BIOQUIMICA DE PROTEINAS-UNSAM

PLEGADO DE PROTEINAS

Julio Caramelo
Laboratorio de Biología Estructural y Celular
Fundación Instituto Leloir
jcaramelo@leloir.org.ar
BIBLIOGRAFIA:
1) Fersht, A. Structure and mechanism in protein science (1999)
Freeman Press.
Capitulos 1, 11, 17 y 18
2) Advances in Protein Chemistry (1995) Vol. 46.
Capitulo 3 (Free energy balance in protein folding)
3) Branden y Tooze. Introduction to Protein Structure (1999)
Garland Publishing, Inc.
4) Whitford, D. Proteins. Structure and function (2005)
Editorial John Wiley & Sons
5) Berg, Tymoczko y Stryer. Biochemistry (2006)
Editorial Freeman and Company
 ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
Biología Estructural: ciencia que estudia la estructura y
función de las biomoléculas.

Biología

Biología Estructural

Física Química
 UNION PEPTÍDICA

H R1
H R1 H R2 H
H
HN+ C N
3HN
+
COO- 3HN
+
COO-
3 + H2O
R2
O
COO-
 Reacción endotérmica: H > 0
 Las proteínas son químicamente metaestables respecto de la hidrólisis

TYR THR

N-terminal C-terminal

ALA

LYS
 1.33 Å (unión simple C-N: 1.45 Å)
H R1
Las longitudes de enlace
H
no son las esperadas: H
H3 N+ C N
R2
O
COO-

1.23 Å (más largo que un carbonilo típico)

H R1

H
C H
La unión peptídica es plana: Estos 6 átomos está en un plano
H3N+ C N
C R2
O
COO-

H R1 H R1
H H
La unión peptídica tiene H H
carácter de doble enlace: H3N+ C N H3 N+ C N
R2 + R2
O - O
COO- COO-
 En la cadena solo dos enlaces pueden rotar:

H R1 R2 H H R3

H H C
C C
H3 N+ C N C N COO-
phi psi
O  O
C-CO
C-N
 Ci C

¿Qué es un ángulo diédrico?

N

Ci+1

La unión peptídica presenta solo dos posibles ángulos diédricos:

Trans: = 180  Cis: = 0 

Ci
H R1 H R1 H R2 Ci+1 Ci
H
H C
N C
3HN N
+
C 3HN
+
C N COO-
R2 N
O O H
COO- Ci+1

Por lo general la unión peptídica presenta configuración trans.

Repulsión de las cadenas laterales (en dipéptidos la forma trans es 1000
veces más abundante que la cis)
El trazado de la cadena se puede hacer sabiendo tres ángulos
diédricos para cada aminoácido

H R1
H
H  H

C N
 H 3 HN+ C N
R2
R2 O
C H
O
 C H O N
O N H

COO- R3

H R1
H
H R1 H
H 3 HN+ C N
H R2
3HN
+
C N O
C H
R2
O  O N
C H  H
O N
H COO- R3

COO- R3
Podemos graficar los pares de ángulos , de las proteínas que están cristalizadas
Gráfico de Ramachandran

Hoja   : entre - 80° y - 120° α-helices : entre -40° y ~ -100°

Ψ: entre 120° y 170° Ψ: entre -40° y -65°

Zona desfavorable
 La glicina posee una gran libertad conformacional:
Cisteína puede formar puentes disulfuro:
CISTEINA CISTINA

- -
+

+
2 + ½ O2 + H2O

+
-
-OOC +NH
3

SH
H
H
2 S S + 2 H+ + 2 e -
3 HN+ COO- H

3HN
+
COO-
(OJO, esto es una reacción redox, NO una ácido/base)
¿Cómo se pliega una proteína que puede formar varios puentes disulfuro?

Supongamos que tenemos una proteína con 3 cisteínas:

SH S-S (1-2)
SH
1 2
3 S
S SH
SH

SH S-S (2-3)

NATIVA E0S-S(2-3)  E0S-S(2-3), E0S-S(2-

SH
S S 3)

S S

S-S (1-3)

…Y A MEDIDA QUE AUMENTA EL NUMERO DE CYS LA PROBABILIDAD DE

FORMAR LA COMBINACION ADECUADA DE PUENTES S-S ES MENOR.
 Prácticamente todas las uniones peptídicas son trans.
 Repulsión estérica de las cadenas laterales.

Prolina: excepción

Ribonucleasa: tiene 4 Prolinas LYS41-PRO42

trans

ASN113-PRO114 TYR92-PRO93 VAL116-PRO117

cis cis trans

 ¿Porqué la prolina presenta más uniones cis que los demás aminoácidos?

aa  PRO PRO
Ea ~ 80-100 kJ/mol
E E
t1/2 ~ 10-100 seg
¡ LENTO !
cis

cis
trans trans

~ 7% uniones X-PRO
43 % de las proteínas al
menos tienen una cis PRO
En la unión X-Pro la
diferencia energética
entre cis y trans es
menor

C C C+1
C N C N
O C+1
O
trans cis

¿Tiene alguna consecuencia?

SI. Retarda mucho la velocidad de plegamiento.
In vitro una proteína con una unión cis-PRO por presenta al menos
dos fases cinéticas de pegamiento
 Estructura terciaria
Son las biomoléculas que presentan mayor variación estructural

barnasa colicina

fosfatasa

anticuerpo

colágeno hemaglutinina

calnexina porina Virus del dengue

 ¿Tienen algo en común todas estas estructuras?

