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Técnicas histológicas
TINCIÓN
Introducción ................................. 4
El proceso histológico .................... 5
Tinción .......................................... 7
Ttinciones generale ....................... 8
Histoquímica .................................. 12
Lectinas ......................................... 15
Inmunocitoquímica ........................ 17
Hibridación in siut ......................... 22
Técnicas histológicas. Introducción. 4
Introducción
En estas páginas dedicadas a las técnicas características morfológicas de las células sólo se
histológicas vamos a describir los procesos pueden observar con estos aparatos.
experimentales necesarios para obtener secciones Existen procedimientos rápidos y simples para
teñidas y listas para observar al microscopio la observación de tejidos y células vivas que
partiendo de tejidos vivos extraídos de un animal reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la
o de una planta. Por tanto, dedicaremos espacios observación del flujo sanguíneo en capilares del
a la obtención, fijación, inclusión, corte y tinción sistema circulatorio. Otra forma de observar
de los tejidos. Todos estos apartados seguirán el células o tejidos vivos es mediante las técnicas
mismo esquema que los capítulos dedicados a los histológicas supravitales, en los que las células y
tejidos o a la célula, partir de un esquema básico los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera
y ampliar la información sucesivamente en del organismo, como es el caso de los cultivos de
páginas adicionales. No dedicaremos demasiado células y de tejidos.
espacio a los instrumentos, desde el punto de
vista operativo, pero sí a la conveniencia de su Las técnicas histológicas postvitales son
uso y a sus capacidades. aquellas en las que las células mueren durante el
La mayoría de las técnicas histológicas van proceso, pero las características morfológicas y
encaminadas a preparar el tejido para su moleculares que poseían en estado vivo se
observación con el microscopio, bien sea éste conservan mejor o peor dependiendo del tipo de
óptico o electrónico. Ello es debido a que la técnica. Estas páginas estarán dedicadas a este
estructura de los tejidos está basada en la tipo de técnicas, puesto que son las más
organización de los tipos de células que los comúnmente usadas en los laboratorios de
componen y, salvo contadas ocasiones, las histología.
El proceso histológico
Denominamos proceso histológico a una serie El proceso histológico comienza con la
de métodos y técnicas utilizados para poder obtención del tejido objeto de estudio. En el caso
estudiar las características morfológicas y de los tejidos vegetales directamente se toman
moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos muestras de los distintos órganos que componen
para estudiar los tejidos, es decir, series de el cuerpo de la planta, mientras que para los
técnicas que se utilizarán dependiendo de qué tejidos animales podemos optar por dos opciones:
característica deseemos observar. En el siguiente coger una porción del tejido u órgano y
esquema se muestran los métodos y técnicas procesarla o procesar primero el animal completo
comúnmente empleados para el procesamiento y luego extraer la muestra que nos interese. En
de los tejidos para su observación con los cualquier caso las muestras son habitualmente
microscopios óptico o electrónico. Sin embargo, fijadas con unos soluciones líquidas denominadas
hay que tener en cuenta que existen muchas fijadores, las cuales se usan para mantener las
variantes a estos "caminos" y su elección estructuras celulares y moleculares inalterables
dependerá del resultado final que queramos durante el procesamiento posterior y con una
obtener. organización lo más parecida posible a como se
Tinción
Los tejidos animales son en su gran mayoría a) Tinciones generales. Aquellas que usan
incoloros, excepto aquellos que poseen algún tipo sustancias coloreadas que se unen a componentes
de pigmento como hemoglobina de la sangre o la tisulares por afinidad química.
melanina de la epidermis. En las plantas, sin b) Histoquímica. Son aquellas técnicas de
embargo, existe una mayor variedad de tinción que implican la modificación química de
pigmentos naturales que permiten su observación algunas moléculas tisulares para posteriormente
directa con el microscopio óptico, a lo que ponerlas de manifiesto con colorantes. En este
también ayuda la presencia de las paredes apartado incluiremos también a los métodos de
celulares, las cuales facilitan la delimitación tinción basados en la capacidad catalítica de
celular y la discriminación entre diferentes algunas enzimas presentes en los tejidos que
tejidos. Cuando se inventaron los primeros queremos estudiar.
