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Méthodes physiques d’analyses des produits pétroliers

I- Introduction
- L'analyse chimique comprend l'utilisation d'une instrumentation pour résoudre un problème analytique.

- L'utilisation de l'instrumentation est maintenant devenue une partie de l'analyse chimique et est appliquée pour
tous les domaines de la science pure et appliquée.

- Tout instrument unique ne pouvait pas résoudre le problème de l'analyse, à la place, plusieurs
techniques instrumentales sont nécessaires pour résoudre le maximum du problème.

- D'où l'instrumentation joue un rôle important dans la production et l'évaluation de nouveaux produits.

I.1. Principes de l'Instrumentation


- Dans l'analyse instrumentale, une propriété physique d'une substance est mesurée pour déterminer sa
composition chimique.

- L'analyse peut être biochimique, analytique, inorganique, organique et physique.

- Quel que soit le type d'analyse, l'objectif de l'analyse est de fournir des informations sur la composition
de l'échantillon.

- Ceci est appelé l'analyse quantitative. Cette analyse est effectuée à l'aide d'instruments. Le choix de
l'instrument dépend de la propriété mesurée.

- Le principe de base d'un instrument utilisé pour l'analyse chimique est le suivant : Il convertit
l'information chimique en une forme qui est observable. L'instrument contribue ainsi à :

- (1) Génération d'un signal

- (2) La transformation du signal à un autre de nature différente (transducteur)

- (3) L'amplification du signal.

- Cependant, toutes ces étapes ne sont pas incorporées dans tous les instruments.

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I.2. Classification des techniques instrumentales
Les techniques instrumentales peuvent être classées dans trois domaines principaux:

Spectroscopie, Electrochimie et chromatographie

En outre, l'utilisation de diverses techniques instrumentales est tabulée

En fonction de la nécessité de la méthode peut être sélectionnée.

Techniques spectroscopiques

· La spectrophotométrie de l'ultraviolet et du visible.

· La spectrophotométrie de fluorescence et de phosphorescence

· Spectrophotométrie Atomique (Emission et absorption)

· Spectrophotométrie infrarouge

· La spectroscopie Raman

· La spectroscopie des rayons X

Techniques électrochimiques

· Potentiométrie

· Conductimétrie

Les techniques chromatographiques

· Chromatographie en phase gazeuse (GC)

· Chromatographie sur couche mince (CCM)

· Liquide à haute performance Chromatographie (HPLC )

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I.3. Sélection de l'instrumentation

Selon la propriété à analyser, la méthode analytique pourrait être sélectionnée. Lors de la sélection du
procédé, la concentration de l'échantillon et de la précision nécessaire doit être pris en considération.

1.3.a. Concepts de l'analyse instrumentale :

Il est essentiel de comprendre les avantages et les limites de chaque Analyse instrumentale. Nous allons voir
certains d'entre eux.

1.3.b. Avantages de l'analyse instrumentale.

· Même petite quantité d'échantillons sera suffisant pour l'analyse.

· Les résultats obtenus sont fiables.

· Échantillons complexes peuvent également être analysés.

· Le taux de détermination est rapide.

1.3.c. Limites de l'analyse instrumentale.

· La précision et la sensibilité dépend de l'instrument. Elle varie avec l'instrument.

· Le coût de l'équipement est assez élevé.

· La gamme de concentration qui serait mesurée est limitée.

· Pour chaque instrument, la manipulation est suggéré seulement après la formation.

· L'espace approprié est nécessaire.

· Il doit y avoir aucune fluctuation de l'alimentation.

II- ASPECTS GENERAUX DE LA CHROMATOGRAPHIE

La Chromatographie, est le procédé par lequel les composants d'un mélange peuvent être séparés.

Elle est devenue l'une des méthodes analytiques primaires pour l'identification et la quantification des
composés à l'état gazeux ou liquide.

Son principe est basé sur l'équilibre de la concentration entre deux phases non miscibles. L'une est appelée
la phase stationnaire, parce qu'elle est immobilisée dans une colonne ou fixée sur un support, tandis que la
seconde, appelée la phase mobile.

Les phases sont choisies de telle sorte que les composants de l'échantillon analyser ont des solubilités
différentes dans chaque phase.

la migration différentiel des composés conduit à leur séparation.

