PROTEASAS EXTRACELULARES PRODUCIDAS POR BACTERIAS MARINAS

AISLADAS DE
AGUAS CONTAMINADAS CON EFLUENTES PESQUEROS.

INTRODUCCIÓN
Las bacterias marinas son las que se pueden clasificar por su naturaleza psicrotroficas y halotolerantes,
realizan los procesos metabólicos de acuerdo a su baja temperatura, son productores de metabolitos y de
la encima extracelular, las bacterias productoras de proteasas pueden usarse en procesos industriales. Estas
enzimas ayudan a buscar microrganismos que puedan ser empleados en la productividad alimenticia a
partir de los medios marinos, con la finalidad de seleccionar bacterias proteasas extracelulares de intereses
o aplicación biotecnológica procedentes de zonas marinos contaminadas con efluentes pesqueros.

MATERIALES Y METODOS

MUESTRAS DE EFLUENTES
se tomaron bacterias de efluentes pesqueros de la Fábrica de consorcio APROPISCO en la Playa Lobería ,
también se tomaron efluentes del terminal Pesquero de Ventanilla
 Recolección de muestras
Se tomó 30 muestras de agua de mar contaminadas por efluentes pesqueros y recolectaron en frasco
esterilizados de 250ml, las muestras recogidas fueron llevadas al laboratorio de Microbiología de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, El Aislamiento de bacterias, se realizó diluciones de (10-1,
10-2 ...10-5) se usó agua de mar filtrada , el recuento de bacterias se hizo sembrando alícuotas de 0,1ml de
dilución en agar Marino
 Elección de cepas proteolíticas
Para conocer la capacidad protealitca de las cepas se procedió a tomar 10ml de cultivo y se repicaron en
AM suplementado con caseína al 1%, pH 8,0. Los cultivos pasaron hacer incubados a 25°C por un tiempo
de 5 dias , la capacidad hidrolítica de las cepas fue conocida mediante los halos alrededor de las colonias ,
estas cepas se mantuvieron en AM semisólido con el 10% de glicerol para poder realizar pruebas siguientes
.
 Optimización de los parámetros de crecimiento
Se tomó 5 cepas seleccionadas CM43, CM44, CM45, CM46 y CM48, y se sembró en caldo Marino con
caseína 1% y fueron realizados en diferentes temperatura y un Ph (5,0; 6,0; 8,0; 9,0 y 10,0) con una
concentración de NaCl (0, 3, 6, 9 y 10%). Los cultivos fueron incubados por 5 días.

 Evaluación de la actividad proteolítica.

Se reactivaron las cepas con CM y luego se sembró 1ml de cultivo 106UFC /m en frascos conteniendo100
mL de CM suplementados con caseína al 1%, a pH 8,0 e incubados a 25 ºC con Proteasas extracelulares
producidas por bacterias marinas se comenzó agitar repetitivamente. se tomó sobrenadante de cultivo y se
le coloco al momento de salir de la centrifugación a 2500rpm por unos 10 minutos a una temperatura de
4°C , dichas pruebas fueron hechas durante 24h hasta obtener 96h , la mezcla se realizó en tubo de 1ml de
la solución de caseína , con un pH de 8.0 y se le agrego de 0.2 y 1ml de sobrenadantes. Se incubo en baño
maria se adiciono 2ml de ácido tricloroacetico, se procedió a centrifugar a 2500rpm a temperatura ambiente
a los sobrenadante se le midió su densidad y se realizó el mismo proceso con las siguientes cepas La unidad
de actividad fue definida como la cantidad de enzima que libera un micro mol de aminoácidos por minuto
por mL o miligramo de proteína.

