Micro Guia Oficial

Microbiología General.
- Facultad de ciencias biológicas –UNA Puno
PRACTICA N° 1
(riesgo individual Eficaces y el riesgo de propagación es limitado, se puede
moderado, riego contaminar con microorganismos que producen enfermedades
poblacional reversibles.
bajo)
BIOSEGURAD E IDENTIFICACION DE MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN

MICROBIOLOGIA
A.- BIOSEGURIDAD
Es el conjunto de medidas preventivas de uso común, que tienen el objetivo de proteger
la salud frente a diferentes riesgos producidos por bacterias, parásitos, hongos, agentes
físicos mecánicos y químicos. Lo más importante que se debe practicar en el laboratorio
de Microbiología son los siguientes:
LAVADO DE MANOS. Antes de iniciar y terminar los procedimientos y cada vez que se
contaminen con sangre y otros fluidos corporales, lavarse y cepillarse fuertemente las
manos y antebrazos con un cepillo – esponja que no lastime.
USO DE GUANTES DE BIOSEGURIDA. Para todos los procedimientos analíticos se
debe utilizar guantes de bioseguridad y antes de quitarse de las manos debe lavarse
con hipoclorito al 10% por 5 minutos y luego sacarse los guantes, después de quitarse
los guantes debe lavarse las manos nuevamente.
BARBIJO Y PROTECCION OCULAR. Es necesario utilizar el barbijo y lente de
protección ocular, cuando se realice procedimientos con sangre y fluidos biológicos, ya
que los procedimientos pueden generar gotitas de sangre u otros líquidos corporales
para prevenir la exposición de la mucosa, la boca, nariz y ojos se debe utilizar lentes y
barbijo. Es recomendable utilizar barbijo y protección ocular descartable en caso de ser
de tela debe colocarse en una bolsa reja para su incineración.
PREVENIR LESIONES. Debe usarse cuidadosamente elementos cortantes, tanto
cuando se usan como cuando se limpian o descartan. Se recomienda utilizar elementos
descartables, preferible no hacerse heridas.
INSTRUCCIONES PARA EL DESCRATE DE ELMENTOS CORTANTES DE
CUALQUIER TIPO. Deben descartarse en recipientes contenedores rígidos, resistentes
y seguros para su futuro transporte. Una vez llenos los contenedores se tapan
herméticamente y se envían a incinerar.
OBJETIVO.-
Familiarizar, con el conocimiento y aprendizaje de las medidas de bioseguridad para no
contaminarse ni contaminar a los demás.
Como estudiantes de esta disciplina, es importante conocer los principios básicos de
seguridad en el trabajo con microorganismos, considerando los peligros relativos que
implican su manejo. De acuerdo con el potencial que tienen los microorganismos para
infectar al ser humano y los animales, se les ha clasificado en grupos de riesgo, que se
presentan en la Tabla 1
1
Microbiología General. - Facultad de ciencias biológicas –UNA Puno
TABLA 1 :
GRUPO DE RIESGO Consecuencias
Grupo de riesgo 1 Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
(riesgo individual y poblacional provocar enfermedades en el ser humano o animales.
escaso o nulo)
Grupo de riesgo 2 La exposición en el laboratorio puede provocar una
infección grave, pero existen medidas preventivas y
terapéuticas
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la bioseguridad, de cuantos niveles consta y que características posee cada
uno de estos
niveles?.................................................................................................................................
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2. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiología y un laboratorio
convencional………………………………………………………………………………………
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3. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo liquido bacteria no se derrama
sobre una
superficie……………………………………………………………………………………………
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4. ¿Cuáles son los riegos y problemáticas en el grupo que se tendrán al no seguir
las indicaciones
recomendadas?...................................................................................................
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5. Esquematice las señales de bioseguridad.
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B.- IDENTIFICACION DE MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN

MICROBIOLOGIA
OBJETIVOS:
 Que el alumno conozca las áreas de un laboratorio de microbiología los equipos,

materiales y reactivos utilizados en esta área, describiendo su uso.
 Conocer y preparar materiales en microbiología según estándares de calidad.
GENERALIDADES
La microbiología como ciencia maneja una gama de materiales, por eso es importante
realizar un reconocimiento del Laboratorio de Microbiología, debido a que maneja
equipos, materiales, reactivos y medios de cultivo especiales que son diferentes a un
laboratorio convencional, áreas que esta ocupa son: recepción de muestras,
preparación de materiales plaqueos, cultivo de microorganismos, microscopia lecturas,
así mismo la ubicación de los equipos como son la incubadora, autoclave, microscopio,
mechero de bunsen, esterilizador al seco o mufla y otros.
Material de laboratorio de Microbiología: 1, placas de Petri con medio de cultivo sólido;2,

tubos de ensayo con medio de cultivo liquido (caldo);3, tubos de ensayo con medio de
cultivo solido;4, matraz con brazo lateral para turbidimetria;5, mechero Bunsen;6
pipetas;7, microplacas de 96 pocillos;8, asas de siembra;9, espátula de Digralski o varilla
de vidrio;10, micropipeta automática;11, pipeteador manual;12, puntas de pipeta
automática;13, placas de Petri;14, Jarrar para el crecimiento de microorganismos
anaerobios;15, placas de contacto RODAC; 16, lengüeta o lamina para análisis de
superficies.
4
EL MICROSCOPIO
DIBUJE EL MICROSCOPIO Y COLOQUE SUS PARTES:
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1. DESCRIBA QUE FUNCION TIENE TODOS LOS COMPONENTES DEL

MICROSCOPIO.
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2. DESCRIBA LAS RECOMENDACIONES PARA UNA ADECUADA

CONSERVACION DEL MICROSCOPIO.
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3.- DIBUJE TODOS LOS EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS, MEDIOS DE

CULTIVO Y OTROS UTILIZADOS EN MICROBIOLOGIA.
EQUIPOS USO
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PRACTICA N°2
PREPARACION DE MATERIALES Y METODOS DE ESTERILIZACION
Objetivos:
1. Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de
esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso común de
Microbiología.
2. Conocer el efecto de las condiciones de la asepsia en el control de la