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II.1 CONCEPTS GENERAUX DE LA CHROMATOGRAPHIE ANALYTIQUE

La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation des composants dans les mélanges,
liquides ou gazeux, Les applications de ce procédé sont par conséquent nombreux puisque la plupart des
mélanges hétérogènes, ou ceux sous forme solide, peut être dissous par un solvant approprié.

Un procédé chromatographique de base peut être décrit comme suit (Figure 1.1):

1. Un tube de verre vertical creux (colonne) est rempli d'une convenable poudre solide fine, C'est La phase
stationnaire.

2. Au sommet de cette colonne, est placé un petit volume du mélange d'échantillon à séparer en composants
individuels.

3. L'échantillon est ensuite repris par addition continue de la phase mobile, qui traverse la colonne par gravité,
portant les divers constituants du mélange avec elle. Ce processus est appelé élution. les composants migrent
à des vitesses différentes, et deviennent séparés les uns des autres et peuvent être récupérés, mélangés avec
la phase mobile.

II.2. LE PRINCIPE DE L'ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE.

Le chromatogramme, est le graphique essentiel de chaque analyse chromatographique, qui décrit le passage
des composants. On obtient à partir des variations, en fonction du temps, un signal électrique émis par le
détecteur. il est souvent reconstruit à partir des valeurs qui sont numérisées et stockées sur un micro-
ordinateur pour la reproduction dans un format approprié pour l'imprimante. A droite, un chromatogramme
illustrant la séparation d'un mélange d'au moins trois composants principaux.

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II.3.LE CHROMATOGRAMME

Le chromatogramme est la représentation de la variation, avec le temps (rarement en volume), de la quantité


du constituant a analyser dans la phase mobile sortant de la colonne de Chromatographie. La séparation est
terminée lorsque le chromatogramme montre autant de pics chromatographiques que les composants dans
mélange à analyser,

Un constituant est caractérisé par son tR temps de rétention, qui représente le temps écoulés depuis
l'introduction de l'échantillon à la détection du maximum de pic dans le chromatogramme. Dans le cas idéal,
tR est indépendant de la quantité injectée. Un constituant non retenue sera éluer de la colonne au moment
tM, appelé le temps de hold-up ou temps mort (désigné auparavant par t0).

La différence entre le temps de rétention et le temps de maintien est désignée par le temps de rétention
ajusté du composé, t’R.

II.4. coefficient de partition de Nernst (K)

Le paramètre physico-chimique fondamentale de la chromatographie est la constante d’équilibre K, appelée


coefficient de partage, Quantifie le rapport de la Concentration de chaque composé dans les deux phases.

K=

Les valeurs de K sont très variables puisqu'elles peuvent être élevées (par exemple 1000), lorsque la phase
mobile est un gaz ou petites (par exemple 2) lorsque les deux phases sont dans l'état condensé.

Chaque composé occupe seulement un espace limité sur la colonne, avec une concentration variable dans
chaque lieu, donc les valeurs réelles de CM et CS varient dans la Colonne, mais leur rapport est constant.

II.5. Chromatographie et thermodynamique : Les relations thermodynamiques peuvent être Appliquée aux
équilibres de distribution définis ci-dessus.

K,? CS / CM ?, l'équilibre Constante par rapport aux concentrations C du composé dans la phase mobile (M) et
la phase stationnaire (S) peuvent être calculés à partir d'expériences chromatographiques.

* Paramètres de rétention

Les temps et les volumes morts sont utilisés en Chromatographie à diverses fins, En particulier pour accéder au
facteur de rétention k. et aux paramètres thermodynamiques.

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* Temps de rétention

La définition des temps de rétention : du temps mort tM, du temps de rétention, tR et du Temps de retention
d’adjustement tR, ont été donnés précédemment.

