s.
........................................................................................................................................ 154
Figura 51. Densidad de corriente catódica calculada a -0,2 V para el Ti-TT sumergido en
cada una de las disoluciones de los componentes del DMEMc. .................................... 157
Figura 52. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de
NaH2PO4 (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la
disolución de NaH2PO4 + CaCl2 (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la
circuito eléctrico equivalente (e).................................................................................... 158
Figura 53. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de
NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la
circuito eléctrico equivalente (c). ................................................................................... 160
Figura 54. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 7 días, en la disolución de BSA
(a) módulo de impedancia, y (b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en la disolución de
FBS (c) módulo de impedancia y (d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos son los
resultados experimentales y (―) son los ajustes con el circuito eléctrico equivalente (e).
........................................................................................................................................ 161
Figura 55. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7

días, en (a) NaH2PO4 (P), (b) NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y (c) NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa
(PCaG) y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-Kronig (K-K)(+). .. 169
Figura 56. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido, durante 7

días, en (a) BSA y (b) FBS y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-
Kronig (K-K)(+). ............................................................................................................... 170
7. Anexos 231
Figura 57. Curva de crecimiento (a) y diagrama de barras (b) de los osteoblastos Saos-2 en
placa de (●) plástico, (▲) Ti-m y (■) Ti-TT. ..................................................................... 179
Figura 58. Imágenes de SEM del Ti-TT con Saos-2 a: a) día 1, b) día 3, c) día 5 y d) día 7 de
incubación en el cultivo celular. ..................................................................................... 180
Figura 59. Espectros de alta resolución de XPS del O1s de Ti-TT y de Ti-TT con Saos-2 a
diferentes tiempos de incubación una vez retirados los osteoblastos con ultrasonidos.
........................................................................................................................................ 183
Figura 60. Evolución del Ecorr en función del tiempo de incubación para el Ti-TT sumergido,
durante 7 días, en la disolución de (■) DMEMc y en (●) presencia de osteoblastos Saos-
2. ..................................................................................................................................... 185
Figura 61. Curvas de polarización del Ti-TT sumergido en DMEMc en presencia (●) y ausencia
(■) de osteoblastos Saos-2 a los 7 días de ensayo. ........................................................ 186
Figura 62. Curvas de polarización de Ti-TT sumergido durante 1 (■), 3 (●), 5 (▲) y 7 (▼) días
en un cultivo de osteoblastos Saos-2. ............................................................................ 187
Figura 63. Diagrama de Bode para el Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5 y 7 días, en DMEMc a)
módulo de impedancia, y b) ángulo de fase vs la frecuencia; y en DMEMc en presencia
de Saos-2 c) módulo de impedancia y d) ángulo de fase vs la frecuencia. Los símbolos
son los resultados experimentales y (―) son los ajustes con los circuitos eléctricos
equivalentes e), f) y g). ................................................................................................... 190
Figura 64. Resultados experimentales (O) correspondientes al Ti-TT sumergido en: a) DMEMc
y b) DMEMc con Saos-2, y resultados obtenidos utilizando las relaciones de Kramers-
Kronig (K-K)(+) para el día 7 de ensayo. ......................................................................... 194
232 7.Anexos
7.6 Índice de tablas
Tabla 1. Tipos de materiales sintéticos, ventajas, desventajas y aplicaciones de biomateriales

utilizados en implantes. ...................................................................................................... 1
Tabla 2. Propiedades térmicas del titanio puro.......................................................................... 6
Tabla 3. Comparación de varias especificaciones para el α−Ti comercialmente puro (cp):