microscopios hubo que descubrir cómo teñir los
tejidos para poder desentrañar sus características c) Lectinas. Las lectinas son dominios de
morfológicas. Se observó que algunos pigmentos proteínas, como las selectinas, que son capaces
como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se de reconocer glúcidos que forman parte de
unían a determinados componentes de las células. polisacáridos. Tienen una gran especificidad y se
La expansión de la industria textil en el siglo XIX usan para determinar el tipo de glúcido que
y su necesidad de colorear las telas provocó un aparece en las glucoproteínas de las células o de
rápido desarrollo de los tintes o pigmentos. la matriz extracelular de los diferentes tejidos.
Muchas de estas sustancias fueron usadas como d) Inmunocitoquímica. Son técnicas
colorantes en la histología de los animales y de histológicas muy potentes basadas en la alta
las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la especificidad de unión de los anticuerpos a los
actualidad, alcanzándose un enorme desarrollo y antígenos contra los que se produjeron. Estos
perfeccionamiento de nuevas técnicas y antígenos pueden ser cualquier molécula tisular
moléculas sintéticas que se usan según las que, purificada en inyectada en un animal, sea
necesidades del investigador. Con la llegada de la capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos
biología molecular se han puesto en marcha otras anticuerpos añadidos a una sección de tejido
técnicas mucho más sofisticadas para observar reconocerán y se unirán específicamente a dicha
elementos celulares, entre las que se pueden molécula.
destacar aquellas que usan anticuerpos,
inmunocitoquímicas, las que usan sondas de e) Hibridación. Son técnicas basadas en la
ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o más unión complementaria de las bases de ácidos
sofisticadas aún como las que mediante el diseño nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo,
de animales transgénicos permiten identificar y y de la guanina con al citosina). Esto hace que
observar a las células que expresan un dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos
determinado gen, incluso en el organismos vivo, se unan entre sí de forma muy específica, es
gracias a la fluorescencia de la proteína verde decir, hibriden. Siguiendo este principio se
fluorescente (GFP). pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de
ADN o ARN con una secuencia de bases
No vamos a describir con detalle las técnicas determinada que llevan una molécula unida para
más complejas, al menos no en estas páginas poder detectarlas. La secuencia de bases de la
básicas, sino las más comunes, las que se suelen sonda es complementaria a otra que está presente
emplear en un laboratorio para el estudio general en la célula, normalmente en forma de ARNm.
de los tejidos. Dividiremos el conjunto de Con ello podemos observar qué células expresan
técnicas histológicas en cuatro categorías. un determinado gen.
Tinciones generales
La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los Ejemplos de colorantes básicos son la tionina,
animales, son incoloros y por ello necesitamos safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o
teñirlos para observar sus características la hematoxilina.
morfológicas. Las tinciones generales están
basadas en el uso de colorantes, sustancias Ácidos: son sales con el anión coloreado y la
mediante las cuales se consigue colorear a los base incolora. Tienen apetencia por sustancias
tejidos. Los colorantes son normalmente básicas, sobre todo estructuras proteicas
hidrosolubles y se caracterizan por unirse a localizadas en el citoplasma celular y también por
ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de
a afinidades electro-químicas. Se utilizan colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde
normalmente para teñir a las células y rápido, naranja G o la eosina.
componentes tisulares que van a ser observados Neutros: poseen una porción ácida y otra
con el microscopio óptico y por ello se realizan básica, ambas con capacidad para aportar color.
habitualmente sobre secciones de tejido, siendo Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto
las más utilizadas las secciones obtenidas a partir las partes básicas como las ácidas de los tejidos.
de inclusiones en parafina u obtenidas en el Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
criostato. Los colorantes son los elementos
principales de las tinciones generales. Son Indiferentes: realmente no se unen a elementos
moléculas que poseen tres componentes de los tejidos por afinidad química sino porque se
importantes: un esqueleto incoloro, que disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante
normalmente es un anillo aromático de benceno, sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá
al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que a las gotas de lípidos, especialmente en los
aporta el color, denominado cromóforo, y otro adipocitos.