 Caracterización fenotípica de las bacterias Aisladas

Para conocer la característica fenotípica de las cepas CM43, CM44, CM45, CM46 y CM48 se usó métodos
con tubos y placas para todas las pruebas se usó el CM o AM y el pH 8,0. Se incubo a 25°C y se
comenzaron a realizar los estudios de las cepas para conocer su caracterización y morfología.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 Cepas con actividad proteolítica

El comportamiento proteolitico de las 26 cepas aisladas a partir de muestras de agua de mar contaminadas
con efluentes pesqueros la cepa CM48 obtuvo más actividad enzimática , la actividad enzimática de los
invertebrados obtuvieron mas cantidad de actividad multienzimatica de proteolítica , las 5 cepas mostraron
halos de actividad inferiores a 11mm de diamentro
 Determinación de los parámetros óptimos de crecimiento
Se observó que la mayoría de las cepas crecen en presencia de cloruro de sodio, dichas cepas han sido
llamadas como aloctonas que ya se enseñan a las condiciones marinas
Las cepas CM43, CM45 yCM48 crecieron en el medio hasta 10% de NaCl pero la cepa CM48 no creció en
ausencia de sal y fue considerada cepa autóctona , se realizaron investigaciones para conocer las bacterias
con algo nivel de sal y son las bacterias Pseudomonas y Acinetobacter y un menor porcentaje a
Flavobacterium y Caulobacter y algunos Gram positivos como Bacillus y Micrococcus. Y se realizaron
mediante diferentes pH .En cuanto al perfil térmico, cuatro de ellas (CM44, CM45, CM46 y CM48)
crecieron en 8 a 44°C , con excepción de la CM43 que creció a una temperatura de 37°C .

 Evaluación de la actividad proteolítica

Se conoció que la sepa CM48 es del genero Pseudomonas sp, y presente una actividad enzimática frente a
la caseína de 1% y a diferentes volúmenes de los crudos enzimáticos.

Ilustración 1Caracterización fenotípica de 5 cepas de bacterias con actividad proteolítica sobre

Se realizaron evaluación con crudos de cultivos con diferentes tiempos de incubación de 24horas hasta 96
, la actividad más alta es la cepa CM48 con actividades enzimáticas de 9,91 y de 10,37 U/mL y actividades
específicas de 17,38 y 17,76 U/mg , se empleó una cepa de Flavobacterium indolegenes en cultivo de
medio Horikoshi , también usaron la actividad proteolítica de 8 cepas Pseudomonas aisladas de biotopos
costeros antárticos .Las proteasas mostraron actividades de 1700 U/L a 1x105 U/L en extractos de cultivos
de 48 a 72 h a 20 °C..Las proteasas mostración una actividad de 1700U/L a 1x105 U/L en extractos de
cultivos de 48 a 72 h a 20 °C. se estudió la actividad de protealitica crudos que fueron producidas por
levaduras marinas Pichia y Debaromyces cultivados en el medio Papa Dextrosa con caseína al 1% e
incubados a temperatura ambiente por 4 días.se evaluo que luego de 4 dias de incubación en medio AM la
cepa CM48 presento mayor actividad enzimática con Pseudomonas sp. La actividad proteolítica de 5
cepasmarinas (CM43, CM44, CM45, CM46 y CM48) comparadas con otros trabajos mencionados resultan
ser interesantes para continuar los estudios relacionados a mejorar las condiciones de crecimiento y
producción de enzimas proteolíticas extracelulares en microorganismos marinos.

 Caracterización fenotípica
Se demostró que las 5 cepas tenían forma bacilares o cocobacilares, Gram negativas , móviles , flagelares,
catalasa y oxidasa positivas , son pertenecientes a Aeromonas las cepas CM43, CM44 y CM46, la CM48
pertenece a Pseudomonas y Alcaligenes cepa CM45. También se realizaron estudios con muestras que eran
del ambiente marino como agua , organismo bentónicos , invertebrados , se aislaron bacterias con actividad
protealitica que pertenecían al género Pseudomonas, Vibrio, Flexibacter,Moraxella, Bacillus y
Flavobacterium., también se realizaron estudios con cepas bacterianas y se encontró levaduras marinas
con actividad proteolítica sobre la caseína perteneciente a los géneros Pichia y Debaromyces.

CONCLUSIONES
Las bacterias marinas que producen proteasas y otras exoenzimas son más usadas en la actualidad en las
industrias y presentan alga concentración de NaCl por sus características estas bacterias marinas tienen gran
importancia a nivel industrial, ofrecen alternativas para ayudar en el proceso de aguas contaminadas con
efluentes pesqueros .Los resultados mostraron que la cepa con mayor actividad proteolítica correspondió
al género Pseudomonas sp. Se considerada esta cepa como autóctona de ambientes marinos por crecer
óptimamente en pH alcalino y requerir de condiciones halófilas y psicrófilas moderadas.