concentración máxima de aleantes, tensión de ruptura (Tr), límite elástico (Te) y
elongación máxima (ε). ...................................................................................................... 7
Tabla 4. Varios tipos de aleaciones de titanio, así como sus respectivas composiciones,
estructura cristalina, resistencia a tracción (Rt), límite elástico (Te) y elongación máxima
(ε). ....................................................................................................................................... 8
Tabla 5. Principales tratamientos superficiales del titanio y sus aleaciones para aplicaciones
biomédicas [16]. ................................................................................................................. 10
Tabla 6. Relación de reactivos utilizados en los ensayos realizados en el presente trabajo. .. 40
Tabla 7. Composición de los distintos medios utilizados para los estudios electroquímicos y
nomenclatura de las disoluciones. ................................................................................... 41
Tabla 8. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s,
del C1s y del Ti2p para el Ti-Q. ......................................................................................... 82
Tabla 9. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-Q después de 7
días sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 +
CaCl2 + glucosa (PCaG), NaH2PO4 + CaCl2 + BSA y FBS. .................................................... 90
Tabla 10. Tabla de % atómico de cada elemento, en la superficie de Ti-Q, sumergido durante
7 días en cada uno de los componentes del DMEMc. ..................................................... 95
Tabla 11. Pendientes de Tafel y Ecorr para el Ti-Q a los 7 días de inmersión en cada una de las
disoluciones de los componentes del DMEMc. ............................................................... 97
Tabla 12. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7
días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 +
glucosa (PCaG). ............................................................................................................... 107
Tabla 13. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 7
días, en las disoluciones de BSA y FBS............................................................................ 108
Tabla 14. Errores medios calculados, por medio de la expresión (9), de las representaciones
de Kramers-Kronig (K-K) con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente
para el Ti-Q sumergido, durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 +
CaCl2 (PCa), NaH2PO4 + CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS. ........................................... 113
7. Anexos 233
Tabla 15. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-Q sumergido en
DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2. ........................................... 128
Tabla 16. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-Q sumergido, durante 1,
3, 5 y 7 días, en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-
2. ..................................................................................................................................... 132
Tabla 17. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones
para el DMEMc en presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo. ..... 134
Tabla 18. Resultados de rugosidad (RMS) del titanio y del titanio después del tratamiento
térmico. ........................................................................................................................... 142
Tabla 19. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS del O1s
y del Ti2p para las muestras de Ti-m y Ti-TT. ................................................................. 143
Tabla 20. Energías de ligadura y % atómico de los espectros de alta resolución de XPS, para
el Ti-TT al cabo de 7 días sumergido en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4+ CaCl2
(PCa), NaH2PO4+ CaCl2 + glucosa (PCaG), NaH2PO4+ CaCl2 + BSA y FBS. ........................ 147
Tabla 21. Porcentaje atómico de los elementos que aparecen en XPS sobre las superficies de
Ti-TT, después de 7 días de inmersión en cada uno de los componentes del DMEMc. 150
Tabla 22. Ecorr y pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT en cada una de las
disoluciones de los componentes del DMEMc. .............................................................. 153
Tabla 23. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT, sumergido, durante 7
días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa) y NaH2PO4 + CaCl2 +
glucosa (PCaG). ............................................................................................................... 164
Tabla 24. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7
días, en las disoluciones de BSA y FBS. ........................................................................... 165
Tabla 25. Ajustes de los resultados experimentales de EIS para el Ti-TT sumergido, durante 7
días, en las disoluciones de BSA y FBS. ........................................................................... 167
Tabla 26. Errores medios calculados, ec. (9), de las representaciones de Kramers-Kronig (K-K)
con respecto a los resultados obtenidos experimentalmente para el Ti-TT sumergido,
durante 7 días, en las disoluciones de NaH2PO4 (P), NaH2PO4 + CaCl2 (PCa), NaH2PO4 +
CaCl2 + glucosa (PCaG), BSA y FBS. ................................................................................. 171
Tabla 27. Energía de ligadura y % atómico de los espectros de XPS para el Ti-TT después de 7
días sumergido en DMEMc y para 1, 3, 5 y 7 días en presencia de Saos-2. ................... 182
Tabla 28. Pendientes de Tafel al séptimo día de ensayo para el Ti-TT sumergido en DMEMc
en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2. ........................................................... 189
234 7.Anexos
Tabla 29. Ajustes de los resultados experimentales de EIS del Ti-TT sumergido, durante 1, 3, 5
y 7 días, en la disolución de DMEMc en presencia y ausencia de osteoblastos Saos-2. 191
Tabla 30. Errores medios calculados por medio de la expresión (9), de las representaciones
para el DMEMc en presencia y ausencia de Saos-2 para el séptimo día de ensayo. ..... 195