que posibilita la unión a elementos del tejido En algunas ocasiones necesitamos resaltar
denominado auxocromo. Al conjunto de estos elementos tisulares de manera específica y para
tres elementos unidos en una molécula se ello usamos colorantes que tienen apetencia por
denomina cromógeno. dichas estructuras. Por ejemplo, la tinción
Según la naturaleza química del cromóforo hay denominada azán contiene azocarmín y naranja-
varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, anilina-ácido acético que tiñe los núcleos de rojo
derivados de la antroquinona, derivados de la y sobre todo destaca el conectivo intensamente
acridina, derivados de iminas quinónicas, teñido de azul. Otra tinción combinada es el
derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, tricrómio de Mallory que tiñe el colágeno de
derivados del xanteno y derivados de las verde, las células musculares de rojo.
talocianinas. Cuando un colorante se une al tejido y refleja
Según la naturaleza química del radical un color diferente al que tiene en solución se dice
auxocromo los colorantes se clasifican en: que ha ocurrido un fenómeno de metacromasia.
Esto se debe a que las propiedades de absorción
Básicos: son sales en las que la base aporta el de la luz del colorante cambian al unirse a
color, mientras que la parte ácida es incolora. componentes celulares. Por ejemplo, el azul de
Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido toluidina se vuelve púrpura cuando se une a
como el ADN o ciertos componentes de la matriz ciertos gránulos de los mastocitos. Cuando el
extracelular como los glicosaminoglicanos. Así, colorante unido al tejido tiene el mismo color que
ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre en solución se denomina ortocromasia.
todo el ARNr presente en los ribosomas por ser
muy abundante, así como ciertas matrices Tinción general. Una de las tinciones más
extracelulares ricas en componentes ácidos. comúnmente usada en histología es la
Atlas de histología vegetal y animal. Universidad de Vigo.
Técnicas histológicas. Tinción. 9
Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilinaeosina. Los tiempos son aproximativos
porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite
eliminar el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se
denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de
púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos
medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes.
Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado
(evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.
Atlas de histología vegetal y animal. Universidad de Vigo.
Técnicas histológicas. Tinción. 10
Histoquímica
Incluiremos dentro de las técnicas dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos:
histoquímicas a aquellas que supongan una reacciones químicas e histoquímica enzimática.
reacción química en la que intervienen moléculas Las reacciones químicas consisten en la
pertenecientes al propio tejido (trataremos la modificación química de moléculas del tejido
detección de glúcidos mediante lectinas y la para posteriormente poder colorearlas. Existen
inmunohistoquímica en apartados diferentes a técnicas histoquímicas para detectar glúcidos,
éste, aunque algunos autores las incluyen como proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímica
ténicas histoquímicas). El objetivo de la más empleada es la reacción de PAS (Periodic
histoquímica es poner de manifiesto una Acid Schiff). Se utiliza para la detección de
molécula o familia de moléculas presentes en una hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando
sección histológica y estudiar su distribución están en cantidades relativamente grandes en los
tisular "in situ". Estas moléculas son difícilmente tejidos. La modificación química del tejido
discernibles con colorantes generales. Durante el consiste en la oxidación mediante el ácido
procesamiento del tejido previo a la reacción periódico de los enlaces entre los carbonos
histoquímica, como la fijación o la inclusión, hay próximos que contienen grupos hidroxilos. Esto
que evitar dañar a la molécula que queremos provoca la formación de grupos aldehídos que
detectar porque de otra manera resultaría en serán reconocidos por el reactivo de Schiff, el
falsos negativos, es decir, no tener tinción cuando cual se combinará con ellos para dar un color
en realidad la molécula de interés sí está presente rojizo brillante. Entre los componentes del
en el tejido, aunque deteriorada. En algunas reactivo de Schiff está la pararosanilina (un
ocasiones es necesario realizar pasos previos a la componente de la fucsina básica) tratada con
reacción histoquímica para descubrir la molécula ácido sulfúrico. Una gran ventaja de la tinción
que queremos detectar, por ejemplo usando un histoquímica PAS es su capacidad de
fijador adecuado, ya que de otra manera no discriminación de tipos de glúcidos con pequeñas
reaccionaría con los reactivos químicos. Vamos a modificaciones de la técnica.