Rojo: hidrofílico
Amarillo: hidrofóbico
Naranja: P, G, H
Estructura terciaria: disposición espacial de los residuos
(si uno conoce la estructura terciaria con una resolución menor a 4-5 Å
también sabe la secundaria)
 AL PLEGARSE UNA PROTEINA LOS RESIDUOS OCULTAN UNA
PROPORCIÓN DIFERENTE DE SU SUPERFICIE:
hidrofílicos

Área del residuo

aislado hidrofóbicos

Área oculta al
plegarse la proteína
 Plegado

N U

Proteína nativa Proteína desnaturalizada

Conjunto discreto de confórmeros Colección heterogénea de conformaciones
muy parecidos entre sí. con grado variable de compactación.
Rápida velocidad de interconversión
  ¿Qué determina la estructura terciaria de una proteína?
 ¿Existe un “código de plegado”?

C26-C84
C58-C110

C64-C72

Christian Anfinsen C40-C95

Premio Nobel de Química 1972
Ribonucleasa A (pdb: 1AFK)
 Experimento de Anfinsen:

H2 Betamercaptoetanol
HO C
C SH
H2
S SH

S SH
H2 H2
HO C C OH
C S S C
H2 H2

HS
SH
26 72 65 26 72 65
HS Diálisis
O2
84 HS 84
95 HS HS 95
40 110 40 110
Urea 8 M SH
58 Betamercaptoetanol SH 58

Actividad NO hay actividad Actividad

enzimática enzimática enzimática
 Conclusiones de Anfinsen:
 La información necesaria para especificar la estructura está en la
secuencia (las chaperonas complicaron un poco, pero se sigue manteniendo)
 “Hipótesis termodinámica”: el estado nativo es la conformación de mínima
energía libre (hay que considerar todo: solvente, ligandos, etc…)

Confórmero
Confomación nativa

 En principio se podría calcular cual es la conformación de mínima energía.

Hay dos problemas:
 No conocemos la función potencial con suficiente precisión
 El número de conformaciones posibles es MUY grande
 Las predicciones con proteínas chicas están dando cada vez mejor
 Desplegado de una proteína

N U
El estado nativo es estable en un rango muy reducido de condiciones
(temperatura, pH, co-solventes)

¿Como desnaturalizamos una proteína?

 Aumento de temperatura (desnaturalización térmica)
 Cambios de pH
 Agentes químicos: O NH2
+ Cl-
C C
H2 N NH2 H2N NH2
UREA Cloruro de guanidinio

 Disminución de temperatura (suena raro, pero pasa)

Le estabilidad de una proteína se mide con el G de unfolding:
G G

U
UREA
N N
U

Coordenada de plegamiento Coordenada de plegamiento

G N < GU G N > GU
GU = GU – GN > 0 GU = GU – GN < 0

GU
GN

[UREA]
  La desnaturalización es un proceso cooperativo:

[D]
Ku =
[N]
[D]
Fracción desnaturalizada: fu =
[N] + [D]

N U Fracción nativa: fn =
[N]
[N] + [D]

fu fu
fu + fn = 1 Ku = =
fn 1 - fu

En [UREA]50:
GU
fu = fn = 0.5
fu
[N] = [U] GN

Ku = 1
GU = -RT ln(Ku) = 0
[UREA]50
[UREA]50
GU = 0
0 [UREA] 8
 Químicamente una proteína es una entidad metaestable (hidrólisis)
 Se puede usar el formalismo de la termodinámica de sistemas en equilibrio

¿Qué significa que una mutación desestabiliza un proteína?

Silvestre Mutante
N U N* U*
K folding = Kf = [N] / [U] K* folding = Kf* = [N*] / [U*]
K unfolding = Ku = [U] / [N] K* unfolding = Ku* = [U*] / [N*]
Gu = -RTln(Ku) Gu* = -RTln(Ku*)

G G

Gu‡ N* Gu*
U U*
Gu

N
Coordenada de plegamiento Coordenada de plegamiento
En el estado nativo de una proteína se forman cientos interacciones

¿Cuan estable es el plegado de una proteínas?

Los Gu típicamente caen en el rango de 20-60 kJ/mol

 Esto es muy bajo !!! Del orden de 3 a 10 puentes hidrógeno

 El estado nativo es marginalmente estable

¿Como puede ser?

Durante el plegado hay que tomar en cuenta TODAS las interacciones:

 Proteína – proteína (p-p)

 Proteína – solvente (p-s)
 Solvente – solvente (s-s)

Y debemos tener en cuenta las contribuciones entálpicas y entrópicas al G

 Se forman:  intracatenarias (Hp-p < 0)
 entre moléculas de solvente (Hs-s < 0)
ENTALPIA: H

Se rompen:  proteína-solvente (Hp-s > 0)

Valores enormes (varios miles de kJ/mol), pero similares en magnitud y

de signo opuesto.
Los grupos que forman puentes hidrógeno intracatenarios en el estado N
se encontraban formando puentes hidrógeno con el solvente en el estado
U. El balance entálpico es ligeramente favorable.

Disminución de la movilidad de la cadena (Sp < 0)

ENTROPIA: S
Liberación de moléculas de solvente (Ss > 0)
 ¿Por qué una proteína se pliega?
Por el mismo motivo que se forma una micela o una bicapa lipídica
Porque está rodeada de agua
Si sumergimos una proteína en solvente orgánico lo más probable es que se desnaturalice

Polar
No lineal
¿Por qué los compuestos no polares son hidrofóbicos?

