Pruebas de sensibilidad in vitro

en levaduras y hongos miceliales

Susana Córdoba
INEI. ANLIS. “Dr. C. Malbrán”
scordoba@anlis.gov.ar
UCA, 26 de Junio 2013
 Miércoles 26 de Junio, 2013

M27-A3, CLSI
Levaduras
Microdilución EDef 7.2 Revision, EUCAST

M38-A2, CLSI
Miceliales
EDef 9.1 EUCAST

Tabletas
Difusión Discos
Etest

Ventajas e inconvenientes

Departamento Micología. INEI ”Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Candida spp., y
Cryptococcus neoformans
Sensibilidad in vitro

Departamento Micología. INEI Dr. C. Malbrán SBC, 2013

Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos

Métodos de Referencia

Levaduras Hongos miceliales

Microdilución Difusión Microdilución Difusión

M27-A3. CLSI M44-A3. M38- A2. CLSI

aislado M51–A. CLSI
EDef. 7.2 EUCAST CLSI
EDef. 9.1
EUCAST

Sistemas comerciales
Obtención de colonias
puras Levaduras/ miceliales Levaduras

Difusión Microdilución

Tiras Disco/Tableta Galerías

Tarjetas
Placa

Departamento Micología. INEI Dr. C. Malbrán SBC, 2013

 Levaduras
Determinación de la sensibilidad in vitro

Microdilución
Antifúngico CCCE
M27-A3/M27-S4, 2012, CLSI
•Candida spp., Cryptococcus sp.

EDef 7.2. revision, 2012, EUCAST

•Candida spp., Cryptococcus sp.

Difusión en agar

M44-A2/M44-S3, 2009
•Candida spp.

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M27-A, CLSI
Método:
• Macrodilución y microdilución

•Medio: RPMI 1640, pH 7

•Inóculo: 0,5-2,5 x 103 UFC/mL
•Placas estériles con fondo en U
•Incubación: 35º C durante 48 y 72 h
•Determinación de la CIM: visual

Control de calidad:
•Candida krusei ATCC 6258
•Candida parapsilosis ATCC 22019

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M27-A3. CLSI
Preparación del inóculo

Incubación 35º-37ºC
24 h Candida spp.
48 h C. neoformans 3-5 colonias  1 mm en 5 mL
de solución salina estéril
Agar
Sabouraud

Escala McFarland
Ajustar a la DO a 0,5
McFarland, 530 nm

1-5 x 106 UFC/mL

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M27-A3. Preparación de las placas

100 µL Antifúngicos (µg/mL) 2X + RPMI

64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,12 0,06

CC CE

ATCC 22019

Muestra A

Muestra B
0,25
Muestra C

Muestra D

Muestra E

Muestra F

ATCC 6258

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M27-A. Inoculación de la microplaca
1- 5 x 106 CFU/mL 1 - 5 x 103 CFU/mL

1: 1000

100 L inóculo (2X) 1-5 x 103 UFC/mL

¿?

50-250 células /200 µL

32 16 8 4 2 0,06 CC CE
100 µL 200 µL
RPMI RPMI
100 L RPMI + antifúngico (2X)
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 M27-A. Incubación

35ºC

• Candida spp. : 48/24 horas

• Cryptococcus neoformans : 72 horas
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 M27-A. Lectura de resultados

La CIM es la concentración más baja de

antifúngico que inhibe sustancialmente
el crecimiento del microorganismo
detectado visualmente

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M27-A. Interpretación de resultados

 O = ópticamente claro
 1 = ligeramente turbio
 2 = disminución prominente de la turbidez
 3 = ligera disminución de la turbidez
 4 = sin disminución de la turbidez

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 CLSI, Lectura visual

CC

CE

4 0

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 CLSI, Lectura visual

CIM
Ligeramente
turbio
CC

CE

0 0 0 0 0 0 1 2 3? 3? 4 0
Ligera disminución
de la turbidez

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 EDef 7.2, Revision
EUCAST, 2012

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M27-A3. Preparación de las placas