contaminación microbiana en el laboratorio.
INTRODUCCION
La esterilizaciones un método de eliminación total de todo tipo de organismo que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente
o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones,
resultados erróneos o pérdida del material biológico.
La esterilización por el calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor
frecuencia en el laboratorio de Microbiología. El calor seco destruye a los
microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de
un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Los procesos con calor húmedo
afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas se aplican para esterilizar
medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos
que se desechan.
El equipo de uso común es el autoclave que se utiliza vapor de agua la presión (15 lb /
presn); con esta presión el material alcanza una temperatura de 121° C y si se mantiene
durante 15 minutos se asegura la inactivación de endosporas, que son las estructuras
bacterianas más resistentes al calor.
Las formas de esterilización, se aplica de acuerdo el tipo de material que se va a
esterilizar los diversos métodos de esterilización se divide en:
1) Métodos físicos, halógenos, detergentes, entre otros.
2) Métodos químicos, en donde se utilizan substancias bactericidas o bacteriostáticas
como son alcoholes, fenoles, halógenos, detergentes, entre otros.
La elección del método de esterilización depende del tipo de material a esterilizar así
como la finalidad que se persiga. L a esterilización se realiza por tres métodos.
a) Calor Húmedo o vapor
b) Calor Seco
c) Calor Directo, calor, inmediata
a) Calor húmedo.-Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilización se hace
por el vapor a presión en una autoclave a 15 lb de presión, 121 °F por 15 minutos.
b) Calor Seco.-La esterilización se hace por medio de un horno denominado
esterilizador o mufla que permite alcanzar temperaturas más elevadas (150-180°C)se
utiliza más para la esterilización de material de vidrio (matraces,pipetas,cajas de
petri,etc) y en los instrumentos. La esterilización se efectúa directamente en la flama
del mechero.
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C) Calor Directo.-Se utiliza en asas bacteriológicas y aguas de inolocuación. La

esterilización se efectúa directamente en la flama del mechero.
La utilización de estos métodos, sugiere el conocimiento de las siguientes terminologías
1.-LIMPIEZA.-Es el proceso físico por el cual se elimina los objetos o elementos sucios
mediante el lavado con agua o sin detergente. Es indispensable para la preparación del
material antes de someterlo a desinfección o esterilización.
2.-DESINFECCIÓN.- La desinfección es el proceso mediante el cual se destruyen las
células vegetativas pero no las esporas de los agentes infecciosos.
3.-ESTERILIZACION.- Es el proceso que destruye todas las formas de vida, en sentido
microbiológico está libre de microorganismos vivos, en el laboratorio de microbiología
preferentemente se realiza por medio de vapor saturado a presión (autoclave).
4.-ANTISEPTICOS.- Una sustancia que se opone a la infección (sepsis) o previene
crecimiento o acción de los microorganismos , bien sea destruyendo o bien inhibiendo
su crecimiento asociado a sustancias aplicadas al cuerpo .se definen como agentes
germicidas para ser usados sobre la piel y los tejidos vivos , a diferencia de los
desinfectantes que se utilizan sobre los objetos inanimados , aunque algunos germicidas
específicos pueden ser utilizados para ambos fines (alcohol 70-90%)su afectividad no
es necesariamente la misma en cada caso, un buen antiséptico puede no ser eficaz
como desinfectante y viceversa.
PROCEDIMIENTO PARA ESTERILIZAR EL MATERIAL
Se denomina también, técnica de esterilización por calor húmedo y se utiliza el autoclave
lo cual se utiliza material fungible, contaminado, también para esterilización de medios
de cultivo.
AUTOCLAVE
 Procedimiento.-Lavar el material de vidrio (matraces)hasta dejarlos
perfectamente limpios y libres de sales , para lo cual se lavan y después se les
da un enjuague final con agua destilada empaquetar el material y llevar al
autoclave a 15lb de presión , 121 °C por 15 minutos .se coloca el reóstato en la
posición de “OFF”(apagado) .el manómetro indicara un descenso en la presión .
 Cuando la presión es nula , se abre la Espitia de escape de vapor ,penetrando
el aire al aparato .solamente entonces puede abrirse la tapadera y retirar los
objetos húmedos ya esterilizados .
ESTERILIZACION CON CALOR SECO

 El docente hará la demostración para envolver las cajas Petri y pipetas con papel
craff , así como elaborar tapones y capuchones para tubos y matraces .luego los
alumnos preparan su material .
 El material de vidrio debe encontrase limpio y libre de sales.
 Se procede a preparar el material fungible y otros con papel craff algodono gasa
para tubos de vidrio, pipetas (por separado) y cristalería en general, utilizar
170°C por espacio de 1 hora .transcurrido el tiempo de esterilización se apaga
el horno y se deja enfriar para sacar el material .solo así se puede manejar el
material.
c) TECNICA DE ESTERILIZACION CON CALOR DIRECTO
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Se utiliza para asas bacteriológicas y agujas de Inoculación.

1. Estas se deben esterilizar antes y después de llevar acabo la siembra de
cualquier tipo de bacteria }
2. Poner el asa o aguja directamente en la parte azul de la flama durante algunos
segundos hasta cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfría en
las paredes inferiores del recipiente de cultivo.
CUESTIONARIO.- RESPONDA BREVEMENTE
1.- En que se fundamenta la esterilización al

vapor?...............................................................................................................
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2.-Investigue que se esteriliza con las radiaciones ionizantes?

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3.-Que componentes tiene el hipoclorito de