?
 EFECTO HIDROFOBICO
 La interpretación ha generado fuertes controversias.
Veamos la interpretación clásica:
 La presencia de una superficie no polar impide que las moléculas de agua
formen todos los puentes hidrógenos
 El solvente se orientan formando clatratos ordenados (“icebergs”)
 Costo entrópico muy alto
 Al plegarse una proteína disminuye el área hidrofóbica expuesta, se liberan
moléculas de agua. El aumento de entropía del solvente compensa por la pérdida
de entropía al disminuir la movilidad la cadena

Acido graso en agua

Cluster de agua
fluctuantes en el
seno del solvente

Moléculas de agua altamente

ordenadas formando una “jaula”
que rodea la cadena alquílica
Formación de bicapas y micelas

Disminuye el área hidrofóbica expuesta.

El número de agua forzadas a ordenarse
disminuye. Aumenta la entropía
 Una proteína en su estado nativo es como una micela muy venida a más.
 Al formarse el core hidrofóbico disminuye la superficie accesible al
solvente (ASA), liberándo moléculas de agua

- +
HO OH

Folding: -
ASA < 0 -
+ OH OH + +
- - + + - -
- OH OH +
HO

- OH
-
+

 El cambio de ASA (ASA) en el plegamiento explica porqué la capacidad

calorífica del estado desplegado es mayor que la del estado nativo (CpU >
CpN). En unfolding: Cp = (CpU – CpN) es positivo
 Por esto las proteínas se pueden desnaturalizar a bajas temperaturas
(“cold denaturation”)
 ¿Cómo medimos Gu?

∆GN-U = -RT ln (KN-U) = -RT ln ([U]/[N])

 Debemos cuantificar [U] y [N]

 Usamos algún método que los diferencie:

1) Absorbancia
2) Fluorescencia
3) Dicroismo circular
PARA PODER RACIONALIZAR EL EFECTO DE UNA MUTACION HAY
QUE VER COMO CAMBIA LA ESTABILIDAD RELATIVA DE N Y D

EJEMPLOS:

1) GLICINA: EN GENERAL DISMINUYE LA ESTABILIDAD ¿PORQUE?

AUMENTA LA ENTROPIA DEL ESTADO D (ver Ramachandran)

2) PUENTES S-S: EN GENERAL AUMENTAN LA ESTABILIDAD ¿PORQUE?

DISMINUYE LA ENTROPIA DEL ESTADO D

CADA PUENTE PUEDEN CONTRIBUIR HASTA 4 kcal/mol
 Se puede jugar mucho más con los loops y residuos
expuestos que con el “core” hidrofóbico.

En el caso de mutar residuos del core, se tolera la generacion

de cavidades (ej ILE -> ALA), pero muy difícilmente lo inverso
(ALA -> ILE)

¿PORQUE?

El grado de empaquetamiento del core es muy alto, similar a

un cristal orgánico. Muy probablemente se generen choques.
¿COMO PODRIAN EVITAR ESTO?

Realizando dos cambios que se compensen

 Caminos de plegado y paisajes de energía
Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar.
¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”?
Apliquemos el método inductivo:
 La mayor parte de las proteínas que conocemos adoptan una conformación
nativa, entonces nuestra proteína debería plegarse correctamente.
¿Vale este razonamiento?
 Las proteínas que hay en la naturaleza ¿Son una muestra representativa?

¿Cuántas posibles proteínas de 100 residuos se podrían hacer ?

20100 = 1.3 x 10130
(número de protones y neutrones del universo 1076)

¿Cuántas proteínas hay en la naturaleza?

Supongamos 10.000 x 106 especies y que cada genoma codifica para
30.000 genes (exageración supina).
Entonces tendríamos 3 x 1020 proteínas
(muchas están repetidas).
 Secuencias posibles= 1.3 x10130
Secuencias en la naturaleza: como mucho 3 x 1020

Por cada secuencia seleccionada por la evolución hay 4.3 x 10109 secuencias
que no aparecieron

Volvamos a nuestra pregunta inicial:

Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar.
¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”?

En principio no podemos decir nada.

Seguro que luego de miles de millones de años de evolución nos llegó un
muestreo ínfimo de todas las proteínas posibles.

¿Cuáles fueron las proteínas que nos llegaron?

¡¡¡Casualmente aquellas que se plegaron correctamente!!!

 Las proteínas que SI nos llegaron, ¿siguen un camino al “azar” al plegarse?
Azar: la cadena va probando todas las conformaciones hasta llegar a N

¿Cuánto tiempo demandaría este proceso?

 Imaginemos que cada aminoácido puede adoptar tres conformaciones posibles
(,  y L)

 Cada conformación se puede interconvertir en 1 ps (10-12 seg)

 Una cadena de 100 residuos puede adoptar 3100 = 5.2 x 1047 conformaciones

EXPLORAR TODAS LAS CONFORMACIONES REQUERIRIA:

10-12 seg * 5.2 1047 = 5.2 1035 seg (1.7 1028 AÑOS !)

(si supemos que en cada paso de busqueda los 100 residuos cambian, tardaría 1.7 1026 años)

PERO, LA MAYOR PARTE SE PLIEGA EN 0.1 - 1000 seg !!!

PARADOJA DE LEVINTHAL (1968)

 Entonces ¿Es el plegado un proceso al azar?

NO
¿COMO PUEDE SER?

 No hace una busqueda al azar de la conformación de mínima G.

 Necesariamente deben existir “caminos” favorecidos que restrigen la
búsqueda.
 La evolución cumplió un papel fundamental.
 Se seleccionaron aquellas secuencias cuya velocidad de plegado es
compatible con la vida.
 Caminos de plegado
Imaginemos que tenemos dos proteinas con los estos espacios conformacionales:

U
G U G

N N

coordenada coordenada

¿Cuál creen que se pliega con más eficiencia?