100 µL Antifúngicos (µg/mL) 2X + RPMI

64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,12 0,06

CC CE

ATCC 22019

Muestra A

Muestra B
0,25
Muestra C

Muestra D

Muestra E

Muestra F

ATCC 6258

Departamento Micología. INEI “Dr. C.. Malbrán” SBC, 2013

 EDef 7.2, EUCAST
Inóculo
•Subcultivo en SAB 18-24 h, 35 - 37°C
•5 colonias aisladas ≥1 mm diámetro en 5 mL,
ADE
•DO de 0,15 a 530 nm
•~ 1-5 x 106 UFC/mL
•Diluir 1: 10 en agua
•~ 1-5 x 105 UFC/mL
•Dispensar 100 µL por pocillo
•~ 0,5-2,5 x 105 UFC/mL
Incubación
•35 - 37 °C
•Estáticas
•24 h

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 EDef 7.2 EUCAST, Lectura

Espectrofotómetro a 530 nm (405 o 450 nm )

Restar el blanco (columna 12) del resto de pocillos
La DO del CC debe ser ≥ 0.2
Si no creció a ≥ 0.2, reincubar otras 24 h.
CIM para azoles, 5FC y equinocandinas, es la
inhibición del 50% comparada con el control de
crecimiento

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Lectura con espectrofotómetro

0.6
0.55
100%
0.5
0.45
0.4
Optical Density

0.35
0.3 50%
0.25
0.2
0.15
0.1 MIC
0.05
0
GC 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 www.eucast.org

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Características del M27-A3 (CLSI) y del EDef. 7.2
Revision (EUCAST)
Variable M27-A3, CLSI EDef. 7.2, EUCAST

Macrodilución en caldo, 1 mL
Método Microdilución en caldo, 0,2 mL
Microdilución en caldo, 0,2 mL

RPMI 1640-2% glucosa con

Medio RPMI 1640 con 0,165 M MOPS, pH 7
0,165 M MOPS, pH 7

Candida spp., Cryptococcus Candida spp., Cryptococcus

Microorganismos
neoformans neoformans

Inóculo 0,5-2,5 x 103 UFC/mL 0,5-2,5 x 105 UFC/mL

Temperatura de
35ºC 35ºC
incubación

Tiempo de Candida spp., 24 y 48 h Candida spp., 24 y 48 h

incubación Cryptococcus neoformans 70-74 h Cryptococcus neoformans 48 h

Determinación de la
Visual Espectrofotométrica
CIM

Microplacas Fondo U Fondo plano

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 Métodos para estudios de
sensibilidad en hongos miceliales

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Pruebas de sensibilidad para hongos
miceliales (microdilución)

Estado actual
CLSI EUCAST
1991, 1995, 1997
Espinel-Ingroff, 2010 2006
Documento
Preparación del inóculo; M51- EDis 9.1
Bases para macro y A
microdilución
1998, M38-P, Difusión en agar!!!!
(propuesto)
2002, M38-A, Estándar
aprobado
2008 2008
Estándar aprobado 2da edición EDef 9.1
M38-A2
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 Pruebas de sensibilidad para hongos
miceliales

ANTIFÚNGICOS

ANFOTERICINA B FLUCONAZOL
FLUOROCITOSINA ITRACONAZOL
KETOCONAZOL
POSACONAZOL
RAVUCONAZOL
EQUINOCANDINAS VORICONAZOL
CICLOPIROX
GRISEOFULVINA
TERBINAFINA

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Pruebas de sensibilidad para hongos
miceliales

MEDIO DE CULTIVO

RPMI 1640
L-glutamina
+ 0,165 M MOPS

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M38-A2
Preparación del inóculo
No-dermatofitos

1 mL 0,85% Sol.
salina estéril

3-5 mL Sol. sal. estéril

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Ajuste de inóculo (530 nm)
Especie Densidad
óptica
Aspergillus spp.,
Paecilomyces lilacinus, P. variotti
Exophiala dermatitidis,
Sporothrix schenckii 0,09-0,13

Fusarium spp.,
S. apiospermum, Ochroconis gallopava,
Cladosporium bantiana,
R. oryzae y otros Zygomycetes 0,15-0,17

Bipolaris spp., Alternaria spp. 0,25-0,3

Con estos valores se obtienen valores de inóculo:

106 UFC/mL

1:50 0,4 - 5 x104 UFC/mL

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 Preparación del inóculo

Dermatofitos:
103 esporas/mL en
hematocitómetro

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 Control del inóculo

inóculo

1:10

10 L

Incubar a 28-30ºC / 24 h – 7 días

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 CLSI, Inoculación de la placa

Inóculo (2X) con/sin Azul de Alamar

100 L

32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 CC CE

64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12

100 L RPMI + antifúngico

(2X)
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 CLSI, Determinación de la CIM

Lectura VISUAL

Las placas se colocan en un espejo

para lectura de placas de microdilución

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

Candinas:
•anidulafungina,
•caspofungina,
•micafungina

Concentración mínima
efectiva (MEC)
Mejor reproducibilidad

MEC: es la menor
concentración de
antifúngico que produce
lesión apical de las hifas
con formación de
agregados miceliales
redondos y pequeños
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 Caspofungina ug/ml. MEC. Aspergillus flavus.

