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cáncer de mama
evidencia significativa ha indicado que los macrófagos asociados al tumor (TAM) desempeñan un
papel crítico en la proliferación, la invasión, la angiogénesis y la metástasis de una variedad de
carcinomas humanos. En este estudio, se investigó si la imagen de fluorescencia en el infrarrojo
cercano (NIRF) utilizando un receptor de manosa de los macrófagos (MMR; CD206) agente -
targeting podría ser utilizado para visualizar de forma no invasiva y cuantificar los cambios en TAM
en vivo. El agente NIRF CD206-focalización, Tinte-anti-CD206, se preparó y se caracterizó in vitro e
in vivo. Mediante el uso de imágenes NIRF, hemos sido capaces de no invasiva macrófagos
infiltrantes de tumor de imagen en el modelo de cáncer de mama 4T1 de ratón. Es importante
destacar que, de formación de imágenes NIRF longitudinal reveló el agotamiento de los
macrófagos en respuesta a tratamiento con ácido zoledrónico (ZA). Sin embargo, ZA solo no dio
lugar a la inhibición del crecimiento tumoral 4T1. por lo tanto, se combinaron anti-macrófagos ZA
terapia y tumor citotóxico docetaxel terapia (DTX) en el modelo de ratón. Los resultados
demostraron que esta estrategia de combinación podría inhibir significativamente el crecimiento
del tumor, así como metástasis de tumores a los pulmones. Basándose en estos hallazgos,
concluimos que la imagen molecular específica-CD206 puede detectar con sensibilidad los cambios
dinámicos en los macrófagos infiltrantes de tumor, y que la combinación de agotamiento de los
macrófagos y la terapia citotóxica es una estrategia prometedora para el tratamiento eficaz de
tumores sólidos.
Palabras clave: Imágenes ópticas, CD206, macrófagos asociadas con el tumor, el agotamiento de
los macrófagos, la terapia guiada por imágenes.
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Introducción
El cáncer de mama es una enfermedad maligna diagnosticada con frecuencia en las mujeres y es
una causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo . La mortalidad
asociada al cáncer de mama como resultado en gran parte de la diseminación metastásica de las
células tumorales a los órganos vitales como los pulmones, el hígado y la detección temprana del
hueso y la mejora de las estrategias de tratamiento podrían aumentar considerablemente las
probabilidades de curar o controlar esta enfermedad .
Los tumores sólidos, incluidos los de cáncer de mama, comprenden no sólo las células de tumores
malignos, pero también muchas células circundantes de diversos tipos que crean un
microambiente único; este microambiente regula las propiedades neoplásicas de los tumores .
macrófagos asociados a tumores (TAM) son un conjunto de macrófagos que residen en el
microambiente tumoral, y TAM promover la migración de células tumorales y la invasión mediante
la secreción de citocinas y quimiocinas . Cada vez más pruebas a partir de estudios clínicos y
preclínicos se ha indicado que TAM promover la invasión tumoral celular, la proliferación, la
supervivencia y metástasis en sitios locales y distantes . Varios estudios clínicos han demostrado
que el aumento de la infiltración de macrófagos en tumores confiere pronóstico potencial de
metastásica en cáncer de mama . los papeles importantes de TAM en cánceres sugieren que es
importante desarrollar nuevas terapias que se dirigen a estas células . Además, de imagen no
invasiva de infiltrados de macrófagos sería de gran ayuda en la progresión del cáncer mejor
comprensión y en la evaluación del tratamiento del cáncer eficacia.
El ácido zoledrónico (ZA) es un bisfosfonato que contiene nitrógeno de tercera generación que ha
sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para el
tratamiento de la enfermedad ósea inducida por el cáncer . ZA previene y trata las metástasis
óseas en pacientes con tumores sólidos mediante la orientación osteoclastos , que son macrófagos
que casa con el hueso . ZA reduce el número de macrófagos asociados al tumor y la cantidad de
vascularización, reduciendo así la carga de metástasis .