II.6. Volume de rétention (ou le volume d'élution) VR

VR est le volume de rétention d'un analyte. Il représente le volume de la phase mobile nécessaire pour
permettre sa migration à travers la colonne à partir du moment d'entrée au moment où elle sort. Pour estimer
ce volume, différent méthodes (directes ou indirectes) peuvent être utilisées, qui dépendent de l'état physique
de la phase mobile. Sur un chromatogramme standard avec le temps en abscisse, VR est calculée à partir de
l'expression suivante, si le débit F est constant,

VR = tR.F

Volume mort VM

Le volume de la phase mobile dans la colonne (connue sous le nom de volume mort), VM correspond au
volume interstitiel accessible. Il est souvent calculée à partir du chromatogramme, Le volume mort est déduit
de tM et du débit F:

VM = tM.F

Facteur de Rétention (ou capacité) k

Lorsqu'un composé de masse totale mt est introduit dans la colonne, il se sépare

en deux quantités: Mm, la masse dans la phase mobile et mS, la masse dans

la phase stationnaire. Au cours de la migration du soluté dans la colonne, ces deux quantités restent
constantes. Leur rapport, appelé facteur de rétention k est constant et indépendant de mt :

k = MS/Mm = (CS.VS)/(Cm.Vm) = (CS/Cm).(VS/ Vm) = K.(VS/ Vm)

Le facteur de rétention, également connu comme le facteur de capacité k, est un parametre très important en
chromatographie pour définir les performances de la colonne.

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L'OPTIMISATION D'UNE ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE

La Chromatographie analytique est essentiellement utilisé dans l'analyse quantitative. pour y parvenir
efficacement. les aires sous les pics doivent être déterminés avec précision, ce qui nécessite des analytes a
analyser bien séparés.

? Dans la chromatographie en phase gazeuse, les séparations peuvent être si complexes qu'il peut être difficile
de déterminer à l'avance si la température doit être augmentée ou diminué. Le choix de la colonne, sa
longueur, son diamètre, la phase stationnaire la composition et le rapport de phase (VM / VS), ainsi que les
paramètres de séparation (Température et débit), sont parmi les facteurs qui interagissent les uns avec les
autres.

Application pour le calcul du coefficient d’absorption K:

Un mélange placé dans un Erlen meyer contient 6 ml de gel de silice et 40 ml d'un solvant contenant en
solution de 100 mg d'un composé non volatile.

Après agitation, le mélange a été laissé au repos, avant 10mL de la solution a été extraite et évaporée
jusqu'au sec. le résidu pesait 12 mg.

Calculer le coefficient d'absorption, K = CS / CM du composé en dans cette expérience.

On doit calculer la quantité du composé dans la phase mobile et dans la phase stationnaire :

A l'équilibre 40 ml d'éluant contient 12 x 40/10 = 48 mg de composé

Il y a donc 100-48 = 52mg en phase stationnaire.

Si K représente le rapport des masses présentes dans 1 ml de chaque phase équilibre,

alors K = (52/6) /(48/40) = 7/2.

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Chromatographie en phase gazeuse
La Chromatographie en phase gazeuse (GPC) est une technique largement utilisée, dont la première
application date de plus de 60 ans. Depuis lors, le développement a continué à faire le meilleur de la sensibilité
extrême, la polyvalence, les possibilités d'automatisation et la facilité avec laquelle de nouvelles analyses
peuvent être développées.

La séparation du composé qui est a l’état gazeux se produit au niveau de la colonne, les échantillons qu'ils
soient liquides ou solides doivent d'abord être vaporisés. Cela représente la plus grande contrainte de la
chromatographie en phase gazeuse, depuis son utilisation est limitée à l'étude des composés thermostables et
suffisamment volatils.

Toutefois, les applications de la CPG sont nombreuses et dans tous les domaines, le développement est en
haute vitesse. Sa très grande sensibilité permet de détecter des quantités de l'ordre du pictogramme pour
certains composés.

Composants d'une installation de CPG

Un chromatographe en phase gazeuse est constituée de plusieurs composants à l'intérieur d'un cadre spécial.

Ces composants comprennent l'injecteur, la colonne et le détecteur, associé avec un four à commande
thermostatique qui permet à la colonne d'atteindre des hautes températures.

La phase mobile qui transporte les analytes par la colonne est un gaz appelé gaz porteur.

Le flux de gaz porteur, qui est contrôlée avec précision, permet la reproductibilité des temps de rétention.

L'analyse commence quand une petite quantité d'échantillon est introduit sous forme liquide ou de gaz dans
l'injecteur, qui a la double fonction de vaporisation de l'échantillon et de le mélanger avec le flux gazeux à la
tête de la colonne. La colonne est habituellement un tube étroit qui est enroulé autour de lui-même avec une
longueur qui peut varier de 1 à plus de 100 m, en fonction du type et du contenu de la phase stationnaire.
La colonne, qui peut servir à des milliers d'injections successives, est logé dans un four thermostaté. A la fin de
la colonne, la phase mobile (Gaz porteur), passe à travers un détecteur avant sa sortie dans l'atmosphère.
Certains chromatographes modèles de taille réduite ont leur propre alimentation électrique. (voir Figure 2.19).

