Práctica n°7: Separación de proteínas en la sangre

Eduard Esneider Clavijo Camargo 121004006

Josue David Muñoz López 121004021
Valeria Peña Lache 121004026
Gina Alexandra Prada Cubillos 121004048
Medicina Veterinaria y Zootecnia
Horario: viernes 10:00 am - 1:00 pm

Objetivos:
● Separar las diferentes proteínas de la sangre por precipitación con sulfato de amonio
y reconocer su presencia mediante la prueba de biuret
● Separar la hemoglobina de una muestra de sangre por hemólisis de los eritrocitos y
reconocer sus propiedades oxido-reductoras

Resultados:

Muestra de sangre y separación de plasma sanguíneo:

Para esta prueba se usó exactamente 10 ml de volumen de sangre. Se llevó a un tubo

falcon en el cual había una pizca Oxalato de sodio (​Na​2​C​2​O​4 )​ que es el encargado en
prevenir la coagulación de la sangre y se agitó hasta poder observar una mezcla
homogénea. Se realizó un contrapeso con otro tubo falcon y se llevó a la centrifugadora a
6000 rpm durante 5 minutos, luego de esto se obtuvo los glóbulos rojos de precipitado y el
plasma sanguíneo de sobrenadante. Por último se procedió a separar el plasma con una
pipeta pasteur, y a medir en la probeta de 10 ml de volumen, el volumen exacto de el
plasma el cual fue de 5.9 ml.

Separación y reconocimiento de hemoglobina:

Al precipitado (glóbulos rojos) se le agregó un total de 8 ml de NaCl 0.9% se agitó hasta

que se mezcló completamente y se dejó reposar durante 3 minutos, para luego proceder a
centrifugar con un contrapeso de agua durante 5 minutos a 6000 rpm. Se separó el
sobrenadante (plasma) y se realizó 3 pruebas en las cuales teníamos:

Prueba 1: ​Su coloración siguió igual que al inicio (amarillo) debido a que no se le aplicó
ningún tipo de reactivo.

Prueba 2: ​Se tomó la prueba en blanco y se le agregó exactamente 20 gotas de K​3 ​Fe(CN)​6
no se logró evidenciar ningún tipo de reacción.

Prueba 3: ​Se volvió a tomar la prueba en blanco, pero esta vez se procedió a agregar 20
gotas NaHSO​3​ al igual que el anterior no se logra ver ningún tipo de reacción.

Separación de pr oteínas plasmáticas:

Fibrinógeno:​ Se realizó una regla de tres en las cuales incluimos los siguientes datos.

5 ml de plasma → 0,7300 g de (NH4)2SO4

5,9 ml de plasma medidos ➝ …..
El cual dió un resultado de 0,8614 g de (NH4)2SO4, y dicha cantidad fue la que se agregó a
un tubo falcón donde ya se encontraba el plasma sanguíneo. Se pudo observar los cristales
como precipitado pero luego se procedió a agitar hasta que la mezcla se volvió homogénea,
hasta observar la turbidez necesaria para esta prueba.

Se llevó a centrifugar a 6000 rpm durante los 5 minutos para luego separar el sobrenadante
y medirlo en la probeta, dando así un resultado de 5.3 ml de plasma.

Con el precipitado de esta misma prueba se llevó a cabo una prueba a la cual se le agregó
3 ml de NaCl, se agitó hasta que la mezcla quedó totalmente homogénea. Se traspasó a un
tubo de ensayo, se agregó 12 gotas de ​NaOH y se pasó a verificar su pH en primera
instancia con el papel tornasol rojo que su coloración pasó a azul y realizando la prueba
Biuret en la cual su coloración fue morada, es decir, que la prueba es positiva.

Globulinas:

Se realizó una regla de tres en las cuales se incluyó los siguientes datos.

5 ml de plasma 0,9700 g (NH4)2SO4

5,3 ml de plasma medidos ➝ ……

El cual dió un resultado de 1,0282 g de (NH4)2SO4, se le agregó la sal pesada, se agitó y

se observó turbidez. Se procedió a centrifugar, luego a separar el sobrenadante para
medirlo en la probeta el cual dió un volumen de 4.9 ml de plasma. Al precipitado se le
agregó 5 ml de NaCl, se agitó hasta ver una mezcla homogénea y se llevó a un tubo de
ensayo en donde se le agregó 12 gotas de NaOH. Se verificó su pH con el papel tornasol
rojo, el cual su color pasó a azul, al igual con la prueba de Biuret pero en esta ocasión dio
color azul siendo así negativa.

Albúmina:

Se realizó una regla de tres con los siguientes datos.

5 ml de plasma → 1.8000 g (NH4)2SO4

4,9 ml de plasma medidos → …….