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Materiales y métodos
Preparación del agente de imagen NIRF CD206-focalización
Figura 1
Figura 1
(A) El esquema de síntesis del Tinte-anti-CD206. (B) SDS-PAGE y formación de imágenes NIRF de
anti-CD206 anticuerpo y tinte-anti-CD206. (C) CD206 y F4 / 80 tinción de las células RAW 264.7 de
macrófagos murinos. (D) tinción de fluorescencia directa de RAW 264.7 y células 4T1 usar tintes de
anti-CD206 ...
Para la tinción de superposición de CD206 y F4 / 80, las células RAW 264.7 cultivadas en 35 mm
MatTek placas de cultivo de vidrio de fondo se incubaron con la rata anti-ratón de CD206
(BioLegend, San Diego, CA) y de conejo anti-ratón de F4 / 80 (Abcam, Cambridge, MA) anticuerpos
primarios durante 1 h a temperatura ambiente, y después se incubaron con anticuerpos
secundarios conjugados de colorante durante 1 h. Las células se montaron con medio que
contiene DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se examinan bajo un microscopio confocal
(Wetzler, Heidelberg, Alemania).
Para determinar la inmunorreactividad de tinte-anti-CD206, RAW 264.7 o células 4T1 se incubaron
con tinte-anti-CD206 (10 nmol / L en PBS) o tinte-IgG (10 nmol / L en PBS) durante 1 h a
temperatura ambiente . Después de lavar con PBS y montaje con medio que contiene DAPI, se
examinaron las células bajo un microscopio confocal.
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la
Universidad de Pekín Cuidado de Animales y el empleo Comisión. El modelo de ratón 4T1
portadores de tumores fue establecido por vía subcutánea inoculación de 2 x 106 células en los
flancos delanteros derecho de / c ratones normales BALB (4 ~ 5 semanas de edad; Departamento
de Animales de Laboratorio de Ciencias, Universidad de Pekín). Para determinar la especificidad
del tumor in vivo de tinte-anti-CD206, cada ratón 4T1 tumor-cojinete se inyectó por vía
intravenosa con 0,2 nmol de colorante-anti-CD206 (n = 5) o tinte-IgG (como control; n = 5) . A las
2, 8, 24, y 48 h después de la inyección (p.i.), los ratones fueron NIRF imagen usando un sistema de
imágenes IVIS pequeños animales (Xenogen, Alameda, CA). Para cada análisis, una parte alícuota
con una cantidad conocida de solución inyectada Se obtuvieron imágenes de forma simultánea. La
región de interés (ROI) se ha elaborado para cada tumor de las imágenes utilizando software
Image habitable (Xenogen, Alameda, CA) como se describió anteriormente 20, 21. Los resultados
se expresaron como el porcentaje de la intensidad de fluorescencia mediante la normalización de
los valores de captación tumoral ([p / seg / cm2 / sr] / [/ cm2 mu W]) a la dosis total de inyección.
Para ex vivo NIRF de imágenes, dos grupos (n = 4 por grupo) de 4T1 ratones portadores de tumor
se inyectaron por vía intravenosa con 0,2 nmol de colorante-anti-CD206 y tinte-IgG,
respectivamente. A las 24 h p.i., los ratones se sacrificaron, y se recogieron la sangre, tumor y los
órganos principales de cada ratón, se pesaron, y se colocan en un papel en blanco, junto con una
parte alícuota de una cantidad conocida de producto inyectado. a continuación, se llevó a cabo
formación de imágenes NIRF, y los resultados se presentaron como el porcentaje de dosis
inyectada por gramo (% ID / g).