En el primer caso el plegado se verá “fustrado” mucho más

veces (trampas cinéticas)
La evolución seleccionó aquellas secuencias que presentan
espacios conformacionales “lisos”, con pocos mínimos locales.
 Tres modelos de plegado proteico

I I I

Difusión-condensación Colapso-hidrofóbico
1) Estructura 2ria 1) Aglutinación del core
2) Chocan entre si para N hidrofóbico
formar la 3ria 2) La 3ria se propaga
Ejemplo: barnasa desde allí

Nucleación-condensación
1) Un elemento de
estructura 2ria
2) La 3ria se propaga
desde allí
Ejemplo: CI2
El embudo de plegado (“folding funnel”)

El mecanismo de plegado no es

análogo a una reacción de moléculas
chicas (pocos enlaces de alta energía).

 Es una búsqueda sesgada en una

superficie de energía chata (muchas
conformaciones con energía similar).

 Superficie característica de un
número muy grande de interacciones de
baja energía.
 Análisis de la superficie de energía libre

Lenta
“Chiche bombón” No tan mala

“Lenta y peligrosa” “¿ Funcional ?”

El sesgo proviene porque en promedio aquellas conformaciones que
presentan más contactos “nativos” entre residuos son más
estables.

¿Como “sabe” la proteína que un contacto es “correcto”?

No lo sabe. Aquellas estructuras que no presentaban este

comportamiento no fueron seleccionadas.

¿Que ocurriría si sintetizamos una proteína con una secuencia

cualquiera? Que no fue “filtrada” por millones de años de
evolución. ¿Se plegaría con una estructura “única”?
Lo más probable es que no se pliegue.
Un mono secretario…
 DESNATURALIZACION POR AGENTES QUIMICOS
UREA o GUANIDINIO:
 ALTERAN LA ESTRUCTURA DEL AGUA

 INTERACCIONAN CON GRUPOS DE LA PROTEINA ( aromáticos, amidas)

G DE TRANSFERENCIA DE UN AMINOACIDO DESDE AGUA A UNA SOLUCION
DE DESNATURALIZANTE ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE
DESNATURALIZANTE
COMO EL ESTADO D ES MAS EXPUESTO QUE EL N, ENTONCES D ES
ESTABILIZADO POR EL DESNATURALIZANTE

GD-N = GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]

0.8 O NH2+
C C
0.6
fu

0.4 H2N NH2 H2N NH2

0.2
UREA GUANIDINIO
0
0 2 4 6 8
[UREA]
 DIFERENCIAS DE ESTABILIDAD

> estabilidad

GD-N = GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]

m: medida de ASA (superficie accesible al solvente) durante el desplegado

ASA

m
 Transiciones de dos estados

La transición medida por diversas técnicas debe ser idéntica (UV, fluorescencia, CD, etc)
Idealmente debería haber puntos isosbésticos e isodicroicos (¿PORQUE?)

G = 0 nearUV CD
TRP
G señal
D
farUV CD
N
[desnaturalizante]

nearUV CD
[desnaturalizante] TRP
señal ¿Qué ocurrió acá?

D N
farUV CD
N D
[desnaturalizante]
¿Cómo seguimos el desplegado de una proteína?

Gel con gradiente de urea:

N U

Migración

 tamaño

0 M UREA 8 M
Dicroísmo circular (CD)
Espectroscopía de fluorescencia

Desplegada EX 292

nm

Desplegada EX 275 nm

Nativa EX 292 nm

Casi siempre el espectro de U aparece

corrido hacia el rojo
La intensidad puede aumentar o disminuir
 Atrapado de intermediarios de plegamiento ligados por puentes disulfuro:

La proteína completamente desplegada y reducida se vuelve a plegar si

se elimina el desnaturalizante y los puentes disulfuro se forman por
oxidación con O2.
 Se pueden atrapar los intermediarios con diferentes puentes disulfuro
ya formados, de dos maneras principales: bajando el pH o por
modificación covalente (Iodoacetato):

SH SH SH SCH2COO-
SH SCH2COO-
O2 ICH2COO-

HS SH
S-S S-S

 Una de las pocas técnicas para ver folding in vivo

Inhibidor de tripsina de páncreas bovino (BPTI)
 ¿COMO CALCULAMOS GD-N?
Partimos de una señal espectroscópica a distintas
F [UREA].
Mezcla de las señales de N y D, pesadas por su
 [UREA]
concentración:
S =SN fN + SD fD = SN (1-fD) + SU fD
Con esto podemos calcular fU:
Long. Onda (nm) fD = (S – SN) / (SD-SN)
El cual se relaciona con KD-N = [D]/[N] = fD / (1-fD)
Podemos calcular KD-N para cada [UREA]

1 ¿Por qué KD-N depende de urea?

0.8
¿Cómo calculamos KD-N en ausencia de urea?
0.6
fu

0.4

0.2 Con KD-N podemos calcular GD-N para cada [UREA] y

0 podemos extrapolar los valores en ausencia de urea:
0 2 4 6 8
[UREA]

GD-N = GD-N(H2O) + m [UREA]

Para el caso de oligómeros la curva depende de la concentración total de proteína
¿Porqué?
GD-N
GD-N = G1 + G2

G1 G2
La posición del equilibrio
depende de [PROT], por el
principio de Le Chatellier

En las curvas de desnaturalización pueden observarse dos

tipos de comportamiento:
fD fD

 [PROT]
 [PROT]

[Desnaturalizante] [Desnaturalizante]

¿Cómo están acopladas las estructuras

terciaria y cuaternaria en cada caso?
 La presencia de un ligando aumenta la estabilidad:

Ejemplo: calreticulina  Ca2+  Glc1Man9GlcNAc2

> Glc1Man9GlcNAc2 > [Calcio]

Estabilidad térmica
> Glc1Man9GlcNAc2
seguida por far-UV

Glc1Man9GlcNAc2

calcio
Fluorescencia de TRP:

> [Calcio]
+ Glc1Man9GlcNAc2

+ Glc1Man9GlcNAc2 + Glc1Man9GlcNAc2

GD-N

GD-N = G1 + G2

G1 G2 Binding Unfolding
Denaturalización de proteínas oligoméricas:

SOYBEAN AGGLUTININ (SBA)

 Tratamiento de SBA con urea
(en presencia de EDTA)

TRP
TRP ANS

ANS SEC
SEC
CD UV lejano CD UV cercano

2 TRANSICIONES

ANS
La desnaturalización de una proteína oligomérica puede ser más de 1 estado:

Terciaria

La detección del monómero va a depender del grado de cooperación

entre estructura terciaria y cuaternaria

fu fu

Urea Urea
  La posición de equilibrio de una proteína
oligomérica depende de la concentración total de
proteína:

fu fu

> concentración
> concentración

Urea Urea
 PLEGADO IN VIVO DE PROTEINAS

A1) Problemas a resolver:  interacciones hidrofóbicas

 puentes disulfuro
 isomerización de prolinas
 adquisición de la estructura cuaternaria
 traslocación de membranas

A2) Familias de chaperonas:  HSP70

 HSP40
 HSP60
 HSP10
 HSP90
 small HSP (sHSP)
 HSP100
 CRT/CNX
 PPIases
 PDI
 chaperonas intramoleculares
A3) Acción secuencial de chaperonas
PROBLEMAS A RESOLVER: INTERACCIONES HIDROFOBICAS

- +
ESTRUCTURA 3D MUY HO OH
BASICA DE UNA
PROTEINA -
-
+
+
UNA MICELA VENIDA HO
MUY A MAS - -
OH
+

PROBLEMA:
 SINTESIS PROTEICA Y TRASLOCACION DE MEMBRANAS ES
LINEAL
LOS RESIDUOS HIDROFÓBICOS INTERACTUAN
INESPECIFICAMENTE
 LA VELOCIDAD DE SINTESIS MUCHAS VECES ES MENOR QUE
EL TIEMPO PARA EL PLEGAMIENTO
+ OH - OH+
- -+ - OH + - OH
PROBLEMAS A RESOLVER: PUENTES DISULFURO

SH S-S (1-
SH
2)
1 2
3 S
S SH
SH

SH S-S (2-
3)
NATIVA E0S-S(2-3)  E0S-S(2-3),
SH E0S-S(2-3)
S S

S S

S-S (1-
3)
PROBLEMAS A RESOLVER: ISOMERIZACION DE PROLINAS

TRANS

CIS
 PROBLEMA ADICIONAL
EL MEDIO INTRACELULAR TIENE UNA
CONCENTRACION ESCANDALOSAMENTE
ALTA DE PROTEINAS !!!

E.coli ~ 150 mg/ml

Célula de mamífero ~ 180 mg/ml

PREVENIR LA SEGURA AGREGACION DE

PROTEINAS, SU CORRECTO PLEGADO Y
ENSAMBLADO

CHAPERONAS
PLEGAMIENTO IN VIVO DE PROTEINAS

 Secundaria
 Terciaria
“VIA TERMODINAMICA”
 Cuaternaria
 Puentes disulfuro
 Isomerizacion de prolinas
 Modificaciones postraduccionales

“VIA CINETICA”

Reacción de molecularidad alta.

Velocidad muy dependiente de
concentración
CHAPERONAS: proteínas que ayudan a otros polipéptidos a adquirir la
conformación apropiada o la localización celular adecuada sin formar
parte de la estructura final.
CLASIFICACION FUNCIONAL:
1) INTERACCIONAN CON RESIDUOS HIDROFOBICOS (previniendo agregación
inespecífica durante la síntesis y la traslocación de membranas):
 HSP70 (DnaK)
 HSP40 (DnaJ)
 HSP60 (GroEL)
 HSP10 (GroES)
 HSP90
 small HSP (sHSP)
 HSP100
 chaperonas intramoleculares

2) CATALIZAN LA CORRECTA FORMACION DE PUENTES DISULFURO:

 PDI: protein disulfuro isomerasas

3) CATALIZAN LA ISOMERIZACION DE PROLINAS:

 PPIases: peptidilprolil isomerasas

4) INTERACCIONAN CON HIDRATOS DE CARBONO (lectinas):

 CRT/CNX: calreticulina / calnexina
 CHAPERONAS

Algunas cosas generales:

 EN GENERAL NO ACELERAN LA VELOCIDAD DE PLEGADO. AUMENTAN

LA EFICIENCIA DEL PROCESO AL EVITAR LA AGREGACION
INESPECIFICA Y RESCATAR PROTEINAS QUE ENTRARON A VIAS
MUERTAS

 DURANTE EL PLEGADO IN VIVO SOLO UNA PEQUEÑA PROPORCION

DE UNA PROTEINA PARTICULAR INTERACCIONA CON LOS SISTEMAS
DE CHAPERONAS

 LAS PROTEINAS PUEDEN SEGUIR MAS DE UNA VIA DE PLEGADO IN

VIVO. AL ELIMINARSE LA INTERACCION CON UNA CHAPERONA OTRAS
TOMAN SU LUGAR
 HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ)

