Informe de laboratorio guía N° 3.

Fisiología bacteriana.

NOMBRE:
CARRERA: Tecnología en Análisis Químico.
ASIGNATURA: Microbiología Aplicada.
PROFESOR:
FECHA:
1 Introducción.

Las bacterias pueden obtener su energía a través de distintos requerimientos nutricionales, gracias
a los cuales se logra identificar el tipo de bacteria el cual se está investigando.
En el laboratorio se utilizaron dos bacterias diferentes, una es E. coli y la Klebsiella
Estas bacterias se utilizaron para realizar diferentes pruebas bioquímicas que permiten obtener
información acerca del microorganismo con el que se está trabajando. Además las pruebas se
basan en la identificación o presencia de enzimas y si utilización de carbohidrato por distintos
medios.
Las pruebas bioquímicas fueron las siguientes:
Caldo rojo fenol, tanto para glucosa como para lactosa. Este caldo mide si el microorganismo es
capaz de degradar el carbohidrato para producir crecimiento, también a través de la campana de
Durham se visualiza la producción de gas y gracias al indicador de rojo fenol de pH7,4 la reacción
positiva se ve por el cambio de color de rojo a amarillo.
El caldo nutritivo y agar nutritivo se utilizó para ver solo si existía crecimiento o no de las
bacterias.
El agar citrato de color inicial verde se utiliza para de diferenciación de enterobacterias,
principalmente su capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. Gracias a su
indicador de ph azul de bromitimol la reacción puede ser clasificada en positivo o en negativa ya
que al utilizar citrato como fuente de carbono la solución vira a un color azul intenso al poseer la
enzima citrato permeasa permite el desdoblamiento del citrato obteniendo oxalacetato y piruvato.
El agar TSI es un medio de cultivo en el cual se diferencian las enterobacterias que son
fermentativas de lactosa, glucosa, sacarosa y producción de ácido sulfhídrico. Esta prueba tiene
tres posibles resultados ya que analiza lo visto anteriormente y además la producción de gas.
Utiliza los carbohidratos mencionados anteriormente, tiosulfato de sodio para detectar la
producción del ácido y el indicador rojo de fenol con el cual podemos observar el cambio de color
de dos formas:
1. Ambos colores en el tubo, mitad rojo y mitad amarillo (R/A)
2. Cambio completo amarillo (A/A).
Pare identificar la producción de ácido se observa un ennegrecimiento en la zona y la producción
de gas de observa y que produce burbujas y hasta rompimiento del agar.
Al igual que el agar TSI , el agar LIA tiene tres posibles resultados. Posee glucosa como fuente de
carbono además de lisina para la identificación de enzimas decarboxilasa y deaminasa, por otro
lado también posee tiosulfato de sodio, amonio y citrato de hierro para la producción de ácido
sulfhídrico y su indicador de ph es el purpura de bromocresol.
Cuando el color vira completamente a amarillo es porque no presentan actividad lisina
decarboxilasa, por el contrario su color seria purpura.
Y al igual que el anterior la producción de ácido se observa por ennegrecimiento y la producción
de gas por burbuja o rompimiento del agar.
La prueba del MR-VP se utiliza para realizar el ensayo rojo de metilo y Voges Proskauer e
identifica enterobacterias.
Estas pruebas requieren de la incubación previa para poder adicionar gotas de rojo de metilo a un
tubo para la identificación de productos finales ácidos, como pudieran se ácidos lácticos, acéticos
o fórmicos y al otro tubo se le adicionan de 6 a 8 gotas de hidróxido de potasio al 40% seguido de
1 ml de solución alcohólica alfa naftol al 5% para identificar la presencia de productos finales
neutros como lo son acetilmetil carbinol.
Ambas reacciones viran a un color rojo.
Y por último la prueba es el MIO en el cual la identificación de enterobacteriaceae se basa en su
movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol. Esta prueba tiene tres
resultados que identifican movilizad a través de la turbiedad, reacción positiva de la ornitina por el
color purpura del medio vire a amarillo por el indicador de ph purpura de bromocresol y el indol
que se produce a través del triptófano, este resultado solo puede ser visto una vez analizado los
dos anteriores y para esto se necesita el reactivo de Kovac´s que atreves de un anillo rojo indica el
resultado positivo.
Con todas estas pruebas bioquímicas realizamos el cultivo de las dos bacterias para obtener los
resultados descritos más adelante.

2 Objetivos.

Objetivo general.
 Realiza la identificación de bacterias mediante reacciones químicas.

3 Materiales y metodología.

Materiales.
Asa loop. Agares y caldos:
Asa recta.  Rojo fenol lactosa.
Porta objetos.  Rojo fenol glucosa.
Cultivo bacteriológico:  Rojo metilo.
 E coli.  Voges Proskauer.
 Klebsiella  Citrato.
 Nutritivos (agar y caldo).
 LIA.
 MIO.
 TSI.
 Metodología.

Para cada caldo.

 Esterilizar el asa loop a la llama.