Para el ensayo de formación de colonias, las células 4T1 (1 x 103 / pocillo) se sembraron en una
placa de 12 pocillos y se incubó a 37 ° C durante la noche. Las células se trataron con medio de
cultivo que contiene el control del vehículo, ZA (10 nM), DTX (10 nM), o ambos ZA (10 nM) y DTX
(10 nM) durante 48 h. Después, medio de cultivo celular se cambió, y se dejó que las células
crecieran durante otros 120 horas a 37 ° C hasta que las colonias de células eran visibles. Las
células fueron teñidas con 0,1% de Coomassie Brilliant Blue y se examinaron por microscopía.
los ratones con tumores de aproximadamente 150 mm3 fueron separados en cuatro grupos 4T1
portadores de tumores: el control del vehículo (n = 24), el tratamiento ZA (n = 24), el tratamiento
DTX (n = 8), y ZA además DTX tratamiento (n = 8) grupos. Los animales fueron inyectados por vía
intraperitoneal con el control del vehículo, ZA (150 mg / kg en PBS, diariamente), DTX (5 mg / kg
en 13% de etanol, al día), y las dos ZA (150 mg / kg en PBS, diariamente) y DTX ( 5 mg / kg en 13%
de etanol, al día) durante 7 días (del día 0 al día 6). El crecimiento tumoral se midió usando un
calibrador, y el volumen del tumor se calculó usando la fórmula: volumen = longitud x anchura2 /
2. Cuatro ratones de cada uno de los grupos control del vehículo y de tratamiento ZA fueron
sacrificados cada día en los días 0, 3, 7, y se cosecharon 11. Los tejidos tumorales, se congelaron
en medio PTU, y se cortan en rodajas de 5 micras de grosor. Se realizó a continuación, tinción de
inmunofluorescencia para determinar CD206 y F4 / 80 niveles de expresión.
Al final (día 12) del estudio de terapia in vivo, se recogieron tejidos tumorales de cada grupo, y el
corte congelado en rodajas 5-m de espesor para la tinción de inmunofluorescencia de los niveles
de Ki67. metástasis de tumor de pulmón se examinó utilizando un anteriormente descrito método
de 22. En resumen, los pulmones de cada ratón se rellenan con tinta India 15% a través de la
tráquea superior y se fijaron en solución (100 ml de 70% de alcohol de Fekete, 10 ml de formalina
al 4%, y 5 ml de ácido acético glacial). Las lesiones metastásicas aparecen como nódulos blancos
en las superficies del pulmón negro después de este procedimiento. Después de ser fotografiado,
los pulmones se incluyeron en parafina, corte en secciones, y se sometieron a hematoxilina y
eosina (H & E) tinción.
Ex vivo la tinción de inmunofluorescencia de tumor 4T1 o tejidos normales se realizó para validar
los resultados de los estudios in vivo. Se llevaron a cabo los experimentos, y los resultados de la
tinción fueron analizadas por dos investigadores (D. y C. Gao Zhang) que fueron cegados a los
resultados del tratamiento de imágenes y de tumores in vivo NIRF.
Para CD206 y F4 / 80 tinción de superposición, tumor 4T1, músculo, hígado, o cortes de tejido de
bazo se incubaron con la rata anti-ratón de CD206 (BioLegend, San Diego, CA) y de conejo anti-
ratón de F4 / 80 (Abcam, Cambridge, MA ) anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura
ambiente, y luego se visualizaron con Cy3 o anticuerpos secundarios conjugados con FITC con un
microscopio confocal. Para la tinción de Ki67, las rodajas tumorales se incubaron con anticuerpo
de conejo anti-Ki67 (Millipore, Billerica, MA). Las rodajas se visualizaron luego con el anticuerpo
secundario conjugado con Cy3 bajo un microscopio confocal. Después de la tinción, se
seleccionaron 10 vistas aleatorias en las rodajas de tumores para los análisis. El nivel de expresión
CD206 murino se calculó mediante la medición de la densidad óptica integrada de imágenes de un
área equivalente utilizando un método descrito previamente 23. El índice de proliferación de
células tumorales se calculó como el porcentaje de células Ki67 positivas 24.
análisis estadístico
Los datos cuantitativos se expresan como medias ± SD. Los datos se analizaron usando GraphPad
versión 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Las diferencias se analizaron mediante prueba t
de Student o ANOVA, y los resultados se consideraron estadísticamente significativas en los
valores de p <0,05.