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N.B : Dans la CPG, il y a quatre paramètres opérationnels pour une phase stationnaire donnée: L, longueur
de la colonne, u, la vitesse de la phase mobile, T, la température de la colonne et le Rapport de phase, qui
affecte le facteur de rétention k. La condition de fonctionnement de la chromatographie permet des
modifications en termes de T et u ce qui affecte à la fois l'efficacité de la colonne et les facteurs de
rétention.
Gaz vecteur et régulation du débit
La phase mobile est un gaz (hélium, hydrogène ou azote), le gaz porteur doit être exempt de toute trace
d'hydrocarbures, de vapeur d'eau et d'oxygène, parce que tous ces éléments peuvent détériorer les phases
stationnaires polaires ou réduire la sensibilité des détecteurs. A cause de ces raisons, le système de gaz
porteur comprend des filtres contenant un tamis moléculaire pour éliminer l'eau et un agent réducteur pour
les autres impuretés.
La nature du gaz porteur n'a pas d'influence notable sur les valeurs Du coefficient de partition K du composé
entre la phase mobile et stationnaire, en raison de l'absence d'interaction entre le gaz et les solutés.
Par contre, la viscosité du gaz porteur et son débit ont un effet sur les analytes et par conséquent sur
l'efficacité et la sensibilité de la détection (figure ). L'hydrogène est le gaz vecteur de choix. Si ce gaz ne peut
pas être utilisé pour des raisons de sécurité, l'hélium peut le substitué.

‫ ويجب أن يكون الغاز الحامل خاليًا من أي أثر للهيدروكربونات‬، )‫الطور المتحرك هو عبارة عن غاز (الهليوم أو الهيدروجين أو النيتروجين‬
، ‫ بسبب هذه األسباب‬.‫ ألن كل هذه العناصر يمكن أن تلحق الضرر بالمراحل الثابتة القطبية أو تقلل حساسية المكاشيف‬، ‫وبخار الماء واألكسجين‬
‫يشتمل نظام الغاز الحامل على فالتر تحتوي على منخل جزيئي إلزالة الماء وعامل اختزال للشوائب األخرى‬.
‫ ال تؤثر طبيعة الغاز الحامل تأثيرا ً معنويا ً على قيم معامل الفصل‬K ‫ بسبب غياب التفاعل بين الغاز‬، ‫للمركب بين الطور المتحرك والثابت‬
‫والمذيبات‬.
‫ تؤثر لزوجة الغاز الحامل وتدفقه على التحليالت وبالتالي على كفاءة وحساسية الكشف‬، ‫( من ناحية أخرى‬FIG. ‫الهيدروجين هو الغاز الحامل‬
‫ فقد يتم استبدال الهيليوم‬، ‫ إذا لم يكن من الممكن استخدام هذا الغاز ألسباب تتعلق بالسالمة‬.‫المفضل‬.

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La pression à la tête de la colonne ( et de plusieurs dizaines à des centaines de kPa) est stabilisé
mécaniquement par un contrôle de pression électronique (EPC) afin que le débit reste constant à sa valeur
optimale.

Par conséquent, pour maintenir le débit de gaz porteur constant, la pression doit être finement réglée.
L'injecteur et le détecteur ont des volumes morts qui sont comptés dans le volume de rétention totale. étant
donné que la phase mobile est un gaz, le débit mesuré à la sortie de la colonne doit être corrigée par un
facteur J de compression, qui compense la pression plus élevée à la tête de la colonne

il est possible de calculer la vitesse linéaire moyenne de la progression, du gaz porteur u. ainsi par l'installation
d'un débitmètre à la sortie de l'instrument (Po pression atmosphérique ) et en connaissant le diamètre du la
colonne Uo vitesse du gaz porteur, à l'extrémité de la colonne, peut être déduite. Le rapport entre ces deux
vitesses est égale à J, le facteur de compression, qui est liée à la pression relative : ( P / P0 ) (P, la pression à la
tête de la colonne):

Introduction d'échantillons et chambre d'injection

Introduction Simple :

La méthode d'injection le plus courante est celle où une micro seringue est utilisée (Figure 2.3) afin d'injecter
une très petite quantité de l'échantillon dans une solution (par exemple 0,5 µL), à travers un caoutchouc
septum dans un port évaporateur instantané à la tête de la colonne.