Dando un resultado de 1.764 g de (NH4)2SO4, la cual fue agregada al plasma anterior, se

agitó y se observó la turbidez. Se procedió a centrifugar y se agregó 5 ml de NaCl se agitó
y pasó a un tubo de ensayo en el cual se agregó 12 gotas de NaOH. Se verificó su pH con
el papel tornasol rojo, el cual su color pasó a azul y se realizó la prueba de Biuret pero al
igual que la anterior su coloración fue azul, dando así negativo.
Análisis de resultados:

La sangre es un tejido líquido que recorre el organismo a través de los vasos sanguíneos
que transporta las células necesarias para llevar a cabo las funciones vitales (respirar,
formar sustancias y defenderse de agentes externos). Además se han realizado todo tipo de
análisis con el fin de descubrir enfermedades presentes en el organismo.
"​Nuestro descubrimiento significa que seremos capaces de entender mucho mejor una
amplia variedad de trastornos humanos con la sangre y enfermedades, como por ejemplo
de la anemia, donde no hay suficientes células sanguíneas, a la leucemia, donde hay
demasiadas células sanguíneas​" (Dick, 1993).

Separación del plasma sanguíneo

Entre los componentes de la sangre está: El plasma que es aproximadamente el 90% agua,
y el 10% restante está formado por iones, proteínas, nutrientes, desechos y gases disueltos.
Los iones, proteínas y otras moléculas que se encuentran en el plasma son importantes
para mantener el pH de la sangre y el equilibrio osmótico, en el cual la albúmina (la principal
proteína del plasma humano). Los glóbulos rojos, son células especializadas que circulan
por todo el cuerpo y proporcionan oxígeno a los tejidos. Las plaquetas, también llamadas
trombocitos​, son fragmentos celulares que participan en la coagulación de la sangre, y los
glóbulos blancos, también llamados ​leucocitos que son mucho menos comunes que los
glóbulos rojos y conforman menos del 1% de las células sanguíneas y tienen la función de
participar principalmente en la respuesta inmunitaria al reconocer y neutralizar invasores,
tales como virus y bacterias.

Separación y reconocimiento de hemoglobina:

La hemoglobina es la proteína presente en el ​torrente sanguíneo que permite que el

oxígeno sea llevado desde los órganos del sistema respiratorio hasta todas las regiones y
tejidos.
Dos pares de cadenas polipeptídicas componen la hemoglobina y cada una de ellas está
unida a un grupo hemo. Los átomos de hierro de estos conjuntos les permiten enlazarse, de
manera fácil de revertir, a una molécula de O2. Al quedar unida con ​oxígeno​, la
hemoglobina recibe el nombre de hemoglobina oxigenada u oxihemoglobina. En cambio, si
pierde oxígeno, se habla de hemoglobina reducida.

Prueba 1: ​Su coloración permaneció del color del plasma debido a que no se le aplicó
ningún tipo de reactivo, es decir, que no reaccionó. Por tanto no hay presencia
hemoglobina.
Prueba 2: ​La reacción con el Ferrocianuro de potasio K​3 Fe(CN)​
​ 6 consiste
​ en que el Fe (ΙΙ)
de todas las formas de hemoglobina, con excepción de la sulfohemoglobina, es oxidado por
el ferrocianuro a Fe(ΙΙΙ). La intensidad del color es proporcional a la concentración de
hemoglobina, que en el caso de la práctica permaneció del mismo color de plasma, es decir,
que no se presenció hemoglobina, porque no se tornó rojo.
Prueba 3: ​Se volvió a tomar la muestra y luego de adicionar 20 gotas de NaHSO³ , no se
presentó ningún cambio por lo cual se evidencio que no hubo presencia de hemoglobina,
debido a que no se presentaron cambios de ningún tipo en la muestra.

Separación de proteínas plasmáticas:

La sangre contiene varias proteínas en pequeñas cantidades, que ayudan a equilibrar el

fluido corporal y mejorar la inmunidad. Las proteínas que se separaron del plasma durante
la práctica fueron:

Fibrinógeno:
Es una glicoproteína ​responsable de la formación de los ​coágulos de sangre​, es decir,
cuando se produce una ​herida se desencadena la transformación del fibrinógeno en ​fibrina
gracias a la actividad de la ​trombina​, con estructura globular y fibrosa que corresponde al
Factor I de la Cascada de Coagulación, está formada por dos subconjuntos proteicos
consistentes de tres cadenas, denominadas (Aa)2, (Bb)2 y (g)2, unidas mediante
puentes disulfuro creando la estructura molecular dimérica (Rawn, 1989).
Las cadenas (Aa) consisten de 610 aminoácidos, las (Bb) de 461 y las (g) de 411
(Standeven ​et al ​.,2005; Grassl and Tranquillo, 2006), en consecuencia el fibrinógeno
humano consta de 2.964 aminoácidos con un peso molecular de 329,818 kDa; además,
posee 4 grupos de carbohidratos, uno en cada cadena Bb y g lo cual contribuye con otros
10 kDa al peso molecular para dar un valor aproximado de 340 kDa (Standeven et al.,
2005).