Lectinas
Aparte de las técnicas de tinción generales y produce gracias a la acción de unas lectinas
las histoquímicas, más específicas, existen otras denominadas selectinas que expresan las células
que se usan para detectar moléculas tisulares con endoteliales próximas al lugar de la lesión. Es
una alta especificidad. Ello es posible gracias a la decir, el linfocito puede salir por la pared
capacidad que tienen ciertas moléculas como las endotelial gracias a la unión de las selectinas
lectinas o las inmunoglobulinas para reconocer y endoteliales a los glúcidos de la membrana del
unirse sólo a una molécula determinada presente linfocito. En el laboratorio de histología las
en el tejido. En esta página vamos a tratar sobre lectinas se usan, sin embargo, para estudiar la
el uso de las lectinas para la detección en los distribución tisular de distintos tipos de azúcares
tejidos de distintos tipos de glúcidos de manera de manera específica. Se pueden usar diferentes
específica. En muchos textos la técnica de las tipos de lectinas en base a su especificidad de
lectinas se incluye dentro del apartado de la reconocimiento de azúcares determinados. Hay al
histoquímica. menos cinco grupos de lectinas según se unan a
Las lectinas son proteínas que tienen dominios manosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina
o secuencias de aminoácidos que son capaces de (Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc),
reconocer y unirse a glúcidos terminales que a fucosa (Fuc) o a ácido siálico (Neu5Ac),
forman parte de cadenas de oligosacáridos, bien respectivamente.
libres o formando parte de otras moléculas como Comercialmente hay disponibles docenas de
las glicoproteínas. Por ello se dice que las lectinas lectinas diferentes que se nombran según el
reconocen glicoconjugados. Las lectinas están organismo animal o la planta de la que se
ampliamente distribuidas en los tejidos animales obtienen. En el siguiente cuadro se listan las
y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por lectinas usadas comúnmente según el glúcido que
ejemplo, la salida de los linfocitos desde el reconocen.
torrente sanguíneo hacia los tejidos dañados se
Detección de lectinas mediante métodos indirectos en cortes adyacentes de epitelio del pie de
Haliotis tuberculata (oreja de mar, invertebrado prosobranquio). La imagen de la izquierda
muestra la detección de glucosamina mediante la lectina WGA biotinilada y su posterior
revelado de la peroxidasa unida a avidina (color marrón). En la imagen de la derecha se
muestra la detección de fucosa mediante la lectina AAA unida a digoxigenina. Mediante un
anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa alcalina se pone de manifiesto la
localización de la fucosa (color azul).
Inmunocitoquímica
La inmunocitoquímica es una técnica para la Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se
localización de moléculas en los tejidos mediante usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del
el empleo de anticuerpos. Es una técnica que tipo G, producidas por unas células del sistema
gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la inmunitario denominados linfocitos B durante la
estandarización de su protocolo se ha convertido respuesta inmune. La producción masiva de
en un método sencillo, rápido y muy potente. Se anticuerpos se produce en un animal cuando le
basa en la gran especificidad y alta afinidad que inyectamos una molécula, en este caso nuestra
tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas molécula problema, que reconoce como extraña.
y unirse a ellas. Además, la conjugación o Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo que
combinación de los anticuerpos con enzimas o se extrae del animal inmunizado y a partir del
con sustancias fluorescentes permite detectar cual se purifican. Éstos se usarán posteriormente
cantidades ínfimas de moléculas presentes en el en la técnica inmunocitoquímica. Las moléculas
tejido. complejas como la proteínas tienen en su
estructura varios determinantes antigénicos, es
decir, lugares que son
capaces de desencadenar
una respuesta inmune. Ello
implica que cada
determinante antigénico
activará un clon, línea de
linfocitos B, que producirá
anticuerpos contra él. Los
anticuerpos de todos los
clones de linfocitos B
activados por la molécula
inyectada irán a parar al
suero. Cuando se emplean
sueros purificados de este
tipo en inmunocitoquímica
se dice que se están
empleando anticuerpos
policlonales. Existe una
técnica que perimite aislar
y cultivar en el laboratorio
(in vitro) de forma
inividualizada a cada uno
de los clones de linfocitos B
activados durante la
respuesta inmune. Cada uno
de esos cultivos producirá
un solo tipo de
inmunoglobulina G que
reconocerá sólo a uno de
los determinantes
Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos antigénicos de la molécula
policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha). inyectada. A estos
anticuerpos se les denomina
Atlas de histología vegetal y animal. Universidad de Vigo.
