La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
Estos estudios proporcionan
información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en
función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración
inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax). • El proceso enzimático sigue las siguientes etapas: En primer lugar el sustrato (S) y la enzima (E) se unen y forman un complejo enzima-sustrato (ES). Una vez formado el complejo ES, este o bien se disocia en enzima más el sustrato o se transforma el sustrato en producto formado el complejo enzima-producto (EP), que se disocia para dar enzima (E) más producto (P). • El proceso fue modelizado por Michaelis y Menten y le permitio obtener una ecuación, ecuación de Michaelis-Mente en donde la velocidad de la acción de un enzima es función de la cantidad de sustrato presente, la cantidad de enzima y las características del enzima, la afinidad del enzima por el sustrato y el poder catalítico del enzima • La Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres), cuanto menor es Km may • La velocidad máxima Vmáx estima el número de centros activos del enzima. Recordar que hemos definido la Vmáx como la velocidad que obtendríamos cuando todo el enzima se encuentra unido al sustrato. • A la constante k2 (poder catalítico del enzima) se la reconoce con el nombre de número de recambio, es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo. Por lo que la Vmáx depende de dos cosas, la cantidad de enzima presente y la capacidad catalítica del enzima, es decir la velocidad con que transforma al sustrato La representación gráfica de la velocidad en función de la concentración de sustrato: Del estudio del modelo se desprende que la velocidad de transformación de sustrato en producto en una reacción enzimática depende: - La cantidad de sustrato presente. [S] - La afinidad del enzima por el sustrato. Km - La cantidad de enzima presente. [E] - El poder catalítico del enzima. [k2] Cualquier mecanismo que altere alguno de estos parámetros provocara una modificación de la velocidad enzimática, por lo que una vía podrá ser modulada o controlada. Además no todos los enzimas siguen una cinética de Michales-Menten, algunos presenta una cinetica sigmoidal, los enzimas que presentan modulación alosterica cooperativa, es decir aquellos en el que el sustrato actua como un modulador positivo. Estudia las diferencias de un enzima con modulación alosterica cooperativa positiva y un enzima que sigue la cinética de Michaelis-Menten. La velocidad de acción de un enzima también se puede ver afectada por la presencia de inhibidores, que pueden actuar de diferentes maneras. Estudia los efectos sobre la velocidad de la presencia de Efecto de la concentración del sustrato Km: Concentración de (S) a la cual se alcanza la mitad de la Vmax. Es una constante de afinidad de la enzima por un sustrato específico. Km es una medida inversa de la afinidad. Vmax Se alcanza cuando todos los sitios activos de la E, está saturados por el S, siendo (S) >>Km. - Existe un PH en el cual se obtiene un máximo de velocidad -> pH óptimo. - Cada enzima tiene un pH óptimo. Amilasa salival 6,5; Pepsina 1,8. - Puede influir en la afinidad, % de saturación de E, por S, estabilidad de la E, en las constantes cinéticas Efecto del PH Efecto de la temperatura - La T óptima de nuestras enzimas es la de la temperatura corporal. - Por encima de esta T, la enzima va disminuyendo su actividad catalítica hasta desnaturalizarse 55-60 ºC. - Por debajo también disminuye hasta inactivarse. Pero recupera su actividad en la T, óptima. CONCLUSIONES Y/O ACTIVIDADES DE INVESTIGACIÓN SUGERIDAS Grupo de seminario realiza exposición correspondiente de esta clase. Revisa en plataforma blackboard, en subcarpeta de Actividades Académicas, la Guía de Práctica. Revisa en plataforma blackboard, el material asignado a esta clase en subcarpetas de lectura y webgrafía. Isoenzimas - Son diversas formas moleculares de una enzima. - Catalizan la misma reacción química. - Tienen secuencia de AA semejantes pero no idénticas. - Presentan distintas propiedades cinética, reguladoras, antigénicas e incluso distribución celular. Inhibidores -Son sustancias químicas que participan en la regulación enzimática. - Suministran información importante acerca de la estructura y/o grupos funcionales del sitio activo. - Permite conocer la especificidad de la enzima por un tipo de reacción o sustrato. - Muchos agentes terapéuticos ejercen su acción farmacológica actuando como inhibidores enzimáticos.