Anexo Pruebas Bioquímicas

OXIDASA
Prueba utilizada para la detección de la enzima citocromo-c-oxidasa, presente en los géneros
Pseudomonas, Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros. Los microorganismos que
producen la enzima oxidasa se evidencian porque en presencia de oxígeno atmosférico y citocromo
c oxidan el sustrato presente en los discos a un compuesto de color entre rosa y violáceo.
Metodología: Arrastre con un escarbadientes una cantidad importante de microorganismos a partir
de un aislamiento fresco. Realice el ensayo según las indicaciones del docente. La prueba es
positiva cuando, luego de unos minutos, aparece un color entre rosa y violáceo.

TSI (AGAR HIERRO-TRIPLE AZÚCAR)

El agar en pico de flauta se inocula pinchando en profundidad en el fondo del tubo y luego, en una
segunda etapa, estriando sobre la superficie del agar.

Producción de ácido sulfhídrico: Una reacción positiva implica el ennegrecimiento del medio de
cultivo, por formación de sulfuro de hierro.
Fermentación de azúcares (glucosa, lactosa y sacarosa):
Fermentación de glucosa: pico alcalino (rojo) - fondo ácido (amarillo)
Fermentación de glucosa, y lactosa y/o sacarosa: pico ácido- fondo ácido
Producción de gas: La producción de gas se observa cuando hay desprendimiento del agar desde la
base del tubo.

Composición:
Peptona.........................................20,0g
Cloruro de Sodio............................5.0g
Lactosa..........................................10,0g
Sacarosa........................................10,0g
Glucosa.........................................1,0g
Sulfato amònico ferroso.................0,2g
Tiosulfato de sodio.........................0,2g
Rojo de Fenol...............................0.,025g
Agar..............................................13g
Agua destilada............................1000ml
pH: 7,3

CITRATO
Se inocula el medio en pico de flauta con un inóculo denso. La reacción es positiva cuando hay
viraje del indicador al azul por alcalinización del medio debido a la utilización de citrato como
única fuente de carbono.

Composición:
Fosfato diácido de amonio............1,0g
Fosfato dipotásico.........................1,0g
Cloruro de Sodio............................5.0g
Sulfato de magnesio......................0,2g
Azul de Bromotimol.......................0,08g
Citrato de sodio.............................5,0g
Agar..............................................15g
Agua destilada.............................1000ml
pH: 6,9

UREA
Se inocula el caldo y la reacción es positiva cuando hay viraje del indicador al rojo por la formación
de NH3 (alcalinización) por acción de la ureasa producida por el microorganismo.

Composición:
Peptona .......................................1,0g
Cloruro de Sodio............................5.0g
Fosfato monopotásico....................2,0
Glucosa.........................................1,0g
Rojo de Fenol...............................0,012g
Agua destilada.............................1000ml
Urea en solución, en concentración final 2%.
pH: 6,8 – 6,9
Resuspender la cantidad necesaria de caldo deshidratado en agua destilada y filtrar asépticamente
en tubos estériles. No autoclavar dado que la urea es termolábil.

SIM (Sulfhídrico/Indol/Motilidad)
Se inocula el medio pinchando en profundidad con el ansa cargada.
Producción de ácido sulfhídrico: Una reacción positiva implica el ennegrecimiento del medio de
cultivo por formación de un precipitado de SFe.
Motilidad: La motilidad es positiva cuando la turbidez producida por el desarrollo de los
microorganismos se desplaza de la línea de siembra hacia el resto del medio.
Indol: Esta prueba es revelada en el medio SIM, al cual se le agregan tres gotas del reactivo de
Kovacs. Una reacción positiva se evidencia por la aparición de un anillo de color rojo en la
superficie debido a la formación de un complejo entre el p-dimetil amino benzaldehído y el indol
proveniente de la descomposición del triptofano por la enzima triptofanasa.

Composición:
Peptona de caseína.......................20,0g
Peptona de carne...........................6,6g
Citrato de amonio y hierro...............0,2g
Tiosulfato de sodio.........................0,2g
Agar................................................3,0g
Agua destilada............................1000ml
pH= 7,3

ROJO DE METILO-VOGES- PROSKAUER

Mediante este ensayo se detecta la presencia de productos de fermentación ácidos (rojo de metilo) o
neutros como la acetoína (Voges Proskauer). Sembrar en un tubo conteniendo caldo RMVP con el
cultivo puro de la cepa en estudio. Incubar 48 horas y fraccionar en dos tubos. Al primer tubo
añadirle 10 gotas de Rojo de metilo. La intensificación del rojo del indicador es una reacción
positiva. Al segundo tubo añadirle 10 gotas de hidróxido de sodio 0.1N y luego 10 gotas de alfa
naftol. Coloración roja indica reacción positiva.

Composición:
Peptona de carne......................... 7,0g
D(+) gucosa……………..................5.0g
Tampón de fosfatos........................5,0g
Agua destilada............................1000ml
pH: 6,9

CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido
de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica
que la prueba es positiva. Se colocan 2 o 3 gotas de agua oxigenada sobre un portaobjetos y sobre
ella se deposita una colonia del microorganismo en estudio. El resultado se considera positivo si se
observa la formación de burbujas.
Es útil para distinguir entre el género Streptococcus (catalasa negativo) del Staphylococcus (catalasa
positivo).

DNAsa AGAR
Medio de cultivo utilizado para la detección de enzimas desoxirribonucleasas, “DNAsa”. Es
especialmente útil para la diferenciación entre especies de estafilococos, permitiendo distinguir
Staphylococcus aureus (DNAsa positivo) del resto del género.
En el medio de cultivo, la tripteína es la fuente de nitrógeno, aminoácidos, y aporta los nutrientes
necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El ácido desoxirribonucleico (ADN), se
encuentra en grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa
(DNAsa), la cual lo hidroliza. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el
agente solidificante. Este medio de cultivo, permite diferenciar bacterias que poseen la enzima
desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen.
La presencia de la enzima, se puede detectar mediante el agregado de ácido clorhídrico 1N.
El ácido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia, mientras que el ácido
desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Tripteína 20.0 Suspender 42 gramos de polvo en 1 litro de agua
Acido desoxirribonucleico 2.0 destilada. Llevar a ebullición para disolución
Cloruro de sodio 5.0 completa. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.
Agar 15.0 Distribuir en placas de Petri estériles.
pH final: 7.3 ± 0.2

Siembra: A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar un inóculo denso en
estría.
Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C. Cubrir la placa con ácido clorhídrico
1N, y observar dentro de los primeros 5 minutos.

Resultado Positivo: halo claro, transparente alrededor del crecimiento bacteriano.

Resultado Negativo: el medio se observa opaco.

COAGULASA
Staphylococcus aureus se diferencia de otras especies de estafilococos por la presencia de la enzima
coagulasa. La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de
transformar el fibrinógeno en fibrina. La presencia de la enzima se evidencia en el tubo de ensayo
por la formación de un coágulo cuando se inocula plasma con colonias de estafilococos.

 Deje que el plasma se atempere a 25oC.

  Inocule con una colonia de estafilococo que haya crecido en medio no selectivo.
 Incube a 37oC durante 2 h y observe la formación del coágulo cada hora. No agite el tubo
durante las observaciones, debe inclinarlo.

Resultado Positivo: formación de coágulo

Resultado Negativo: No hay formación de coágulo