Técnicas histológicas. Tinción. 18
monoclonales ya que proceden de linfocitos que diferentes fijadores según el tipo de molécula en
producen inmunoglobulinas idénticas. la que estemos interados. También es necesario
considerar el método de obtención de los cortes.
Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse Inclusiones en parafina pueden dañar las
en dos dominos: la fracción cristalizable y la moléculas por lo que en la mayoría de los casos
variable. El dominio variable es el que se encarga se suele trabajar con cortes de vibratomo o con
de reconocer al determinante antigénico de secciones obtenidas por congelación.
nuestra molécula. Hay dos sitios de unión por lo
que cada inmunoglubulina podría reconocer a dos Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la
moléculas o determinantes antigénicos, que han molécula que queramos detectar, no son visibles
de ser iguales. La fracción cristalizable tiene una con el microscopio por lo que la tendremos que
estructura similar para todas las conjugar (unirla) a otras moléculas que nos den
inmunoglubulinas G producidas por los una señal visible. Estas moléculas que aportan
individuos de una misma especie. visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos
tipos: moléculas fluorescentes y enzimas. Las
Para que un anticuerpo se una a su primeras se pueden observar con el microscopio
determinante antigénico localizado en una de fluorescencia mientras que las segundas
molécula, ésta no debe alterarse. De otro modo pueden convertir determinados sustratos solubles
ese determinante antigénico no será reconocido en productos insolubles y coloreados. La señal
por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijación aparece allí donde está la sustancia fluorescente o
del tejido debe elegirse para preservar al máximo el enzima, que es donde se ha unido la
a la molécula que queremos detectar. Así, se usan inmunoglubulina.
El método del marcado con sustancias
fluorescentes tiene una serie de ventajas
que veremos más adelante, pero tiene la
desventaje de que no son marcajes
permanentes puesto que la luz emitida
por la molécula fluorescente se
desvanece con el tiempo. Sin embargo,
las secciones procesadas con
anticuerpos unidos a enzimas pueden
deshidratarse, montarse y mantenerse
permanentemente para su obeservación.
Las enzimas habituales que se unen a
las inmunoglobulinas son la peroxidasa
y la fosfatasa alcalina.
La conjugación directa de un
marcador (enzima o fluorescente) con la
inmunoglobulina se denomina método
de detección directa. Hoy en día se
suele emplear el método de detección
indirecta, que consiste en colocar una
serie de intermediarios entre la
inmunoglobulina y la molécula
marcadora. Inicialmente se usó el
método indirecto denominado
Métodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver
unidos específicamente a una molécula del tejido. figura anterior), pero actualmente es
más frecuente usar el método del complejo matriz extracelular de forma simultánea. Esto es
avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura posible porque existe una gran variedad de
anterior). El método indirecto permite una mayor fluorocromos que son capaces de emitir luz
versatilidad de la técnica y mayor intensidad de visible tras ser excitados con diferentes longitudes
señal frente a una misma cantidad de antígeno. de onda, luego seleccionando el intervalo de
longitudes onda con el que iluminamos un tejido
La inmunofluorescencia se basa en las podemos excitar de modo individual, y
propiedades de los fluorocromos. Son moléculas secuencial, varios fluorocromos que hayamos
que emiten luz visible cuando se les ilumina con usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes,
una determinada longitud de onda. Aunque la para detectar moléculas diferentes. Tomando
inmunofluorescencia se puede usar para detectar fotografías tras cada excitación y superponiendo
a una sola molécula tisular, su verdadero dichas imágenes podemos averiguar si las
potencial se muestra cuando necesitamos una moléculas se expresan, por ejemplo, en la misma
múltiple inmunodetección, es decir, dos o más célula.