sodio?.............................................................................................
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4.-Dibuje un autoclave colocando sus partes y funciones:
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PRACTICA Nº3
METODOS DE COLORACION Y MORFOLOGIA BACTERIANA
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A. METODOS DE COLORACION
OBJETIVO
1. Preparar y analizar los diferentes métodos de coloración para la visualización de
microorganismos que permitan establecer diferencias morfológicas y estructurales entre
y dentro de los microorganismos.
2. El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación por los métodos de
coloración al microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo y leer.
GENERALIDADES
Las bacterias no tienen coloración, porque no tienen color, pero sin embargo si se
pueden observar con las coloraciones utilizados en microbiología, como son las
coloraciones simples diferenciales y especiales o compuestas. Así tenemos la más
utilizada en microbiología, es la tinción de Gram, en la cual se puede diferenciar en dos
grandes grupos. Según lo implementara en el siglo XVIII el bacteriólogo danés Christian
Gram, los microorganismos Gram positivos se tiñen de violeta, y los bacilos se tiñen de
rojo y se dice que son gramnegativo.
La tinción se fundamenta con el espesor de la pared celular (capas de péptidoglucano),
aunque no existe un componente único de esa pared que puede explicarla. La tinción
de Gram permite así mismo controlar la contaminación, por observación de una
homogeneidad morfológica y tintorial.
Otro método de coloración de bacterias es la coloración de Ziehl-Neelsen algunos
microorganismos son lipofilicos y difíciles de teñir (genero Mycobacterium y
Nocardia), pero una vez teñidos son resistentes a la decoloración, como característica
se tiñen de rojo con carbol fucsina y no se decoloran con alcohol acido, denominándose
bacilos acido alcohol resistente BAAR. La propiedad tintorial se relaciona con la
presencia de ácidos micológicos unidos a la pared celular en la pared intacta. Cuando
se examina bajo la luz del microscopio, las microbacterias aparecen como bacilos rojos
brillantes, contra un azul claro.
En los trabajos bacteriólogos generalmente se usan colorantes básicos o primarios
como el azul de metileno, cristal de violeta, fucsina básica, safranina todos ellos
pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina. Las coloraciones pueden
ser según el número de colorantes que utilizan:
A) SIMPLES: Cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta
China, Azul de lacto fenol cual se utilizan para visualizar la morfología de los
microorganismos.
B) DIFERENCIALES :Cuando utiliza mas de un colorante como la coloración de
Gram y Neelsen
C) Especiales cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas
estructuras celulares como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (capa
capsula), Wirtz conklin (para espora) etc. Estas técnicas tienen un gran interés
en la identificación y clasificación de las bacterias. La tinción diferencial más
utilizada es la tinción de Gram.
COLORACION CON AZUL DE METILENO
1. Preparar un frotis con la mescla bacteriana y fijar al calor
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2. Cubrir el frotis con una gota de colorante y dejar actuar por 3-5 minutos
3. Lavar con agua y dejar secar
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.
5. Tambien se puede realizar observaciones al directo.
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso.
COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:
1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos
2. Agregar una colonia bacteriana diluida.
3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjetos.
4. Observar con lente de 1O y 40X
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un
fondo oscuro. Como la capsula de la levadura. Cryptococcus
COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:
1. Colocar una gota del colorante sobre la lámina portaobjetos
2. Colocar una muestra de un cultivo sobre el colorante
3. Cubrir con una laminilla cubreobjetos
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Los microorganismos se observarán en un fondo azul - celeste
B. COLORACIONES DlFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el Segundo
colorante es llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la
coloración de Gram v la de Ziehl Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente.
COLORACION DE GRAM
Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas
y Gram negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram
negativas, el peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas;
en las Gram positivas la mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano.Existen
varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff.
MATERIAL
• Muestra con mezcla de bacterias
• Solución fisiológica al 0. 85%
• Láminas portaobjetos
• Asa bacteriológica de Kolle en aro
• Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff
• Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)
• Lugol (mordiente)
• Alcohol- acetona (decolorante)
• Fucsina básica (colorante de contraste). Las bacterias de colorean de
color azul a violeta los gram positivos y los gram negativos de rosado
a rojo.
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Esquematice colorantes observados y utilizados
PROCEDIMlENTO
1. Con el asa bacteriologica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar
un frotis en el centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en zigzag.
2. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la
ayuda de la llama débil d el mechero de Bunsen.
3. Colocar la lámina portaobjetos sobre el puente de coloración.
4. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, durame 3 minutos.
5. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre
el frotis).
6. Cubrir con Lugol durante 1-2 minutos, lavar luego con agua.
7. Decolorar el frotis con una solución de alcohol - acetona (inclinar la lámina y
decolorar hasta que no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar
con agua.
8. Cubrir con el colorante de contraste Safranina durante 30 segundos. Luego
lavar con agua.
9. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de
Bunsen.
10. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión
FROTIS BACTERIANO
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COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN
Es una coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen
elevado contenido de lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso ) ,
llamados también ácido- alcohol –
resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica
fenicada) que es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es
forzado a penetrar en la célula y en esta forma resistir a la decoloración.
MATERIAL
 Láminas con frotices de bacilo tuberculoso.
 Set de coloración Ziehl –Neelse
 Fucsina fenicada al 5%(colorante primario )
 Alcohol ácido ( alcohol etílico con 3% de HCl )
 Azul de metileno (colorante de contraste).
 Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsia fenicada el frotis realizado en el lamina y calentar la
preparación con el mechero de alcohol hasta aprecias el desprendimiento de
vapores, repetir este procedimiento por tres veces, evitando que hierva el
colorante
2. Lavar con agua corriente
3. Decolorar con alcohol acido gasta que se aprecie una coloración rosada
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto
7. Secar y observar con lente de inmersión
RESULTADO
Las bacterias acido alcohol resistente se tienen de color rojo y las no acido
alcohol resistentes se tiñe al color azul
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C.- COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN O CIEMSA

Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no
tienen afinidad con los colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también
la coloración de microorganismos presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN O GIEMSA
Es una coloración especial poli cromática utilizada para demostrar la presencia
y morfología se microorganismos en sangre y tejido como: Bartonelia, hongos,
Ricketsias.
MATERIALES
 Frotis de sangre con Leishman

