Prueba de Fragilidad

osmotica

Paola Cea
Tecnologia Medica, UCT
Hematologia Clinica
Profesor, Hugo Delgado
Introducción
Debido a que, en distintos tipos de Anemias hemolíticas, en especial en las
membranopatias, como por ejemplo, la Esferocitosis hereditaria, se basan en la historia
clínica del paciente, el hemograma y la observación morfológica de la sangre periférica, el
cual se debe complementar con distintas pruebas, las cuales pueden ser la Fragilidad
osmótica de los eritrocitos, la susceptibilidad de los eritrocitos a la criofragmentación y la
cuantificación de la banda 3 en la membrana de los eritrocitos. La elección de la prueba de
laboratorio más adecuada para el diagnóstico de Esferocitosis hereditaria se basa en sus
sensibilidad y especificidad, complejidad y costo eficiente. Debido a su complejidad y precio,
la prueba de Fragilidad osmótica es la de elección, mientras que las pruebas más complejas
donde hay un estudio de proteínas de membrana y estudios moleculares de genes se realiza
en centros especializados o de referencia.

Prueba de Fragilidad osmótica:

Fundamento:
La prueba de fragilidad osmótica, mide la resistencia de los eritrocitos a la hemolisis frente
a condiciones de tensión osmótica. Esta resistencia depende de la relación
superficie/volumen de los GR y de la función de la membrana. Los eritrocitos normales
pueden aceptar, sin hemolizar, una entrada de agua y aumentar su volumen hasta un 70%,
mientras que los esferocitos, con una relación superficie/volumen disminuida, tienen la
capacidad mucho menor y hemolizan en soluciones salinas de menor hipotonía, es decir
más próximas al suero fisiológico. El aumento de la Fragilidad osmótica de los esferocitos
condiciona su forma esférica (menor relación superficie/volumen), independientemente de
la causa de la esferocitosis.
Para realizar la prueba de FO se incuban pequeños volúmenes de sangre en soluciones
salinas con un gradiente de concentración de isotónico a hipotónico, y la hemólisis en cada
uno de los tubos se determina mediante espectrofotometría. La prueba se realiza a
temperatura ambiente (prueba inmediata) y después de 24 h de incubación a 37 °C (prueba
incubada), y los resultados se representan mediante una gráfica que tiene forma sigmoide.
Los eritrocitos con alteraciones de la membrana muestran una FO más aumentada después
de la incubación durante 24 h a 37 °C, lo que incrementa la sensibilidad de la prueba. Ello
obedece al aumento del volumen de la célula producido por un exceso de entrada de sodio
que supera la pérdida de potasio, ya que con la incubación se produce un fallo del
transporte iónico secundario a la disminución de glucosa del medio, imprescindible para el
mantenimiento del ATP, o energía celular.

Muestra:
Se utiliza sangre heparanizada. No deben utilizarse anticoagulantes como oxalato, el EDTA
o citrato, debido a su efecto sobre la concentración salina del medio hipotónico
Procedimiento:
 Se prepara una batería de 12 tubos numerados donde a partir de la solución stock
de NaCl al 1% se preparará 1 ml de solución a cada tubo, diluyendo con agua
destilada.
 Las soluciones deben ser equivalentes a: 0.85%, 0.75%, 0.65%, 0.60%, 0.55%, 0.50%,
0.45%, 0.40%, 0.35%, 0.30%, 0.20%, 0.10%
 Tapar con parafilms y mezclar, luego agregar 100 ul de muestra a cada tubo, volver
a tapar y mezclar
 Centrifugar por 5 minutos a 2000 rpm, extraer el sobrenadante y desde allí leer
espectrofotométricamente a 540 nm, tomando como blanco el tubo con mayor
concentración de NaCl

Análisis de resultados:
Normal:
Tubo Abs. Tubo % Hemolisis Lisis % Lisis %
N. min N. max
T1 0.000 0 0 0
T2 0.054 4.49 0 0
T3 0.138 11.49 0 0
T4 0.192 15.98 0 0
T5 0.194 16.15 0 0
T6 0.142 11.82 0 6
T7 0.198 16.48 5 45
T8 0.156 12.98 50 95
T9 0.120 9,9 90 99
T10 0.603 50,21 97 100
T11 0.809 67,36 100 100
T12 1.201 100 100 100
Grafico:

% Lisis / [NaCla]
120

100

80

60

40

20

0
T12 T11 T10 T9 T8 T7 T6 T5 T4 T3 T2 T1

Normal

Patológica:
Tubo Abs. Tubo % Hemolisis Lisis % Lisis %
N. min N. max
T1 0.022 3,1 0 0
T2 0.014 1,9 0 0
T3 0.004 0,5 0 0
T4 0.018 2,5 0 0
T5 0.007 0,9 0 0
T6 0.054 7.6 0 6
T7 0.291 41.2 5 45
T8 0.480 67,9 50 95
T9 0.639 90,5 90 99
T10 0.675 95,6 97 100
T11 0.691 97,8 100 100
T12 0.706 100 100 100
 Patológico
120

100

80

60

40

20

0
T12 T11 T10 T9 T8 T7 T6 T5 T4 T3 T2 T1

Patológico

120

100

80

60

40

20

0
T12 T11 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12

Normal Patológico
Conclusiones:
Los resultados obtenidos durante la prueba, en el caso de la muestra patológica no se
correlacionan, con los establecidos según los resultados normales, esto puede ser ya que se
empleó un anticoagulante el cual afecta la concentración salina del medio hipotónico
Otra interferencia, puede ser al momento de sacar el sobrenadante, que se secara parte del
botón celular desprendiéndolo, esto se ve ya que las absorbancias obtenidas no van en
forma creciente.
Bibliografia:
Joan Lluis Vives Corrons, Josep Lluis Aguilar Bascompte. (2014). Manual de Técnicas de
laboratorio en Hematología. Barcelona, España: Elsevier