 Destapar y flamear tubo.
 Tomar el inoculo, flamear tubo y cerrar.
 Abrir el tubo con caldo flamear.
 Transferir al tubo.
 Flamear, cerrar y esterilizar el asa loop.

Para cada agrar.

 Esterilizar el asa recta a la llama.
 Destapar y flamear tubo.
 Tomar el inoculo, flamear tubo y cerrar.
 Abrir el tubo con caldo flamear.
 Transferir al tubo pinchando y generando una estría.
 Flamear, cerrar y esterilizar el asa loop.

Para semi sólido.

 Esterilizar el asa recta a la llama.
 Destapar y flamear tubo.
 Tomar el inoculo, flamear tubo y cerrar.
 Abrir el tubo con caldo flamear.
 Transferir al tubo, pinchar.
 Flamear, cerrar y esterilizar el asa loop.

Después de incubación por 48 horas.

Al tubo que contiene la prueba MIO agregar gotas del reactivo de Kovac´s.
A un tubo de la prueba MRVP agregar gotas del indicador rojo de metilo.
Al otro tubo de la prueba MRVP agregar de 6 a 8 gotas de Hidróxido de Potasio 40% y 1 ml de
alfa naftol 5%.
4 Resultados.

1 Tabla resultados E. coli.

Prueba TSI
Fermentación H2 S Gas
A/A - +

2 Tabla resultados E. coli.

Prueba LIA
Fermentación H2 S Gas
K/K - -

3 Tabla resultados E. coli.

Prueba MIO
Indol movilidad Descarboxilación de la
ornitina
Anillo rojo + +

4 Tabla resultados E. coli. Prueba Citrato

Coloración Utilización de citrato.

Color verde -

5 Tabla resultados E. coli. Prueba rojo fenol

lactosa y glucosa
Carbohidrato Coloración Fermentación.
Lactosa Amarillo +
Glucosa amarillo +

6 Tabla resultados E. coli. Prueba MR-VP

Rojo de metilo Voges Proskauer

+ -
1 Tabla resultados Klebsiella
Prueba TSI
Fermentación H2 S Gas
A/A + +

2 Tabla resultados Klebsiella

Prueba LIA
Fermentación H2 S Gas
K/K + +

3 Tabla resultados Klebsiella.

Prueba MIO
Indol movilidad Descarboxilación de la
ornitina
Sin anillo - -

4 Tabla resultados Klebsiella. Prueba Citrato

Coloración Utilización de citrato.

Color azul +

5 Tabla resultados Klebsiella. Prueba rojo fenol

lactosa y glucosa
Carbohidrato Coloración Fermentación.
Lactosa Amarillo +
glucosa amarillo +

6 Tabla resultados Klebsiella. Prueba MR-VP

Rojo de metilo Voges Proskauer

+ +
5 Discusión.

La bacteria E. coli pertenece a la familia de las enterobacterias Gram negativa

Los cultivos TSI y LIA nos demostraron que nuestra bacteria es productora de gas al fermentar
la glucosa al observar una burbuja. También nos indica no puede generar ácidos sulfhídricos al
no utilizar el tiosulfato para su producción. A su vez como los nutrientes utilizados fueron
peptonas y extractos si pudo fermentar la glucosa.
En el cultivo MIO se visualizó producción de indol por lo que utilizo el triptófano ya que no
contiene la enzima triptofanasa. También posee la enzima ornitina decarboxilasa ya que
decarboxilo la ornitina presente y presento turbiedad que significa la movilidad de la bacteria.
En los cultivos de rojo fenol tanto con lactosa como con glucosa ya sabemos que la fermentan
ya que degrada estos carbohidratos.
En los cultivos de MRVP podemos observar que es capaz de producir ácidos gracias a la
fermentación de la glucosa dando positivo a la prueba de rojo de metilo. Pero no puede
producir productos neutros como acetilmetil carbinol ya que la prueba da negativo.
Por ultimo en el agar citrato la bacteria no puede utilizarlo como única fuente de carbono ya
que no posee la enzima citrato permeasa.

La bacteria Klebsiella también es una enterobacteria Gram negativa.

En los cultivos TSI y LIA la bacteria nos demuestra que puede generar ácidos sulfhídricos a
través de tiosulfato, además es fermentadora de la glucosa presente como peptonas y extractos
y también produce gas al romper el agar.
En el cultivo MIO la bacteria da negativo a las tres pruebas por ende no puede producir indol
a través del triptófano del agar, además de no visualizar movilidad y no presenciar el cambio
de color.
En los cultivos de MRVP la prueba dio positivo para Voges Proskauer lo que nos indica que
puede generar productos neutros ya que se produce la oxidación del acetilmetil carinol en
diacetilo el cual reacciona con la peptona dando un color rojo.
En el agar citrato la bacteria puede utilizarlo como única fuente de carbono ya que posee la
enzima citrato permeasa.
6 Conclusión.

Bibliografía.

Caldos y agares (LaboratoriosBritania,pdf,2015)