 Solución de colorante Leishman o giemsa.
 Agua destilada tamponada
 Microscopio con lentes de 100X
 Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos
2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
3. Lavar con agua de caño y dejar secar
4. Observar con objetos de Inmersión
5. Anotar los resultados en el protocolo
PRESENTACION DE RESULTADOS
1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso
a) Tipo de tinción
b) Nombre de la bacteria característica observada
c) Preparar un colorante simple, diferencial
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------------------------------------------------------ -------------------------------------------
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Describa el fundamento de la coloración Gram a comparación Zihel Neelsen:
B.- MORFOLOGIA BACTERIANA
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OBJ ETIVOS
o Con esta práctica se pretende que el alumno asimile la importancia de
la morfología bacteriana en el diagnóstico microbiológico. Describir las
diversas formas morfologías bacteriana.
o Discutir la diferencia de la morfología bacteriana en la terapeutica de las
infecciones por estos agentes.
INTRODUCCION
Uno de los elementos básicos para la clasificación o identificación de un
microorganismo lo constituye su morfología ; ya que simplemente con la ayuda de un
microscopio óptico y unos pocos colorantes, observando la morfología bacteriana se
puede hacer un diagnóstico presuntivo del germen o gérmenes , lo cual se hace más
relevante para realizar un diagnostico presuntivo Los parámetros a considerar son :
tamaño, forma, disposición de las bacterias, la reacción aun colorante en particular y
detalles del género o especie .
M ATERIAL, EQUlPO, REACTIVOS Y CEPAS M ICROBIANAS POR EQUIPO
 Microscopio óptico
MATERlAL
 Porta objetos
 Cubreobjetos
 Pipeta Pasteur
 Gradilla
 1 tubo d e ensayo de 1 3 X l 00 mm
 Asa bacteriológica
 Frasco gotero con solución de cristal violeta , lugol, alcohol - acetona, safranina
 Frasco gotero con solución de fucsina fenicada de alcohol ácido, azul de
rnetileno
 Solución sal ina .
 Mechero
 Asa de siembra
 Puente de coloración
 Gradilla metálica
CEPAS MICROBIANAS
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 Staphylococus aureus
 Escherichia coli
PROCEDIMIENTO
A cada grupo de estudiantes se le hará entrega una lámina coloreada para que pueda
obervar las diferentes formas con diferentes coloraciones.
Realizará las observaciones correspondientes, haciendo énfasis en los elementos
diagnósticos o diferenciales de los microorganismos observados, de acuerdo con los
parámetros mencionados y seguidamente dibujará lo observado al microscopio.
Dibuje todas las observaciones SIN CAMBlAR DE COLORES lo observado,
1. ------------------------------------------------------
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2. -------------------------------------------------
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3. ---------------------------------------------------
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4. ---------------------------------------------------------
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-
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5. ------------------------------------------------------
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6.- Frotis de cavidad bucal: flora mixta con predominio de bacilos cortos.
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7.-Describa los obstáculos que tuvo al preparar los reactivos que le toco preparar.
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8.- Describa las recomendaciones para realizar un buen frotis, y en que se fundamenta
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PRACTICA Nº 4
MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA BACTERIANA
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OBJETIVOS
Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de diferentes
medios de cultivo, su estilización y su almacenaje, asi como la importancia de los
diferentes medios de cultivo y su uso Además también se pretende que el alumno
se familiarice con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la
manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad realizar las
diferentes formas de siembra bacteriana .
GENERALIDADES
Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una
fuente de energía exógena y nutriente esencial tales como agua, carbón, nitrógeno,
minerales y factores de crecimiento, además de las condiciones ambientales
apropiadas como son pH, temperatura, presión osmótica y oxigeno atmosfénco.
Cuando las bacterias se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los
medios de cultivo los cuales pueden ser de mu y variados tipos de acuerdo al
microorganismo que se desee estudiar .
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes , factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismo. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar.
La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de
medio y re disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo
las instrucciones del fabricante ·
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidifican te. Es un polisacárido que se obtiene
de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos Los más
empleados son la glucosa , la lactosa y la sacarosa.
3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales
obtenidos con agua y calor Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta. Y otros
4. Peptonas . Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digesti6n química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son añadidos a los medios emplea dos para el cultivo de algunos
microorganismos patógenos.
6. Sistemas amortiguadores . Son sales que se añaden al medio para mantener
el pH dentro del rango oprimo del crecimiento bacteriano . Ej. fosfatos bisódicos
o bipotásicos
7. Indicadores de pH Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar
cambios de pH en el medio.
8. Agentes selectivos Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares,
glucosa, dextrosa etc que a determinadas concentraciones en el medio
actúan como agentes selectivos frente a determinados rnicroorgarnismos.
9. Agentes reductores . Sustancias que se añaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos o
anaerobios." Ej. cisteína y tioglicolato.
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10. Agentes selectivos . Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc.
que a determinadas concentraciones en el medio actúan corno agentes
selectivos frente a determinados microorganismos.
Clasificación de los medios de cultivo por su CONSISTENCIA:
a. Sólidos Son aquellos que contienen un agente solidifícame entre sus
componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en
slant (tubos con la superficie del medio inclinada) 1 % de agar.
b. Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o Erlenmeyer. Excepto
de agar.
c. Semisólida.- Se observa en su gran mayoría en medios de transporte y contiene
0.5% de agar también denominado semisólido.
Por su COMPOSICIÓN:
a. Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos .(Gram positivos y gramnegativos)
b. Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
c. Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.
d. Medios diferenciales. Son aquellos en los que se» pone. de relieve alguna
propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee, como son las
reacciones bioquímicas.
AJUSTE DEL pH.- Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad
el pH de! medio usualmente quedará dentro de los límites adecuados, aun así es
conveniente ajustar el pll lo que se puede hacer con un potenciómetro o en su defecto
con papel pH 4.0-7.0. Si el medio es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a
45°-50°C (aún está liquido) y en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente.
La corrección del pH se efectúa con HC1 o NaOll 1N o 0.1 N tomando una muestra del
medio dé cultivo preparado y. estéril, se mide el pH y si hiera necesario se ayusta en la
muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el total
de medio.
ESTERILIZACIÓN - Existen medios que deben ser auto clavados y algunos no ; las
recomendaciones se describe en los insertos de cada medio de cultivo ,cabe mencionar
que los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el
caso de los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para
vaciar una placa (aprox. 20 mi cada uno) o bien matraces para varias placas. Si en las
instrucciones del medio no se índica otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en
autoclave a 121C por 1 5 minutos.
MATERIALES
 3 Erlenmeyer de 100 mi
 6 cajas de Petri
 2 tubos de ensayo
 1 pipeta de 10 ml
 1 probeta
de 100 ml
 Espátula
 Balanza
PROCEDIMIENTO
 Realizar los cálculos respectivos para agar y caldo teniendo en cuenta que para
25
cada caja deben servir 15-1 8 mi de agar y para cada tubo entre 7-10 mi de
caldo.
 Medir el volumen de agua destilada según sus cálculos.
 Teniendo en cuenta el volumen de agua a utilizar, haga la relación de polvo de
agar que debe pesar de acuerdo a lo especificado en la etiqueta del medio.
 Pese la cantidad del medio necesario de acuerdo a los cálculos.
 Mezcle el polvo con la mitad del volumen de agua medida anteriormente, agite y
adicione el restante de agua.
 Impedir que haya ebullición.
 Esterilizar en el autoclave a 15 Ib de presión a 12Í°G por 15 minutos.
 Plaquear de 10-20 mi dependiendo de que tipo de placa o caja Petri maneje.
 Cuando se encuentre entre 50-5 5°C,plaquear y dejar que solidifique .
 Llevar a control de calidad con guía del Docente,(no todas se llevan ejm As)
 Déjelos enfriar y guárdelos en el refrigerador hasta su utilización.
LA SIEMBRA.- es la operación que consiste en colocar los gérmenes en un

ambiente adecuado para que se desarrollen y multipliquen; este ambiente es
proporcionado por los medios de cultivo que se preparan en el laboratorio y los
cuales contienen las sustancias nutritivas y los demás requerimientos necesarios.
Los medios líquidos que contienen aminoácidos, glucosa, cloruro de sodio; son los
caldos simples, si al caldo simple se le añade sangre desfibrada, suero o liquido
ascítico obtenemos un caldo enriquecido. Entre los medios sólidos se pueden
mencionar el agar simple o nutritivo que no es más que el caldo simple solidificado
por la adición de agar al 1,5%; sí al agar nutritivo fundido, se adiciona sangre al 5-
10%se obtiene agar sangre . En medios sólidos se emplean los métodos de placa
vertida y el de siembra por estrías; para la placa vertida se adiciona la muestra en
suspensión acuosa a la placa estéril y seguidamente se vierte el agar fundido a 45
°C, con movimientos giratorios se hace una distribución uniforme, luego se deja
solidificar.
PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR UNA SIEMBRA BACTERIANA:
Primeramente, debemos conocer los tipos de siembra, así tenemos:
A) Tipos de siembra
 Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de
muestra bacteriana sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda
de un Asa de siembra en aro 20.
 Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en
zigzag, hasta la mitad de la superficie del medio de cultivo sólido que se
encuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45° y continuar sembrando en
zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
 Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-
sólido, con ayuda del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical
hasta la mitad de Agar.
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra
bacteriana e introducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando
no tocar las paredes.
26
RESULTADOS
Describa las recomendaciones que se debe tener al realizar los cultivos bacterianos.
27
¿Qué significa realizar una buena siembra bacteriana?
Dibuje los tipos de siembra que realizo , en los diferentes medios de cultivo (no cambie
colores)
28
PRACTICA N°5
CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO Y MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS
BACTERIANAS
A.- CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO

OBJETIVO.
El alumno debe reconocer y fundamentar la curva de crecimiento bacteriano que se
realiza en la placa de acuerdo a los cultivos realizados.
GENERALIDADES
La curva de crecimiento bacteriano se refiere al sistema de crecimiento que tienen las
bacterias a diferentes temperaturas y de acuerdo a los nutrientes necesarios para
cumplir este sistema, en la cual se observa la fase de inicio, crecimiento exponencial,
latencia, estacionaria y fase de muerte
Fase de latencia: es el tiempo que tarda una bacteria determinada en adaptarse al

medio de cultivo y las nuevas condiciones ambientales
Fase exponencial: la población crece al ritmo máximo de forma que cada célula se
divide originando dos células, estas dos darán cuatro y así sucesivamente, duplicándose
la población en cada periodo divisional o tiempo de generación (o tiempo de
duplicación), típico de cada cepa bacteriana para unas condiciones de cultivo dadas. Al
presentar el logaritmo del número de células viable respecto al tiempo, se obtiene una
línea recta
Fase estacionaria: en un cultivo donde no hay renovación del medio de cultivo, los
nutrientes se agotan y se acumulan productos metabólicos tóxicos, con lo que el
crecimiento de la población se ralentiza e incluso se detiene
Fase de muerte: si se prolonga el cultivo, se llega a una situación en la cual mueren las
células.
29
Medida de crecimiento bacteriano: Los métodos más utilizados son dos: la

determinación de la masa celular y el número de células viables del cultivo
Masa celular: se mide la turbidez del cultivo (causada por la dispersión de luz por parte
de las bacterias) en la práctica se utiliza un espectrofotómetro, midiéndose la
absorbancia del cultivo a lo largo del tiempo
MATERIAL
- Tubos de ensayo conteniendo caldo de enriquecimiento incubado durante 24
horas con material biológico en crecimiento.
- Bacterias a ensayar: coliformes, calificar la turbidez con las direcciones del
docente.
- recuento de células viables, recuento de colonias, y calcular el número de
células viables/ ml de Cultivo (UFC/ml). Aplicar las fórmulas de dilución, tasa de
crecimiento, tiempo de duplicación.
RESULTADOS.
Esquematice la curva de crecimiento bacteriano de las placas y tubos con caldo con
crecimiento bacteriano que observo.
A que se denomina microorganismos viables a diferencia de microorganismos en

suspensión:
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
30
B. MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS.

OBJETIVO
El alumno deberá describir y conocer las diferencias características morfológicas que
presentan las colonias bacterianas.
GENERALIDADES
Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una
Unidad Formada de Colonia (UFC) sobre un medio solido; aunque varia de tamaño
generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo microorganismo o
bien un grupo de microorganismos de una misma especie como el caso de bacterias
que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color
casteristicos, que, aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es
constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la
forme.
Las principales características morfológicas que presentan las colonias se diferencias
por su forma, su elevación y su borde, los siguientes:
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulosa, plegada.

TAMAÑO: diámetro en milímetros
CONSITENCIA: cremosa, membranosa y mucoide (probar con aza)
CROMOGENESIS: pigmentación verde, amarilla, roja, etc.
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la
bacteria sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo inoculado
son:
Turbidez: opacidad más o menos densa, signo de crecimiento.
Película: crecimiento casi continuo sobre el líquido.
31
SEDIMENTO: DEPOSITO DE CELULAS EN EL FONDO DEL TUBO QUE SE

RESUSPENDE AL AGITAR.
CRECIMIENTO EN CALDO NUTRITIVO
Falta LETRAS
CRECIMIENTO EN MEDIO SEMISOLIDO
Falta LETRAS
32
RESULTADOS
De acuerdo a las observaciones, esquematice las colonias bacterianas y clasifíquelo por
sus diferentes formas:
……………………………… ……………………………………
……………………………… ………………………………
33
PRACTICA N° 6
A.- CULTIVO PURO O AXENICO y METABOLISMO BACTERIANO

OBJETIVO
• Familiarizar al estudiante las diferentes técnicas de aislamiento de un
microorganismo a partir de una población mixta para obtener un cultivo puro.
GENERALIDADES.
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos
complejas. Por ello, una técnica esencial en Microbiología es la obtención de cultivos
puros (axénicos), a partir de los cuales son posibles estudios sobre las propiedades del
microorganismo.
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismos (una sola
especie). Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento.
Se puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de una misma célula o de
un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Como regla
general cada especie forma siempre en el mismo medio colonias semejantes. Los
rasgos de las colonias por tanto son importantes para la identificación primaria de grupos
de bacterias diferentes
PROCEDIMIENTO
1. Seleccionar una cepa que nos interesa aislar en forma pura.
2. Se esteriliza (rojo incandescente) y enfría el asa.
3. Se selecciona un campo para realizar un sembrado por estría simple.
4. Se cierra la caja, se esteriliza y enfría el asa nuevamente.
5. Se lleva a incubación a 37°C.
6. Se debe realizar en condiciones de esterilidad y asepsia, tratando siempre de
aislar solamente la colonia que hemos sembrado. Cuando todas las colonias
presentes en una caja son iguales en tamaño, color, aspecto y demás
características podemos asumir que tenemos un cultivo puro.
RESULTADOS
Dibuje las diferentes sepas bacteriana que se aisló en forma pura.
Descripción: Descripción:
34
B.-METABOLIZMO BACTERIANO
OBJETIVOS.
1. Observar las diferentes reacciones químicas producidas por las bacterias como
respuesta de su metabolismo.
2. Reconocer las principales pruebas bioquímicas empleadas en la identificación
de bacterias. Aprender a realizar, leer e interpretar las diferentes pruebas
bioquímicas empleadas en el laboratorio.
3. Aprender la utilidad de los diferentes medios de cultivo selectivo y diferenciales.
4. Aplicar los diferentes métodos de siembra vistos en teoría.
5. Realizar algunas pruebas adicionales para identificación de bacterias.
INTRODUCCION.
 Los microorganismos al igual que todo ser vivo necesita de nutrientes para un
buen desarrollo. Si se combinan las fuentes de crecimiento e inhibidores
adecuados y se proporcionan las condiciones favorables se puede lograr la
separación de grupos de microorganismos lo que facilitara su estudio posterior.
El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios
bacteriológicos es posible gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que
llevan a cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo
enriquecidos con productos útiles para el metabolismo celular, los cuales además
tienen algún indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos
microorganismos sus funciones. Los organismos varían de su capacidad para
utilizar diferentes compuestos (por ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para
algunos microorganismos que se usan en su identificación en el laboratorio, como
son: aerógenas: las que producen gas como hidrogeno y dióxido de carbono
como resultado de la actividad metabólica: anaerógenas: las que no producen
cantidades visibles de gas durante su actividad metabólica. Cromógenas: las que
producen pigmentos solubles o insolubles. Fotógenas: las que causan
putrefacción y producen una débil fosforescencia (algunas bacterias marinas).
Entre las pruebas bioquímicas más comunes tenemos:
Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: al fermentar algunos

carbohidratos, muchas bacterias producirán acido, y con un medio con pH original
alrededor de 7.4 al bajar este a 6.8 por el ácido que produce un cambio de color
gracias a la incorporación de un indicador de pH como es el rojo de fenol.
La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la identificación de
las características de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras
coloraciones. Sin embargo, la caracterización final de un aislamiento bacteriano
desconocido, para identificarlo a nivel de género y especie se lleva acabo
estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y
sirvan como marcadores de identificación.
Acción sobre los carbohidratos