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Seringues typiques utilisées en CPG. Plusieurs modèles existent adaptés aux différents types d’Injecteurs et
colonnes. Pour certains d'entre eux, (0,5 à 1µL), un plongeur, poussé par le piston, entre L'aiguille pour délivrer
l'ensemble de l'échantillon.

Injecteurs

L'injecteur, qui est l'entrée de l'échantillon vers le chromatographe, a différentes fonctions. Outre son rôle
d'entrée pour l'échantillon, il fait vaporiser, mélanger avec le gaz porteur et apporter l'échantillon à la tête de
la colonne. les caractéristiques des injecteurs, ainsi que les modes d'injection varient en fonction du type de
colonne. L'utilisation d'un système d'injection automatique peut améliorer considérablement la précision de la
mesure.

four à commande thermostatique

Le chromatographe à gaz comprend un four avec un volume suffisant pour contenir facilement une ou deux
colonnes et qui peut chauffer à plus de 400°C. (gradient capable d'atteindre 100°C / min). La température doit
être contrôlée à 0,1°C afin d'obtenir des séparations reproductibles. le four peut être régulée à basse
température.

Colonnes

Il existe deux types de colonnes, qui se distinguent par leurs performances: les colonnes à garnissage et les
colonnes capillaires.

Pour les colonnes à garnissage la phase stationnaire est déposée ou collée par réaction chimique sur un
support poreux.

Pour les colonnes capillaires une mince couche de phase stationnaire est déposée ou lié sur la surface
intérieure de la colonne.

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Colonnes capillaires (tubulaires ouvertes)

Ils sont généralement constitués de la silice fondue de pureté trés élevée. Le diamètre interne du tube utilisé
pour ces colonnes varie de 100 à 530 μm, son épaisseur est de 50 μm Et la longueur est de 12 à 100 m. Ils
peuvent être Enroulés autour d'un support circulaire métallique léger . Certains fabricants proposent des
colonnes fabriquées à partir d'un capillaire métallique aluminium,Nickel ou acier) qui tolère des températures
de fonctionnement élevées de l'ordre de 450 ° C, À condition que la phase stationnaire soit suffisamment
stable.

Phases stationnaires

Pour les colonnes remplies, les techniques d'imprégnation sont très simples, plus de 100 phases stationnaires
de divers types ont été proposés dans la littérature. . Les phases actuelles correspondent à deux familles: les
polysiloxanes et les polyéthylèneglycols. Les phases stationnaires décrites ci-dessous sont les types les plus
classiques, tandis que dans le catalogues, on trouve des phases stationnaires spécialement adaptées à des
applications particulières. Parmi ceux-ci les phases pour la séparation des produits du soufre, des pesticides
chlorés, les aldéhydes, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), etc.

polysiloxanes

Polysiloxanes (aussi connu comme les huiles de silicone et les gencives) il se compose de deux chaînes
d'hydrocarbure par atome de silicium (figure 2.9). Il y a environ 20 compositions différentes de chaînes alkyle
ou aryle. En raison de leur très large plage de température ces phases sont les plus largement utilisées.

phases stationnaires solides

Ces phases sont constituées à partir d'une variété de matériaux d'adsorbant: silice ou de l'alumine désactivé
par des sels minéraux, des tamis moléculaires, verre poreux, de graphite. Les colonnes capillaires réalisées par
dépôt de ces matériaux sous forme d'une couche poreuse fine. Ils sont employés pour séparer des échantillons
gazeux ou très volatils.

L'efficacité de ces colonnes est très élevée. le gel de silice, insensible à l'oxygène, était l'un des premiers
composés pour servir en tant que phase stationnaire solide pour colonnes GC. Aujourd'hui, les phases solides
sont devenues beaucoup plus élaborées.