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Caracterización y estudio electroquímico

de superficies de Ti inmersas en medio

Laura Burgos Asperilla

Dpto. de Química Física Aplicada

Caracterización y estudio electroquímico de superficies de

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Me gustaría agradecer en primer lugar a la Dra. Concepción Alonso Fuente y a

Además, también quiero agradecer a todo el departamento de Química Física

A mis AMIGOS de la UAM: Miriam, gracias por tu paciencia infinita, por

Me gustaría agradecer enormemente a Merce, Isa e Isabel ya que aunque

Para terminar no se me olvida una frase que me escribió en la carpeta un amigo de la

“No consiste en llenar la vida de años, sino los años de vida”

1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática ............................................ 1

1.3 Modificaciones superficiales del titanio .................................................................... 9

1.4 Estudio de la interfase Ti/medio fisiológico ............................................................. 15

1.5 Estudio de la interfase Ti/Células ............................................................................ 22

2. Objetivos y Plan de Trabajo ....................................................................... 29

3. Materiales y métodos ............................................................................... 33

3.1 Materiales .............................................................................................................. 35

3.2 Reactivos y disoluciones ......................................................................................... 40

3.3 Fundamento teórico de las técnicas utilizadas ........................................................ 41

3.5 Metodología ........................................................................................................... 67

4. Resultados y discusión ............................................................................... 77

4.1 Estudio de la interfase Ti-Q/componentes del DMEMc ............................................ 79

4.2 Estudio de la interfase Ti-Q/Osteoblastos Saos-2 .................................................. 119

4.3 Estudio de la interfase Ti-TT/componentes del DMEMc ........................................ 139

4.4 Estudio de la interfase Ti-TT/Osteoblastos Saos-2 ................................................. 179

5. Conclusiones ............................................................................................ 201

6. Bibliografía .............................................................................................. 207

7. Anexos ..................................................................................................... 221

7.1 Composición del DMEM ........................................................................................ 223

7.2 Composición bioquímica y hormonal del FBS......................................................... 224

7.3 Diagrama de Pourbaix para el titanio .................................................................... 225

7.4 Curva de Volcano .................................................................................................. 226

7.5 Índice de figuras ................................................................................................... 227

7.6 Índice de tablas..................................................................................................... 232

1.1 Definición y requisitos de un biomaterial. Problemática

Se puede definir un biomaterial como un material farmacológicamente inerte,

Tabla 1. Tipos de materiales sintéticos, ventajas, desventajas y aplicaciones de biomateriales

Materiales Ventajas Desventajas Aplicaciones

Polímeros: Silicona, Baja resistencia Suturas, arterias,

Fractura ante esfuerzos

Existen cuatro grupos de materiales usados como implantes: metálicos,

Si atendemos a las propiedades mecánicas que se requieren para un

La biocompatibilidad de un material viene dada por su capacidad para producir

encuentran expuestos temporal o permanentemente a fluidos del cuerpo. Debido a

Como ya se ha señalado, la selección de un determinado biomaterial metálico

Teniendo en cuenta las excelentes características del titanio, se deduce que, el

embargo, a pesar de sus buenas propiedades, las elevadas exigencias de las

El titanio fue descubierto en 1791 (en el mineral menacanita) por el clérigo

brookita, ambas TiO2 tetragonal y romboédrico, respectivamente, siendo el rutilo el

Debido a las dificultades de extracción y transformación, el titanio metálico

El titanio, en estado metálico, es un material alotrópico, es decir, puede existir

Figura 1. Estructuras cristalinas del titanio (fases α-Ti y β-Ti).

En estado puro, el titanio presenta una resistividad eléctrica en el rango 0,4 –

Tabla 2. Propiedades térmicas del titanio puro.

El titanio puro es un material rígido y dúctil que presenta un módulo de

Es también muy frecuente alear el titanio con impurezas tanto intersticiales

de las impurezas disueltas en el titanio y sus concentraciones relativas, se podrán

Tabla 3. Comparación de varias especificaciones para el α−Ti comercialmente puro (cp):

Grado 1 0,020 0,015 0,18 0,03 0,20 --- 240 170-310 24

Grado 2 0,020 0,015 0,25 0,03 0,30 --- 343 275-410 20