La fermentación es un proceso metabólico de óxido-reducción que ocurre en un
medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico sirve
como el aceptor final de hidrogeno (electrones). Este término de fermentación se
refiere a la utilización de hidratos de carbono como la glucosa los cuales le servía
como fuente de energía y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y
cantidades de ácidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificación
del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de su
35
fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO 2 e H+) se manifiesta por

la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.
a) Reacciones de oxidación-fermentación de azucares:

EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron).- el medio TSI fue diseñado para la
diferenciación de bacilos Gram negativos, basándose en la capacidad potencial
de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrogeno
(H2S).
El medio contiene tres azucares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de
1:10:10. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador
de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje esta entre pH 8.4 (rojo) y pH
6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los
carbohidratos presentes en este medio pueden ser fundamentalmente tres:
1. Fermentación de glucosa únicamente.
2. Fermentación de glucosa más lactosa, glucosa más sacarosa o glucosa más
ambos carbohidratos.
3. No fermentación de carbohidratos.- Sin utilización de las anteriores. En el
caso de no utilizar ninguno de los carbohidratos presentes (glucosa, lactosa
y sacarosa), lo que se usaría serían las peptonas ya sea aeróbicamente o
anaeróbicamente. Solo utilizándolas aeróbicamente daria una superficie
alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea (k/sc). Si las usaras
aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo)
ósea k/k. En este medio también es posible detectar la producción de gas
por la formación de burbujas dentro del medio, y la producción de ácido
sulfhídrico, el cual reaccionara con un indicador con base de fierro dando un
color negro debido al sulfuro de hierro formado.
La interpretación se realiza de la siguiente manera:
- Cambio de color de rojo a amarillo en todo el medio indica fermentación
de la glucosa y de la lactosa (pico de flauta acido/profundidad acida: A/A).
- Cambio de color rojo a amarillo únicamente en la parte inferior del agar
pero no en la cuña (parte inclinada), indica fermentación de la glucosa
pero no de la lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad acida: K/A).
- Presencia de un color negro en el fondo y rojo en la superficie indica
fermentación de la glucosa, pero no de la lactosa; producción de ácido
sulfhídrico: (K/A/H2S).
- Ningún cambio en el color del agar indica no-fermentación de glucosa ni
de la lactosa (pico alcalino/profundidad alcalina: K/K).
- Ruptura del agar o formación de espacios de aire indica formación de
dióxido de carbono.
- Aparición de un precipitado negro en la línea de punción indica producción
de sulfuro de hidrogeno.
Agar de hierro y lisina (LIA).- la utilización de este medio de cultivo se

fundamenta en que algunos microorganismos provocan la descarboxilacion de
los aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta
descarboxilacion es la producción de una amina (o diamina) y dióxido de
carbono. La producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre
la lisina produce una diamina cadaverina por lo tanto este medio determina la
capacidad de un microorganismo para utilizar el amino acido. Lisina
descarboxilandolo o descaminándolo la fermentación de la glucosa, la
producción o no de gases (CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico
(H2S) y su lectura la cual se realiza a partir de las 18 horas a 24 horas de
incubación, se lee la reacción producida en la superficie (parte aerobia) y en la
profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH del medio es purpura
36
de bromocresol, el cual en acides vira al color amarillo y el alcalinidad del color

purpura. Por contener una cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo
del tubo es amarillo y la superficie alcalina. En el medio LIA se puede detectar la
producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción coloreada
por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador purpura de
bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en
el fondo indica una reacción acida por la fermentación de una pequeña cantidad
de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la
acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la cual provocara
un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la
acidez debido a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce
lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida.
Prueba del citrato de Simmons, ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar
el citrato como única fuente carbono en una serie de reacciones como sigue:
CITRATO OXALACETATO+ACETATO
OXALACETATO PIRUBATO+CO
2 PIRUBATO ACETATO+LACTATO+CO
Los ácidos orgánicos son posteriormente utilizados dando como producto final
carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino a sí logrado hace que el
indicador de pH en el medio, el azul de bromotimol vire de su color verde
original a un azul intenso.
Prueba de la ureasa.-
la hidrolisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una
enzima específica, la ureasa, dando lugar a dos moléculas de amonio, agua y
dióxido de carbono. Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que cause que
cambie el color original del medio (amarillo) a un color rojo buganvilia por el
indicador rojo de fenol. De acuerdo a la degradación de la urea el color será
más o menos intenso.
(NH2)2C=O+ 2H2O CO2+ 2NH3+H2O (NH4) 2CO3.
Medio MIO (movilidad, indol y ornitina).-

Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la producción de
indol y decarboxilacion de la ornitina. La movilidad se detectara por la presencia de
turbidez alrededor del punto de inoculación.
El indol se formara si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima tripofanaza
que desdoblara el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es
incoloro pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-amino benzaldehído)
que se adiciona después de que creció la bacteria, dará un color rojo violeta.
Por lo que respecta a la descarboxilacion de la ornitina como el medio tiene purpura de
bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce
un color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilaza negativa), sin embargo al
descarboxilarse la ornitina se produce putrecina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez
dada por la fermentación de la glucosa resultando en un color morado en el fondo.
Pruebas bioquímicas para la identificación de enzimas: el objetivo de estas pruebas