moléculas presentes en una misma célula o
Hibridación in situ
No se puede considerar a la hibridación in situ puesto que hoy en día se pueden pedir
como una técnica de uso general. Sin embargo, comercialmente la síntesis de forma química de
aporta una información sobre la fisiología de las secuencias largas de ARN (hasta 1000
células y los tejidos que no es posible obtener con nucleótidos es común). Incluso, se pueden
otras técnicas. La hibridación in situ se usa comprar las sondas ya marcadas, con lo que nos
ampliamente en investigación en desarrollo ahorramos una gran cantidad de tiempo en el
embrionario, diferenciación de células madre, laboratorio.
manipulaciones genéticas o cambios en la Sin embargo, en muchos casos no conocemos
fisiología celular frente a señales externas, entre la secuencia de bases del gen deseado por lo que
otras. Permite descubrir la expresión de un gen hay que averiguarlo primero para obtener
mediante la detección de su transcrito procesado, posteriormente la sonda. Para obtener una sonda
el ARN mensajero. Podemos descubrir qué hay primero que clonar la secuencia de bases del
células expresan un gen determinado y cuándo lo gen (ARN mensajero) que queremos detectar.
expresan. La expresión génica es un testimonio Clonar implica realizar una serie de pasos: 1)
directo de la funcionalidad celular. Existe otra Una vez purificado el ARN de nuestro tejido, los
aplicación de la hibridación in situ y consiste en ARN mensajeros se retrotranscriben
la localización física de un gen sobre un (transcripción inversa), es decir, se hacen copias
cromosoma. complementarias de ADN de todos los
La hibridación in situ se basa en la fragmentos de ARN mensajero. Se obtienen
complementariedad de bases de nucleótidos. Del hebras de ADN denominadas cDNA. 2)
mismo modo que en la inmunocitoquímica se Mediante la técnica de PCR ("polymerase chain
usan los anticuerpos, en la hibridación in situ se reaction") se consiguen multitud de copias de
usa una secuencia de nucleótidos, denominada manera específica de la secuencia de ARN
sonda, que es complementaria a la secuencia del mensajero que queremos estudiar. 3) Dichas
ARN mensajero que queremos detectar y que copias se integran en un plásmido y
está conjugada con una molécula que luego posteriormente se introduce en bacterias. 4) Se
pondremos de manifiesto y que nos sirve de cultivan las bacterias para que proliferen y así
marcador. también conseguir gran cantidad de plásmidos,
Quizá una de las razones por las que la que se duplican en cada división bacteriana. 5)
hibridación in situ no es común todavía en los Los plásmidos se extraen y purifican. 6)
laboratorios de histología es porque sintetizar una Mediante un proceso de transcripción similar al
sonda es complicado y generalmente no se puede que ocurre en el núcleo de las células, a partir de
usar en una especie animal o vegetal distinta a estos plásmidos se consiguen numerosas réplicas
aquella para la que se ha producido dicha sonda. complementarias a nuestra secuencia inserta, que
Ello es porque un mismo gen (ARN mensajero) será también complementaria a la secuencia del
en dos especies distintas tienen secuencias que no ARN mensajero que queremos detectar. El
son idénticas y por tanto hay que fabricar una resultado de la transcripción realizada repetidas
sonda para cada especie. Sin embargo, una vez veces es un gran número de cadenas de ARN
obtenida la sonda el proceso de hibridación es denominadas sondas. Durante su síntesis es
sencillo. cuando se añaden los nucleótidos conjugados con
las moléculas marcadoras que nos servirán para
Para obtner una sonda de un ARNm deseado lo detectarla una vez la hibridación se haya
primero que tenemos que hacer es conocer la producido. Normalmente son moléculas
secuencia de bases de dicho ARNm. Si esa esa pequeñas como la digoxigenina y la biotina,
secuencia está publicada en las bases de datos en aunque también se pueden utilizar moléculas
Internet todo el proceso se simplifica enormente fluorescentes, que se unen a los nucleótidos que