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resultados
Figura 2
Figura 2
(A) En vivo NIRF de imágenes de 4T1 ratones normales BALB / c portadores de tumor a los 2, 8, 24,
y 48 h después de la inyección intravenosa de colorante-anti-CD206 o tinte-IgG. Los tumores se
indican por los círculos de trazos. (B) Cuantificación y la cinética de las características de
orientación tumorales in vivo ...
Para investigar la biodistribución de tinte anti-CD206 o tinte-IgG en las 4T1 tumores y tejidos
normales, se realizó ex vivo de imágenes NIRF a las 24 h p.i. en otro estudio. Blood, tumor, y los
órganos normales se pesaron, se determinó el total de la señal de fluorescencia, y se calculó el% ID
/ g. Como se muestra en la Figura Figure22C, D, la absorción de tinte-anti-CD206 en la mayoría de
los órganos normales era comparable a la de tinte-IgG. Sin embargo, la captación tumoral de tinte-
anti-CD206 fue significativamente mayor que la de tinte-IgG (13,23 ± 2,78% vs. 7,30 ± 0,84%, P
<0,01), que es consistente con los datos de imagen en vivo NIRF en ratones vivos . Se observó que
la absorción de tinte-anti-CD206 en el hígado fue también significativamente superior a la de tinte-
IgG (19,07 ± 4,12% vs. 11,55 ± 3,03%, P <0,05).
La tinción de inmunofluorescencia
Se investigaron los patrones de expresión de CD206 en tejidos tumorales 4T1 mediante tinción de
inmunofluorescencia. Como se muestra en la Figura Figure33A, tejidos tumorales 4T1 fueron
positivos tanto para F4 / 80 y CD206. tinción de superposición mostró que la mayoría de la zona de
CD206-positivo también se tiñeron para F4 / 80, como se esperaba en los macrófagos. Los
resultados confirmaron la expresión positiva de CD206 en los macrófagos de los tejidos tumorales
4T1. Para examinar el tejido normal, el músculo no expresó F4 / 80 o CD206, mientras que el
hígado y el bazo expresan altos niveles de F4 / 80 y CD206 (Material complementario: Figura S1).
figura 3
figura 3
Figura 4
Figura 4
Longitudinales imágenes in vivo NIRF (A) y captación tumoral cuantificada (B) de 4T1 ratones
portadores de tumores a las 24 horas después de la inyección de tinte anti-CD206 en los días 0, 3,
7 y 11 después del ácido zoledrónico (ZA; 150 mg / kg en PBS al día durante 7 días) o PBS
tratamiento (control). ...
Para validar los resultados de las imágenes dinámicas en vivo, hemos realizado ex vivo tinción de
inmunofluorescencia tanto CD206 y F4 / 80. Los resultados de la tinción de superposición de
CD206 y F4 / 80 se muestran en Material complementario: Figura S2, y los resultados de tinción
para CD206 sólo se muestran en la Figura Figure44C. La expresión de CD206 en los tumores
tratados con ZA fue significativamente menor en los días 3 (33.41 ± 6.03% vs. 82.99 ± 20.73%, p
<0,001), 7 (51,29 ± 19,50% frente a 113,43 ± 28,04%, P <0,01) y 11 (42,08 ± 10,91% vs 104.89 ±
30.49%, p <0,01) en comparación a la de los tumores de control (Figura Figure44D), que confirmó
la reducción de la expresión de CD206 en el tumor después del tratamiento 4T1 ZA. Estos
resultados demostraron que el tratamiento ZA de hecho puede resultar en el agotamiento de los
macrófagos CD206-positivo, y este agotamiento se pueden visualizar de forma no invasiva in vivo
mediante formación de imágenes de tinte anti-CD206 NIRF.
Figura 5
Figura 5
(A) efecto citotóxico in vitro de ácido zoledrónico (ZA), docetaxel (DTX), o ZA más DTX en 4T1
células tumorales. (B-C) Fotografía de la placa de pocillos 12 (B) y el examen de microscopía (C) de
la formación de colonias de células 4T1 tratadas con el control del vehículo, ...