es comprobar la presencia de enzimas en la célula microbiana
Licuefacción de la gelatina: Determina la capacidad de un organismo para producir
enzimas de tipo proteo lítico (gelatinasa), que licuan la gelatina. El medio empleado es
37
la gelatina nutritiva con extracto de carne, peptona, gelatina y agua destilada. La prueba
se realiza inoculando por picadura agar gelatina nutritiva estéril, se incuba a temperatura
ambiente por 7 días y se determina que patrones de licuefacción presenta. Si
únicamente es para determinar la presencia de la enzima se incuba a 30°C por 24 horas,
se coloca luego a temperatura ambiente por una hora y se observa el tipo de
licuefacción.
Producción de ureasa: Determina la capacidad de un microorganismo de desdoblar la
urea formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. La ureasa
es una enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos
orgánicos. El medio empleado es el caldo urea con fosfato monopotasico, fosfato de
sodio, extracto de levadura, urea, indicador de rojo de fenol y agua destilada. La prueba
se realiza sembrando con asa redonda una suspensión del microorganismo en el medio
e incubando a 35°C +/- 2°C por 24 – 48 horas y se lee de la siguiente forma: Si el medio
vira a un color Rosado intenso o purpura la prueba es positiva. Si no hay cambio de
color se considera como prueba negativa.
Producción de hemolisinas: las hemolisinas son sustancias que dejan libre la
hemoglobina que contienen os glóbulos rojos sanguíneos. Se producen por varios tipos
de bacterias como: streptococcus sp y staphylococcus sp. Las hemolisinas pueden
producir cambios visibles cuando se cultivan las bacterias en placas con agar de sangre.
Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en agar sangre por el método de
agotamiento con el asa bacteriológica (francés preferiblemente) y luego se incuban las
placas a 35°C +/- 2°C por 24 – 48 horas y posteriormente se hace la lectura así:
- Hemólisis Alfa: presencia de un halo color verde alrededor de la colonia; esta
hemolisis es un tipo de hemólisis incompleta en la cual los glóbulos rojos que
rodean las colonias son parcialmente dañados, pero no lisiados completamente.
El enverdesimiento del medio se produce debido a la salida de la célula de un
derivado del tipo de la meta hemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo
de la biliverdina
- Hemolisis beta: en la cual las colonias del microorganismo aparecen en la placa
de agar sangre rodeadas de una zona clara, incolora en la cual los hematíes han
experimentado lisis y se ha reducido la hemoglobina (halo transparente)
- Hemolisis gamma: o ausencia de hemolisis, en este tipo de hemolisis no hay
daño de la célula, es decir, no hay lisis total o parcial de los glóbulos rojos y por
lo tanto no se producen modificaciones en el medio en contacto con la colonia
de la bacteria.
El tipo de hemolisis producido en agar sangre es útil para una identificación inicial
de los estreptococos. Sin embargo, las reacciones hemolíticas pueden sufrir
variaciones dependiendo del tipo de sangre usado. Estas variaciones son
evidentes con los streptococos del grupo D
- Producción de catalasa: la catalasa es una enzima que esta relacionada con
microorganismos aeróbicos (excluyendo a los estreptococcus) y anaeróbicos
facultativos y ausente en los anaeróbicos estrictos. Esta enzima descompone el
peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno.
La no aparición de burbujas es un indicador negativo
- Citocromo oxidasa: el sistema citocromo oxidasa está constituido por
hemoproteínas capaces de catalizar la oxidación de un citocromo reducido por
el oxigeno molecular. Las bacterias que obtienen su energía por respiración y
utilización de oxigeno molecular como aceptor final de electrones, contienen
diferentes sistemas citocromo oxidasa, en tanto que las bacterias anaerobias
38
obligadas no contienen tales sistemas. El ensayo de citocromo oxidasa permite

detectar la presencia del microorganismo de ciertas enzimas del sistema
citocromo oxidasa, capaces de catalizar el transporte de electrones entre un
dador presente en la bacteria y el colorante tetrametil -pfenilendiamina (color
azul) o el diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (color rosado). La prueba
puede realizarse por dos procedimientos:
- Técnica directa en placa: en la cual se añade directamente 2 o 3 gotas del
reactivo a las colonias aisladas que se desarrollan en las placas, para este
método las colonias deben estar en un medio que no contenga colorantes, por
ejemplo, se pueden realizar en un medio no selectivo.
- Técnica indirecta: ya que la prueba se realiza sobre una tira o discos de papel
filtro (colocados en una caja Petri) en la cual se añaden unas gotas del reactivo
y luego se extiende con un asa una porción de la colonia sospechosa. Se debe
realizar un control al asa ya que esta puede producir falsos positivos
 Producción de coagulasa: la coagulasa es una enzima proteica similar a la
protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la
formación de un coagulo visible en un sistema analítico adecuado, esta prueba
es útil para identificar S. aureus coagulasa positivo de otros estafilococos
coagulasa negativo. Esta enzima se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”
cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de
diferentes técnicas para ser demostradas. La coagulasa fija se lleva a cabo en
portaobjetos y es una enzima que esta unida a la pared celular bacteriana. Los
hilos de fibrina formados entre las células suspendidas en el plasma (que
contiene fibrinógeno) provocan su aglutinación. Indicada por la presencia de
agregados visibles en el portaobjetos. Formación inmediata de un precipitado
granular o de grumos blancos. Una reacción positiva se detecta usualmente en
15 a 20 segundos por la aparición del precipitado granular la prueba se considera
negativa si no se observa aglutinación al cabo de 2 a 3 minutos. Esta prueba es
solo presuntiva y todos los cultivos negativos a positivos tardíos deben ser
verificados mediante la prueba en tubos.
 Pruebas bioquímicas para la detección de metabolitos: como el nombre o
indica estas pruebas se usan para identificar la presencia de metabolitos
producidos por las bacterias durante su proceso vital. Por lo general, la detección
de esas sustancias se hace adicionando reactivos para observar una reacción
especifica luego que la muestra es incubada a diferencia de las pruebas
anteriores, que luego de la inoculación determinan la actividad de una vía
metabólica por el cambio de color del medio
Las principales pruebas bioquímicas de esta clase son:
 Producción de indol: el indol es uno de los productos de degradación
metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa
son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol,
acido pirúvico y amoniaco. La producción de indol es una característica
importante para la identificación de muchas especies de microorganismos, la
prueba del indol se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el
indol reacciona con el rupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehido, este es el
principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado
debe ser rico en triptófano. Esta prueba se realiza inoculando el microorganismo
en caldo triptófano o en medio SIM e incubación a 35°C +/- 2°C por 18 a 24
horas. Al finalizar este periodo, se adiciona 5 gotas de reactivo de Kovács. Si se
emplea el reactivo de Ehrlich se debe adicionar primero 1ml de cloroformo. La
39
interpretación de la prueba es positiva si el reactivo cambia de color amarillo a

un color rojo rosado a fucsia; si no hay cambio de color la prueba es negativa.
 Producción del sulfuro de hidrogeno: la capacidad de ciertas especies
bacterianas de liberar azufre de aminoácidos u otros compuestos que contienen
azufre en la forma de H2S puede detectarse en sistemas de prueba si se hallan
presentes las siguientes condiciones.
 Si hay una fuente de azufre en el medio; por ejemplo, aminoácidos
como la cisteína y metionina, o el tiosulfato de sodio (compuesto
inorgánico) que se adicionan al medio de cultivo
 Si hay un indicador de H2S en el medio: el sulfato ferroso, citrato
férrico, sulfato o citrato de hierro y amonio, hierro peptonizado y
acetado de plomo son indicadores de sulfuro muy utilizados en
los medios de cultivo.
 Si el medio permite el crecimiento de la bacteria en estudio: es
importante identificar desde el comienzo que organismo
deseamos analizar para asi escoger el medio adecuados para su
cultivo y que a la postre van a facilitar este proceso de
identificación.
 Si la bacteria posee los sistemas enzimáticos productores de
H2S.

OTRAS PRUEBAS BIOQUIMICAS USUALES:
 UTILIZACION DEL CITRATO: el principio de prueba de utilización del citrato es

determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato e sodio como
única fuente de carbono para metabolismo y crecimiento. El caldo original
descrito por koser para esta prueba fue modifucado por Simmons agregándole
un indicador (el azul de bromotinol) y agar lo que promociono un medio mas
senciblke. Para esta prueba se prepara agar citrato de Simmons en forma de
pico de flauta y se inocula una muestra pequeña del microorganismo por el
método de puncion y teniendo cuidado de no arrastrar parte del medio de cultivo
original. La prueba seincuba a 35°C+/-2°C por 24 horas (incluso 4 dias) y la
aparición de un color azul en el medio indica la presencia de productos alcalinos
y un resultado posiitivo. El citrato de sodio es una sal del acido cítrico, compuesto
organico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.
FUNDAMENTO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con
citrato con formación de subproductos alcalinos. El medio ( citrato de Simmons) incluye
citrato de sodio, un anion como única fuente de carboo y fosfato de amonio como única
fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer
nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio
por conversión del NH3 en hidróxido de amonio(NH4OH) , detectándolo con el indicador
del pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre Ph 6.9(VERDE)
y pH( AZUL).
MATERIALES
40
Cepa control citrato positivo y negativo.