 PRESENTES EN CITOSOL Y ORGANELAS

FUNCIONES:
 PARTICIPAN EN LA SINTESIS PROTEICA (previenen agregación,
ayudan en la adquisición de la estructura nativa, rompen agregados)
 TRANSLOCACION DE MEMBRANAS
 CONTROL DE PROTEINAS REGULATORIAS: receptores nucleares,
quinasas (Raf, eIF2-quinase), factores de transcripción (HSF, 32, etc)
 RECONOCEN SEGMENTOS HIDROFOBICOS DE PROTEINAS EN
CONFORMACIONES EXTENDIDAS.
 DnaK: HSP70 de E. coli (pdb: 2KHO)
 Forma unida a ADP o APO

Dominio N-terminal: Dominio C-terminal:

ATPasa Unión de péptidos
(forma cerrada)
HSP70 presenta dos conformaciones:
ABIERTA: en presencia de ATP, alta velocidad de entrada y salida del sustrato.
CERRADA: en presencia de ADP o sin nucleótido, entrada y salida lenta del sustrato.
 La unión del sustrato estimula la hidrólisis de ATP.
La clave es que la unión de ATP aporta la energía para romper los contactos entre la
chaperona y el sustrato mal plegado. Esto es algo general de todas las “holdasas”.

LA CHAPERONA LO UNICO QUE HACE ES UNIR Y SOLTAR EL SUSTRATO, en un

proceso acoplado a la hidrólisis de ATP.
NO PLIEGA A LA PROTEINA DE FORMA “ACTIVA”. La consecuencia principal de su
acción es evitar interacciones inespecíficas del sustrato con el entorno.
Recuerden que la agregación es MUY dependiente de la concentración de proteína libre.

Apo form ADP bound ATP bound

Entrada y salida
Entrada y salida rápida del sustrato
lenta del sustrato

Sustrato
 HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ) - GrpE

Dominio C-terminal
ATP
ADP bound cerrado Apo form ADP
Pi

1) Hidrólisis de ATP inducida por la

GrpE unión de sustrato
2) Cierre del dominio C-terminal
(sustrato atrapado)

1) Intercambio ADP por Unión del sustrato

ATP o unión de ATP
2) Apertura del dominio
C-terminal

HSP40
GrpE
1) Intercambio de ADP por ATP
Sustrato 2) Apertura del dominio C-terminal

Entrada y salida
del sustrato
HSP70: cambio conformacional desde la forma unida ATP hacia la forma
APO o unida a ADP, gatillado por la unión del sustrato.
MUY IMPRESIONANTE

ATP bound APO or ADP bound

HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES)
(CHAPERONINAS)

Presente en Eubacteria, Cloroplasto y

Mitocondria.
Dominio apical: expone parches
hidrofobicos
Reconoce preferentemente
intermediarios avanzados de
plegamiento
En E. coli aprox. 10-15 % de las
proteinas sintetizadas inteactua con
GroEL-GroES.
 HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES)
CICLO CATALITICO
7 ADP

: unfolded
: folded protein
protein

7 ATP

ADP ADP ATP ATP ADP ADP ATP ATP

7 ATP

7 ADP

UNION DEL ENCAPSULAMIENT UNION DEL LIBERACION DE LA

O DEL
POLIPEPTIDO POLIPEPTIDO CAVIDAD CIS
POLIPEPTIDO TRANS

Dominio apical: expone parches hidrofóbicos. Luego de unirse el sustrato y GroES

este dominio gira 90 grados y se ocultan los residuos hidrofóbicos. Se genera una
cavidad hidrofílica (caja de Anfinsen) capaz de contener ligandos de hasta 60 kDa.
 La HSP60 son un poco más vivas en las 70s:

Superficie más
hidrofílica

Superficie más
hidrofóbica
 ¿De qué forma las HSP60 (llamadas chaperoninas) ayudan al plegado?

 Aislan al sustrato: evitan agregación

 Despliegan al sustrato (¿?): rompiendo estructuras mal plegadas que cayeron

en mínimos locales de energía. Esto puede darse de forma pasiva o activa (¿?)

 Confinan al sustrato: restringiendo su libertad conformacional, y por ende el

número de estados que puede explorar (disminuyen la entropía (ln ) del estado
desplegado).
 FORMACION DE PUENTES DISULFURO: PDI
MAQUINARIA DE RECICLADO

PDI PDI PDI CITOSOL:

S S
[GSH] : [GSSG] = 30:1 A 100:
S SH SH SH

SH SH S SH S S
RETICULO ENDOPLASMICO:
[GSH] : [GSSG] = 1:1 A 1:3
PROTEÍNA PROTEÍNA PROTEÍNA

LA PDI “NO SABE” SI UN PUENTE

DISULFURO ES CORRECTO. HAY U
JUEGO ENTRE ESTABILIDAD Y
CINETICA.
Las PDIs cumplen varias funciones:
HS
S
E HS S
S
HS

OXIDO-REDUCCION SH HS OXIDO-REDUCCION
E
S S S
HS

S
SH HS
SH
E S S E S
SH SH S
HS ISOMERIZACION S

Y están altamente especializadas a determinados sustratos.

En el RE hay unas 18 PDIs distintas.
 7 7 7 7 PROTEASOMA

2.5 Mda, PORO INTERNO 5 nm

26S: 20S (CATALITICA) + 19S (REGULATORIA)
UBICUO Y ESENCIAL EN EUCARIOTAS. UBICUO Y NO ESENCIAL EN
ARQUEA. RARO Y NO ESENCIAL EN BACTERIAS
FUNCIONES: DEGRADACION DE PROTEINAS DAÑADAS O MAL PLEGADAS.
CONTROL DE LA VIDA MEDIA DE PROTEINAS REGULATORIAS (Péptidos para
MHC !!!)
 ES LA SUBUNIDAD CATALITICA. SE SINTETIZA CON UN
PROPEPTIDO QUE SE CLIVA AUTOCATALTICAMENTE EN PARALELO
CON EL ENSAMBLADO. ¿CUAL SERIA LA VENTAJA DE ESTO?