Control crecimiento 0,015 0,03 0,06

0,12 0,25 0,5 1

MEC

2 4

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 M38-A2. Interpretación de los resultados

Todavía no están establecidos los puntos de corte

Hay propuestas de puntos de corte para AMB, ITZ, POSA, VCZ, y

CASPO.

•Sensibles CIM o MEC ≤1 mg/L

•Intermedio CIM o MEC 2 mg/L
• Resistente CIM o MEC ≥4 mg/L

•Para Aspergillus spp., ITZ, POSA, VCZ, AMB y CASPO.

•Scedosporium apiospermum, Paecilomyces lilacinus, POSA, VCZ.

•Alternaria spp., Bipolaris spicifera, ITZ, POSA, VCZ.

•Mucoromicetes spp., AMB y POSA.

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 EDef 9.1 (EUCAST)
para miceliales

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Composición y tamaño del inóculo

Fusarium spp.
•Macroconidios de 11 a 80 µm
•Microconidios de 4 a 8 µm
Esporas
Aspergillus spp. e
•Conidios de 2-7 µm hifas
mezcladas

Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C. Malbrán SBC, 2013

 EUCAST. Preparación del inóculo

4-5 mL de Agua destilada

APD; 35ºC
Viernes al Lunes

1 2 3
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 EUCAST.Preparación del inóculo

Filtro 11 µm

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Características del M28-A2 (CLSI) y del EDef 9.1 (EUCAST)

Variable M38-A2, CLSI EDef. 9.1, EUCAST

Macrodilución en caldo, 1 ml
Método Microdilución en caldo, 0,2 ml
Microdilución en caldo, 0,2 ml
RPMI 1640 con 0,165 M MOPS, RPMI 1640-2% glucosa con 0,165 M
Medio
pH 7 MOPS, pH 7
Aspergillus spp., Fusarium spp.,
Rhizopus spp.,
Pseudallescheria boydii,
Hongos miceliales formadores de
Microorganismos Zygomycetes, hongos
conidias
oportunistas hialinos y
dematiaceos, forma micelial de
Sporothrix spp, dermatofitos.

Inóculo 0,4-5 x 104 UFC/ml 0,5-2,5 x 105 UFC/ml

Alternaria spp. se incuba a 30ºC,

48 a 72 h.
Rhizopus spp., 35ºC, 21 a 26 h.
Temperatura y
Fusarium spp., Aspergillus spp. En general, 35ºC, durante 24-48 h
tiempo de
y la mayoría de los miceliales Mucorales 35ºC, 24 h
incubación
oportunistas 35ºC, 46 a 50 h.
Scedosporium spp. 35ºC, 70 a
74 h.

Lectura de la CMI Según la especie de 24 a 96 h Según la especie de 24 a 48 h

Determinación de
Visual Visual
la CIM

Microplacas Fondo U Fondo plano

Departamento Micología. INEI “Dr. C.. Malbrán” SBC, 2013
 www.eucast.org

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Sistemas comerciales…

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Determinación de la CIM.
Sistemas comerciales
Paneles de microdilución Difusión en agar
Vitek 2, (bioMérieux): Etest (bioMérieux)
Candida spp. y Cryptococcus spp.,
Candida spp., Cryptococcus spp
VITEK 2 AST-YS01
ref. 22108

Fluconazol
Fluorocitosina
Anfotericina B
Voriconazol

Antifúngico
.

ATBFungus 3 (bioMérieux):
Candida spp. y Cryptococcus spp.