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Pour comparer ou de prédire le comportement des colonnes capillaires, il est utile de calculer le rapport de
phase ß = VM / VS (Figure 2.13).appelant dc le diamètre interne de la colonne et df l'épaisseur du film déposé
sur sa surface interne, une calcul approximatif conduit à:

ß = ( Vm/Vs ) = dc/4df

Si les composés à séparer sont volatiles, une colonne avec un petit rapport de phase devraient être choisis ß
<100 et vice versa. Une colonne de 320 µm avec une phase stationnaire de 0.2 µm, ß = 310 appelant K = kß il
apparaît que k, pour un composé donné et une phase stationnaire donné, va augmenter si ß diminue.

k = ts/tm = tr-tm/tm

Principaux détecteurs de chromatographie en phase gazeuse


Certains détecteurs sont universels; parce qu'ils sont sensibles à la quasi-totalité du composé élue de la
colonne. D'autre part, il y a des détecteurs (sélectifs) qui sont sensibles uniquement à des composés
spécifiques, ce qui donne un chromatogramme très simple.
Les détecteurs sont classés en deux groupes selon qu'ils conduisent seulement à une seule des informations
telles que le temps de rétention et ceux qui produisent, en plus du temps de rétention, l'information
structurelle de l'analyte concerné.
Pour cette raison, certains chromatographes sont équipés de deux ou trois détecteurs liés à série (Figure ).
Néanmoins, la réaction de tous les détecteurs dépend de la concentration molaire ou la masse de l'analyte
dans le support gaz.
les différents détecteurs qui existent dans la CPG :
- détecteur de conductivité thermique (TCD)
- Détecteur de flamme d'ionisation (FID)
- détecteur Azote phosphore (DNP)
- détecteur de capture d'electron (ECD)
- détecteur photo-ionisation (PID

2.8 Détecteurs fournissant des données structurelles


Aucun des détecteurs décrit précédemment ne donne d'information sur la nature du composé élue.
Tout au plus, ils sont sélectifs. Identification des composés produit avec l'utilisation d'un étalonnage

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interne basé sur les temps de rétention ou nécessite la connaissance des indices de rétention. Lorsque le
chromatogramme est très complexe, une confusion d'identité peut se produire. Pour contrer cela,
plusieurs détecteurs complémentaires peuvent être associées, ou un détecteur capable de transmettre
des informations structurelles sur la base des données spectroscopiques, ou sur la Composition
elementaire des analytes. Les caractéristiques de temps de rétention et spécifiques pour chaque
composé pourrait alors être connu. Ces détecteurs conduisent à une analyse autonome des techniques
dont les résultats ne dépendent que de la capacité de la colonne à séparer correctement les
constituants du mélange d'échantillon.
exp : détecteur d'émission atomique; détecteur a spectroscopie de masse

2.9 Indices de rétention et constantes de phase stationnaire


Ces paramètres ont été développés pour suivre au moins trois objectifs:
• identifier un composé par une caractéristique plus générale afin d'éviter certaines erreurs
d'identification.
• Pour suivre l'évolution au fil du temps de la performance d'une colonne.
• Pour classer toutes les phases stationnaires afin de simplifier le choix de la colonne
la mieux adapté à un type particulier de problème de séparation.

Application 01: Trouver une expression pour calculer l'épaisseur du film df d'une colonne capillaire De K, k et
ID, (diamètre interne de la colonne) .
Un échantillon d'hexane est injecté sur une colonne ayant un diamètre interne De 200 μm pour laquelle K est
égal à 250. Le temps de rétention pour l'hexane Est de 200 s, tandis qu'un composé non retenu a un temps de
rétention seulement de 40 s.
Calculez l'épaisseur du film df à partir de cette information.

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Application 02 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des
protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) :
MM tr (min)
Aldolase 145000 10,4
Lactate déshydrogénase 135000 11,4
Phosphatase alcaline 80000 18,4
Ovalbumine 45000 26,2
Lactoglobuline 37100 28,6
1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve ?
2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique
précédent.?

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire,
gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents
temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau),
selon la relation :
Vr (volume de rétention ) = Ve (volume d'élution) = d (débit) x tr (temps de rétention)
La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer
préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite :

MM Log MM tr (min) Ve (ml)


Aldolase 145000 5,16 10,4 52
Lactate déshydrogénase 135000 5,13 11,4 57
Phosphatase alcaline 80000 4,9 18,4 92
Ovalbumine 45000 4,65 26,2 131
Lactoglobuline 37100 4,57 28,6 143

2 - La glucokinase, avec un temps de rétention de 21 min, est éluée à un volume d'élution de 5 x 21 = 105 ml. Il
suffit de se reporter au graphe pour déterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse moléculaire de
66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ.