MECANISMO PROCESIVO. GENERA PEPTIDOS DE 6-10 RESIDUOS.

80-90% DE LA DEGRADACION PROTEICA ES VIA PROTEASOMA

¿CUAN GENERAL ES LA DEGRADACION PROTEICA?

DEPENDE DE CADA PROTEINA.
Ej.: CFTR MAS DEL 90 % SE DEGRADA VIA PROTEASOMA,
PARA EL CASO DE LA MUTANTEF508 LA PROPORCION ES
MUCHO MAYOR
 ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS
SINTESIS PROTEICA EN E. coli

TF: trigger factor.

Miembro de la
familia FBP
TF

Dna
DnaK J

+ GroEL
+ ATP
+ GroES
PROTEINA
NATIVA
 ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS
SINTESIS PROTEICA EN EUCARIOTES

Sis1
p

Ssb1p/ NAC
2p

Hdj1

+ TRiC
+ ATP

PROTEINA
NATIVA
 ¿Qué ocurre cuando una proteína no puede
plegarse correctamente y no es degradada?
ENFERMEDADES DE PLEGAMIENTO
MAL DE ALZHEIMER (2.000.000 EN USA)
MAL DE PARKINSON (500.000 EN USA)
ENFERMEDADES POR POLIGLUTAMINAS (HUNTINGTON, KENNEDY, ATAXIA, ETC)
MAL DE LA VACA LOCA (BSE)

OBSERVACION EN CEREBROS CON BSE:

DEPOSITOS FIBRILARES: AMILOIDES

 ENFERMEDADES DE PLEGADO
ENFERMEDAD
Alzheimer’s disease
Spongiform encephalopathies
Parkinson’s disease
Primary systemic amyloidosis
Secondary systemic amyloidosis
Fronto-temporal dementias
Senile systemic amyloidosis
Familial amyloid polyneuropathy I
Hereditary cerebral amyloid angiopathy
Haemodialysis-related amyloidosis
Familial amyloid polyneuropathy III
Finnish hereditary systemic amyloidosis
Type II diabetes
Medullary carcinoma of the thyroid
Atrial amyloidosis
Hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis
Injection-localised amyloidosis
Hereditary renal amyloidosis
Amyotrophic lateral sclerosis
Huntington’s disease
Spinal and bulbar muscular atrophy
Spinocerebellar ataxias
Spinocerebellar ataxia 17
COMPONENTE PRINCIPAL DEL AGREGADO
Aβ peptides (plaques); tau protein (tangles)
Prion (whole or fragments)
α-synuclein (wt or mutant)
Ig light chains (whole or fragments)
Serum amyloid A (whole or 76-residue fragment)
Tau (wt or mutant)
Transthyretin (whole or fragments)
Transthyretin (over 45 mutants)
Cystatin C (minus a 10-residue fragment)
β2-microglobulin
Apolipoprotein AI (fragments)
Gelsolin (71 amino acid fragment)
Amylin (fragment)
Calcitonin (fragment)
Atrial natriuretic factor
Lysozyme (whole or fragments)
Insulin
Fibrinogen α-A chain, transthyretin, apolipoprotein AI, apolipoprotein AII,
lysozyme, gelsolin, cystatin C
Superoxide dismutase 1 (wt or mutant)
Huntingtin
Androgen receptor [whole or poly(Q) fragments]
Ataxins [whole or poly(Q) fragments]
TATA box-binding protein [whole or poly(Q) fragments]
¿ QUE OCURRE CUANDO UNA PROTEINA MAL PLEGADA
NO ES DEGRADADA ?
EJEMPLO: MAL DE LA VACA LOCA (BSE)

….en los 80s

CASOS BSE

40000

30000

20000

10000

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94
AÑO

CASOS vCJD

12
10
8

….y a mediados de los 90s 6

4
2
NUEVA VARIANTE DE LA ENFERMEDAD DE 0

95

96

97
CREUTZFELDT-JAKOB (vCJD) AÑO
 PRION (PrP)
• SE ENCUENTRA NORMALMENTE EN MUCHOS TEJIDOS
• FUNCION: DESCONOCIDA (!)
• LOCALIZACION: EN LA MEMBRANA CELULAR, DEL LADO EXTERNO

PROBLEMA: NO DA AMILOIDES !!!

 (SIN EMBARGO NO ES TAN SIMPLE)
LA DOBLE VIDA DE PrP
(“El extraño caso del Dr. Jekyll y Mr. Hyde” R.L. Stevenson)

PrPC PrPSc AMILOIDE

UN MODELO POSIBLE PARA LA GENERACION DE AMILOIDES

Stanley Prusiner
Premio Nobel de Medicina 1997
 MODELO DE PRUSINER

INFORMACION “NO
CONVERSION GENETICA”
INDUCCION
PrPC CONFORMACIONAL
PrPSc

INDUCCION PROPAGACION

AMILOIDE
 ¿PORQUE APARECIO LA vCJD AHORA?