Anfotericina B
Voriconazol
Fluconazol
Fluorocitosina
Itraconazol

Puntos de corte:
Según M27-A3 (CLSI)
www.biomerieux.com/techlib
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 Difusión en agar

Tabletas Neo-Sensitabs

Medio de cultivo:
Agar Mueller Hinton + 2% G +
Azul Metileno

Inóculo: 106 UFC/mL

Tiempo de incubación: 24, 48 h Fluconazol Malbrán 25 ug

Temperatura: 35 C

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Pruebas de difusión
Factores determinantes

20 mL de medio

9 cm Ø Espesor del agar

4 mm

60 mL de medio

15 cm Ø

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Siembra de las placas
Siembra con hisopo

Colocación de discos/tabletas

20mm

Siembra por 40 mm
inundación

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Difusión en agar

Incubación posición correcta

Departamento Micología. INEI “Dr. C.. Malbrán” SBC, 2013

 Lecturas de las zonas de inhibición

Lectura manual

Lectura automatizada

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Fluconazol
Lectura del halo de inhibición

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Primero determinar la mejor
zona de lectura, tomando una
diagonal que corte al disco por
su centro

Segundo, determinar el halo

de inhibición, teniendo en
cuenta que corresponde a la
zona donde comienza a
disminuir el crecimiento de
las colonias.

Tercero marcar los puntos

que corresponden al
diámetro y medirlo

La zona de crecimiento irregular

(teniendo en cuenta la cantidad y
el tamaño de las colonias), no se
considera como resistencia

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 Difusión en agar

Tabletas Neo-Sensitabs. Halos de inhibición en aislamientos de Candida spp., (S) sensibles y ( R)

resistentes a itraconazol-fluconazol

S
R

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Etest

Colocación de las tiras

Antifúngico
Placa de 150 mm Placa de 90 mm

Medio de cultivo:
RPMI 1640 L-glutamina + 0,165 M MOPS
www.biomerieux.com/techlib

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Lectura de los halos de inhibición con tiras de Etest

R
S

Tiras de Etest. Halos de inhibición en aislamientos de

Candida spp., (S) sensibles y ( R) resistentes a
anfotericina B
T

Tiras de Etest. Halos de inhibición en aislamientos de

Candida spp., (S) sensibles a fluconazol con efecto de
arratre (trailing) (T)
Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013
 Vitek2 vs. CLSI, EUCAST, Sensititre y Etest
Cuenca-Estrella M, J Clin Microb, 2010

n=154
41 Candida albicans, 18 C. tropicalis, 17 C. parapsilosis, 16 C. glabrata, 22 C. krusei, 8 C. lusitaniae,
5 C. guilliermondii, 3 C. famata, 1 C. dubliniensis, 1 C. kefyr, 16 Cryptococcus neoformans, 3 Rhodotorula
mucilaginosa, 3 Dipodascus capitatus

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 ATBFungus3, Tabletas Neo-sensitabs Rosco, discos vs. E.Def 7.1 (EUCAST)

Concordancia entre el ATBFungus3 y el método de referencia: 90,2%.

ATBFungus 3 Difusión FCZ

Disco Tableta Neo
AMB 5-FC FCZ ITZ Malbrán Sensitabs

errores Very Major 0 1 2 3 0 3

errores Major 0 1 2 1 0 1

errores Minor 1 5 3 13 3 2

Candida spp.: C. albicans (n=37), C. tropicalis (n=18), C. glabrata (n=10), C. parapsilosis (n=9), C. krusei (n=4),
C. famata (n=1), C. guilliermondii (n=1), C. inconspicua (n=1), P. ohmeri (n=1)

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Otros métodos…
Tabletas, discos Malbrán,
Oxoid vs. EDef 7.1 (EUCAST)
Candida spp. n=200
Porcentaje de concordancia con el método de referencia

DISCOS TABLETAS DISCOS

MALBRÁN ROSCO OXOID
FCZ FCZ VCZ FCZ VCZ
91,0 78,4 95,08 81,96 95,08

Córdoba S y col, 2010 REIE, p 30:32.

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Métodos de difusión

Ventajas Inconvenientes
Subjetividad en la lectura de los halos
Simples de realizar
Lectura a 24 o 48 horas según las especies
y resultados rápidos. No todas las especies crecen bien en agar
RPMI 2% G
Identificar el inóculo
Carga de antifúngico apropiada
Reproducibilidad intra e interlaboratorio a

gran escala

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

 Y ahora a……….

Departamento Micología. INEI “Dr. C. Malbrán” SBC, 2013

MUCHAS GRACIAS!!
scordoba@anlis.gov.ar