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CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE

PERFORMANCE (HPLC)
Introduction

De toutes les techniques chromatographiques dont la phase mobile est un liquide, la chromatographie haute
performance en phase liquide (HPLC) est peut-être le plus connue. Son succès est également dû à la
possibilité, pour le chromatographe, d'agir d'une manière très précise sur la sélectivité entre les composés par
un choix approprié de colonnes et de composition de l'éluant pour exploiter les interactions soluté / phases
mobiles / phase stationnaire.

4.1 Les débuts de L'HPLC

La chromatographie en phase liquide haute performance, souvent appelé simplement par son abréviation,
HPLC constitue une technique d'analyse d'usage général dérivé de la forme ancienne de chromatographie
liquide.

- la technique moderne est grandement améliorée (sélectivité, résolution, phases stationnaires très
élaborées.

- L'un des aspects en particulier de l'HPLC est celui des mécanismes de séparation entre l'analyte , la phase
mobile et la phase stationnaire. Ils sont basés sur les coefficients d'adsorption.

4.2 concept général d'un système HPLC

Une installation HPLC est composée de plusieurs unités spécialisées. Un système de tuyauterie de très faible
diamètre interne, (0,1 mm) assure la circulation de la phase mobile entre les modules. Ces tubes de transfert
sont réalisés en acier inoxydable ou en PEEK® (polyétheréthercétone), un polymère coloré et flexible, capable
de résister aux solvants courants sous haute pression (jusqu'à 350 bars).

Une installation de CLHP est composé de plusieurs unités spécialisées qui peuvent être trouvés comme des
entités distinctes ou être intégrés dans un cadre commun, généralement pour des raisons d'encombrement

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4.3 Pompes et gradient d'élution

4.3.1 Pompes

Tous les systèmes HPLC comprennent au moins une pompe pour forcer la phase mobile à traverser la colonne.
Le résultat de ceci est une augmentation de la pression à l'injecteur qui peut atteindre 20 000 kPa (200 bar) en
fonction du débit vitesse imposée à la phase mobile, sa viscosité et la dimension des particules de la phase
stationnaire. Les pompes sont conçues pour maintenir un débit stable, évitant pulsations même lorsque la
composition de la phase mobile varie.

4.3.2 Influence de la T°

L'influence de la température sur la qualité de la séparation a été longtemps négligée. Maintenant, les
instruments de HPLC sont équipés de colonnes dont la température est contrôlée par thermostat. Cela
améliore la reproductibilité des analyses et propose un autre paramètre de la séparation à considérer.

4.4 phases stationnaires

La phase stationnaire (SP) en contact avec la phase mobile (MP) est le deuxième moyen avec lequel les
composés initialement dissous dans la phase mobile vont interagir. Sur la colonne, il y aura autant
d'associations particulières des trois constituants [MP / composé / SP] comme il y a des analytes dans
l'échantillon.

De nombreuses matières organiques et inorganiques ont été testés pour une utilisation comme garnissage
pour les colonnes.

Le gel de silice, le matériau majeur pour les phases de courant

phases mobiles

Le degré d'interaction entre la phase mobile et la phase stationnaire normale ou inversée, affecte le temps de
rétention des analytes. En principe, la polarité de la phase stationnaire peut conduire à des situations
suivantes:

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• Si la phase stationnaire est polaire, alors la technique est dite chromatographie en phase normale et une
phase mobile moins polaire est utilisé.

• Si la phase stationnaire est non polaire ou faiblement polaire, alors que l'on appelle la technique de
Chromatographie en phase inverse (RP-HPLC) - ou une chromatographie sur une phase hydrophobie.

Problème
un appareil HPLC peut utiliser des colonnes de diamètre interne de 300 µm, et pour laquelle le débit optimal
conseillé 4µL / min.

Le chromatogramme ci-dessous correspond à un exemple de séparation obtenue avec une colonne étroite de
300 µm × 25cm.

1. Quel est le volume mort de cette colonne?

(La flèche marquée sur la chromatogramme indique le temps de hold-up.)

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