A continuación cambiamos a los estudios de terapia in vivo combinados en los ratones portadores
de tumores 4T1. Elegimos una dosis relativamente baja (5 mg / kg) de DTX con el fin de observar el
efecto antitumoral de la terapia combinada. Como se muestra en la Figura Figure55D, la curva de
crecimiento del tumor en el grupo tratado con ZA era casi idéntica a la del grupo control.
tratamiento DTX condujo a la inhibición del crecimiento tumoral leve en el día 8, pero no se
encontró ninguna diferencia estadísticamente significativa en el crecimiento del tumor en
comparación con la del grupo control. En contraste, el tratamiento con DTX más ZA comenzó a
mostrar una tendencia del efecto terapéutico en el día 4, y mucho menos el crecimiento del tumor
se observó desde el día 10 (286,84 ± 93,42 frente a 657,09 ± 377,98 mm3; P <0,05) al día 12
(349,18 ± 100,58 810,97 ± 431,91 vs. mm3; P <0,01) en comparación con la del grupo control.
Estos hallazgos sugieren que la depleción combinada macrófagos (ZA) y la terapia citotóxica (DTX)
ejercen un fuerte efecto terapéutico contra 4T1 tumores in vivo.
Figura 6
Figura 6
(AB) La tinción de inmunofluorescencia de Ki67 (A) y las células Ki67 positivas por ciento (B) en los
tejidos 4T1 tumorales cosechadas en el día 12 de ratones tratados con vehículo (control), el ácido
zoledrónico (ZA), docetaxel (DTX), o ZA plus DTX. (C-E) Las fotografías de la India lleno de tinta ...
células 4T1 son células de cáncer de mama altamente metastásicas, que pueden conducir a la
metástasis evidente en los ratones después de la inoculación 25, 26. Por lo tanto, se investigó aún
más el efecto anti-metastática de ZA, DTX, y ZA más DTX en los ratones portadores de tumor 4T1.
Las imágenes representativas de los pulmones y los números contados de las lesiones
metastásicas en los diferentes grupos se muestran en la Figura Figure66C y la Figura Figure66D,
respectivamente. En el grupo de control, todos los ratones tenían una amplia metástasis de
tumores en los pulmones en el día 12. Los números contados de tumores en los pulmones fueron
11,67 ± 1,52, 2,00 ± 1,73, 8,00 ± 2,00 y 0,67 ± 0,58 para el control, ZA, DTX , y los grupos más ZA
DTX, respectivamente. tratamiento ZA condujo a la formación de un número significativamente
menor de las lesiones metastásicas pulmonares en comparación con la del grupo de control (P
<0,001). No se observó ninguna metástasis de pulmón evidente en el grupo de tratamiento ZA más
DTX. El examen histológico mediante tinción H & E confirmó la reducción en las lesiones tumorales
después del tratamiento con ZA ZA o ambos y DTX (Figura Figure66E). Estos resultados sugieren
que ZA tuvo efectos significativos sobre la inhibición de la metástasis tumoral, y que ZA más DTX
metástasis inhibió casi completamente de los tumores a los pulmones.
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Discusión
En este estudio, hemos preparado un agente de imagen NIRF-dirigida de CD206 de ratón, Tinte-
anti-CD206, y demostró su potencial en la visualización no invasiva de TAM en vivo por imágenes
NIRF usar tintes de anti-CD206. Se evaluó la eficacia de tinte anti-CD206 en el modelo de cáncer de
mama 4T1 de ratón, en el que tanto los macrófagos y las células tumorales eran de origen murino.
Creemos que este modelo imita mejor la situación clínica en comparación con un modelo de ratón
que lleva xenoinjertos de tumores humanos. Se observó que la línea celular de macrófagos RAW
264.7, pero no las células tumorales 4T1, expresa CD206. Con los estudios microdistribución
intratumoral, se confirmó que el tinte anti-CD206 localiza en los macrófagos de los tejidos
tumorales 4T1 (Figura Figure33B).
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