¿ES NUEVA? SIMILAR AL KURU

GRUPO LINGUISTICO “FORE” DE PAPUA NUEVA GUINEA

POR CANIBALISMO

OVEJA VACA HUMANO

SCRAPIE (200 años)

CARNIVORA !!!
 ALGUNAS COSAS IMPORTANTES
EVOLUCION TEMPORAL DE LA FORMACION DE AGREGADOS:

AGREGACION
TIEMPO

SIEMBRA

FASE LAG FASE DE ELONGACION

CAMBIO
CONFORMACIONAL

LENTO
RAPIDO
Y EN BASE A ESTO PODEMOS ENTENDER ALGUNAS COSAS:

¿POR QUE MUTACIONES QUE DISMINUYE LA ESTABILIDAD DE UNA

PROTEINA PUEDEN FACILITAR LA FORMACION DE AMILOIDES? CJD

¿COMO SE PRODUJO LA vCJD?

Y ACA HAY DOS MODELOS CINETICOS MUY DIFICILES DE DISCRIMINAR:

 EFECTO “INDUCTIVO”

 EFECTO RESERVORIO

Ambos dan cinéticas similares

MAS COSAS IMPORTANTES:

EN PRINCIPIO LA FORMACION DE AMILOIDES ES UNA PROPIEDAD

INTRINSECA DE TODAS LAS PROTEÍNAS. ES UN PROCESO INEVITABLE
DADA LAS CARACTERISTICAS FISICAS Y QUIMICAS DE UNA CADENA DE
ALFA-AMINOACIDOS (Dobson)

SIMPLIFICANDO LAS COSAS: LAS CADENAS LATERALES CODIFICAN LA

INFORMACION PARA LA ESTRUCTURA TERCIARIA, Y EL BACKBONE
CODIFICA LA INFORMACION PARA AMILOIDES

 SI EN UN CULTIVO SE EXPRESA UNA PROTEINA QUE FORMA AMILOIDES

NO RELACIONADA A NINGUNA PATOLOGIA CONOCIDA, POR LO COMUN
RESULTA DELETEREA

 HAY UNA RELACION BASTANTE DIRECTA ENTRE ESTABILIDAD

CONFORMACIONAL Y TENDENCIA A FORMAR AMILOIDES
 ¿CUAL ES LA ESPECIE TOXICA?
EN UN PRINCIPIO SE CREYO QUE LA ESPECIE TOXICA ERAN LOS AMILOIDES. SIN EMBARGO LUEGO SE
VIO QUE NO HAY UNA CORRELACION ENTRE EL NIVE DE DAÑO CELULAR Y LA FORMACION DE AMILOIDES.

INTERMEDIARIOS
AVANZADOS

ENSAMBLADOS
GLOBULARES

(HSP´)

AGREGADOS
TEMPRANOS
EN FORMA
DE PORO

FIBRA MADURA

PORO DE
MEMBRANA
SI LAS ESPECIES TOXICAS SON LOS AGREGADOS PREVIOS AL AMILOIDE,
¿SE IMAGINAN QUE HUBIERA PASADO DE HABERSE APLICADO TERAPIAS
TENDIENTES A DESTRUIR LOS AMILOIDES?

DE HECHO HAY UN CONSENSO CADA VEZ MAYOR DE QUE EN ALGUNOS

CASOS LOS AMILOIDES SERIAN UNA FORMA DE RESPUESTA PROTECTIVA

¿PORQUE ES TOXICA?

ACA HAY DEMASIADAS TEORIAS Y POCAS RESPUESTAS:

1) POROS
2) TEORIA DE SECUESTRO
3) INHIBICION DEL PROTEASOMA
 CUERPOS DE INCLUSION (IB: INCLUSION BODIES)

Problema muy común al expresar proteínas recombinantes.

Al expresar proteínas humanas en E. coli:
- SOLUBLES: 15-20 %
- CUERPOS DE INCLUSION 20-40 %
- el resto no se expresa!!! (se degradan)

 Masas amorfas densamente empaquetadas, formadas por proteína

mal plegada (en general un 70 % o más corresponde a la proteína
recombinante, siendo el resto proteínas bacterianas).
 En E. coli se observa en general uno solo por célula, con un
tamaño en el orden de 0.2 a 1.5 m. Pueden llegar a
distorsionar la pared celular.

Maquinaria inadecuada o insuficiente de

¿Porqué chaperonas

se Falta de modificaciones postraduccionales (ej.

glicosilación)
forman?
Síntesis demasiado rápida para la cinética de
plegamiento de la proteína
¿Como lo evitamos?
 Bajar la temperatura (28ºC)
Usar niveles de expresión más bajos: menos inductor, medios de cultivo
menos ricos o cambio de vector.
A veces se puede co-expresar una chaperona ausente en el sistema
heterólogo

¿Se puede recuperar la proteína de un IB de forma funcional?

 Muchas veces sí:
1) Limpiar los IB (urea a baja cc, tritón X-100, NaCl, etc. Todo a
baja T). A veces se puede tener la proteína con una pureza mayor del
90 %.
2) Resuspenderlos (urea 6-8 M, guanidinio-HCl 6 M, con o sin DTT)
3) Plegar la proteína: -diálisis de a poco
-dilución brusca
-unida a una columna (ej. IMAC)
4) Caracterizar la proteína: dicroísmo far-UV y near-UV, actividad
biológica, etc
UNA VISION GOBAL DEL PLEGADO DE LAS PROTEINAS:

AGREGADO HETEROCOMPLEJO
DESORDENADO
(IB)

CRISTAL
INTERMEDIARIOS
OLIGOMERO
AVANZADOS NATIVA
SINTESIS INTERMEDIARIOS
TEMPRANOS

(HSP)

(HSP´)

DIMEROS
TRIMEROS
FIBRAS
AGREGADO
ORDENADO
DEGRADACION PREFIBRILAR
PROTEASOMAL

FIBRA
AMILOIDE