Para la determinación de fibrinógeno sanguíneo, se han aplicado dos métodos de

valoración de proteínas en el plasma: turbidimetría al agregar los 0,8614 g de (NH4)2SO4 y
colorimetría ​al verificar su pH en primera instancia con el papel tornasol rojo, cuya
coloración pasó de azul a morado con el reactivo Biuret, resultado de los 5 ml de NaCl y las
12 gotas de NaOH. (​Reiner,1962).
Los métodos que se emplean con más frecuencia en los laboratorios de análisis clínicos son
el de (Parfentjev, 1993) en los que se logra la precipitación del fibrinógeno por medio de
diferentes sales, en el caso de la práctica, el sulfato de amonio que es una sal ácida, y se
realiza la lectura turbidimétrica, que luego se compara con la producida por otras proteínas,
por ejemplo las de plasma completo.

Globulina:
Las globulinas son un grupo de proteínas de la sangre, que el sistema inmunitario produce
en el hígado. Juegan un papel importante en el funcionamiento del hígado, la coagulación
de la sangre y el combate contra las infecciones, y tienen un peso molecular de 155000.
Hay cuatro tipos principales de globulinas: alfa 1, alfa 2, beta y gamma.
En las globulinas se hallan contenidas las antitoxinas, aglutininas, precipitinas, y lisinas;
están además encargadas del transporte lipoideo. Dichas moléculas proteicas poseen un
gran número de cargas positivas y negativas, es decir que son iones hermafroditas.
Albúmina:

La albúmina es la fracción más pequeña de las proteínas séricas (su peso

molecular es de unos 60.000) correspondiéndole una cadena de polipéptidos
integrada por 600 aminoácidos; presenta una forma esférica debida al apelotonamiento
de las cadenas de polipéptidos que la forman (PAULING, BRILL). La fracción albúmina es
la que más se acerca a la forma esférica; su solución incrementa débilmente la viscosidad,
tiene una notable hidrosolubilidad, sus· partículas se hallan recubiertas por un manto
acuoso, en cuyo interior se hallan las cargas eléctricas cuyo reparto es prácticamente
simétrico, lo que explica su gran estabilidad. Debido a esta apetencia por el agua y por ,el
hecho de constituir el 55-62 % de las proteínas plasmáticas, es un factor decisivo en
la presión coloidosmótica total del plasma, atribuyéndosele una función importante
en la regulación hídrica del organismo (WURMANN).

Para la separación de proteínas en fibrinógeno, globulina y albúmina, se realizó el mismo

método de turbidez y colorimetría. En los tres casos se realizó una precipitación de
proteínas por cambio iónico. La precipitación salina es uno de los métodos de separación de
proteínas de estado natural.
El sulfato de amonio es una de las sales más utilizadas para la precipitación salina de
proteínas. Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 mL de agua a una temperatura
de 20 ºC) y el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas.
Las proteínas en solución son menos solubles cuando se aumenta la fuerza iónica y esto se
puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio ((NH4)2SO4). Sin
embargo, la concentración para precipitar diferentes proteínas es variable. Esta diferencia
en sensibilidad se ha utilizado para separar y purificar proteínas, por ejemplo las albúminas
y globulinas de la sangre.
En la prueba de colorimetría ​al verificar el pH en primera instancia con el papel tornasol rojo
en las tres proteínas, se observa que la única prueba que da positiva para la presencia de
proteínas es la de fibrinógeno cuya coloración pasó de azul a morado con el reactivo Biuret,
mientras que la globulina y albúmina tiñen del color azul característico del reactivo Biuret.

Conclusiones:
- Se separaron las proteínas de fibrinógeno, globulina, y albúmina presentes en el
plasma sanguíneo. Su presencia se determinó mediante la reacción de Biuret y
colorimetría con el papel tornasol rojo, dando positivo solamente para fibrinógeno.
- Por medio de la práctica realizada se logró la separación de hemoglobina de una
muestra de sangre y posteriormente se reconocieron las propiedades oxido
reductoras.
 Bibliografía

Robles G. Jorge. Nutrición en el paciente críticamente enfermo. Primera Edición. Mc Graw

Hill. Interamericana. México 1996.

Cervera Pilar, Claper Jaime, Rigolfas Rita. Alimentación y dietoterapia. Segunda Edición. Mc
Graw Hill. España 1993.

Parfentjev, I. A., M. L. Johnson & E. E. Clifeton. The determination of plasma fibrinogen by

turbity with sulfure. Arch Biochem. 46: 470, 1953.

Reiner, M, & Helen T, Cheung. Fibrinógeno. Cap XI en Seligson, D. Métodos seleccionados

de análisis clínicos, Vol. III. XIX, + 314 pp.. Aguilar, S. A de Ediciones, Madrid, 1962.

Revista Bioanálisis. Diagnostico bioquímico. Numero 1. Editorial Khunz. Enero 2005.

Revista Factores de riesgo hoy. Laboratorios Phoenix. Numero 2. Talleres Gráficos Valdez.
Abril 2001.