Medio de citrato de Simmons en plano inclinado.
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de diembra bien esterilizada, sembrar por la técnica de estria en cada
tubo de cepa citrato positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18-24 horas.
Pruebas de motilidad: esta prueba se realiza en medios semisólidos o con bajas

concentraciones de agar (0.4% o menos) para permitir que los microorganismos
móviles se dispersan libremente.
La mortalidad bacteriana es otros determinante de importancia en una identificación
final de la especie. La motilidad bacteriana puede observarse directamente en un
microscopio colocando una gota de clado de cultivo en un portaobjetos de gota
pendiente para bacterias que no crecen bien en medios semisólidos. Sin embargo,
para las enterobacterias es mas común emplear medios de cultivo semisólidos. Los
medios combinados mas empleados son el SIM u el MIO ya que permiten evaluar
mas de una característica a la vez, por ejemplo en SIM podemos evaluar motilidad,
producción de H2S o indol. Dado que este medio tiene un fondo levemente turbio,
la interpretación de resultados de motilidad se hace un poco complicado, sobre todo
si el analista no esta suficientemente entrenando y mas aun cuando hay producción
de H2S en el medio o se revela la prueba de indol primero lo cual puede afectar del
medio.
PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobicas y
facultativas anaeróbicas. El peróxido de hidrogeno(H202) es uno de los productos
finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para
el microorganismo.
La catalasa convierte el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno de acuerdo a la

siguiente reacción: 2H2O2-------- 2H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa
negativa ) de los estafilococos (catalasa positiva).
MATERIALES
Cepas control: S. aureus, Streptococcus o enterococcus

Solución de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3%
Medio de cultivo:cualquier medio de solido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen actividad de catalasa , por lo que su presencia puede dar
resultados falsos positvos.
41
PRUEBA EN LAMINA
a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador esteril, picar el centro de
una colonia bien aislada y transferir el inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade
el reactivo.
d) Descartar la lamina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden en la prueba en lamina no debe invertirse cuando se use
asa de platino, ya que puede resultar falso positivo. el alambre de
nichronr no interfiere en el resultado de la prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18-24 horas: cultivos
mas viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una
reacción falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acústico por lo que se debe evitar
que toque la piel en caso que ocurra inundar el área afectada con
alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO DEBE USARSE
AGUA.
INTERPRETACION
prueba cualitativa: la aparición rápida y prolongada de burbujas, de gaso efervescencia
son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la
catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutivas durante 20-30,
estas no son catalasas positivas.
CUESTIONARIO:
ESQUEMATICE TODAS LAS OBSERVACIONES SIMPLES DIFERENCIALES Y
OTROS QUE HA OBSERVADO
42
Si hay un indicador de H S en el medio : el sulfato ferroso , citrato férrico , sulfato

o citrato de hirro y amonio , hierro peptonizado y acetato de plomo son
indicadores de sulfuro muy utilizados en os medios de cultivo .
Si el medio permite el crecimiento de la bacteria en estudio : es importante
identificar desde el comienzo su organismo deseamos analizar para asi escoger
los medios adecuados para el cultivo y que a la postre van a facilitar este proceso
de identificación
Si la bacteria posee los sistemas enzimados productores de H S
Otras pruebas bioquímicas usuales :

Utilización del citrato : el principio de prueba de utilización del citrato es
determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato de sodio como
única fuente d carbono para metabolismo y crecimiento El caldo original descrito
por Kosr para esta prueba fue modificado por Simmons agregándole un indicador
( el azul de bromotimol ) y agar lo que proporciono un medio mas sensible . Para
esta prueba se prepara agar citrato de Simmons en forma de pico de flauta y se
inocula una muestra pequeña del microorganismo por el método de puncion y
teniendo cuidado de no arrastrar parte del medio de cultivo original . La prueba
se incuba a 35ª C +/- 2ª C por 24 horas ( incluso 4 dias ) y la aparición de un
color azul en el medio indica la presencia de productos alcalinos y un resultado
43
positivo . El citrato de sodio es una sal del acido cítrico , compuesto organico
simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs .
FUNDAMENTO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un
mdio con citrato con formación de subproductos alcalinos . El medio (citrato de
simoons ) incluye citrato de sodio , un anion com ounica fuente de carbono y
fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno . Las bacterias que pueden
utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio , con
producción de amonio ( NH3) alcalinizando el medio por conversión del NH3 en
hidróxido de amonio (NH4OH) detectándolo con el indicador de pH incorporado
el azul de bromotimol cuyo rango de viraje est entre pH 6.9 (verde ) y pH 7.8
(azul )
MATERIALES
Cepa control citrato positivo y negativo
Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien eterilizada , sembrar por la técnica de estria
en cada tubo la cepa citrato positiva y negativa
2. Rotular los tubos e incubar a 37ªC por 18-24 horas
Pruebas de motilidad bacteriana puede observarse directamente en un
microscopio colocando una gota de caldo de cultivo e un portaobjetos de gota
pendiente para bacterias que no creces bien en medios semisólidos . Sin
embargo para las enterobacterias es mas común emplear medios de cultivo
semisólidos Los medios combinados mas empleados son el SIM y el MIO ya
que permiten evaluar mas de una característica a la vez , por ejemplo en SJM
podemos evaluar movilidad , producción de H2S o indol . Dado que este
medio tiene un fondo levemente turbio , la interpretación de resultados de
movilidad se hace un poco complicado , sobre todo si el analista revela la
prueba de indol primero lo cual puede afectar el color del medio
PRUEBA DE LA CATALASA.
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobicas
y facultativas anaeróbicas . El peróxido de hidrogeno ( H2O” ) es un uso de
los productores finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y asi
se acumula es letal para el microorganismo
44
La catalasa convierte el peróxido de hidrogen en agua y oxigeno de acuerdo

a la siguiente reacción :
2 H2O2 ------------- > 2Ho2 + o2
La prueba es de vital importancia en la diferencia de los estreptococos
(catalasa negativa ) de los estafilicocos (catalasa positiva )
MATERIALES
Cepas Control : S aureus , Streptococus o Enterococcus
Solucion de Peroxido de hidrogeno (h2O2) al 3 %
Medio de cultivo :cualquier medio solido no hibrido y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen actividad de catalasa , por lo que su precensia puede dar
resultados falsos positivos
PRUEBA DE LÁMINA
a) Con e asa bacteriológica en punta o un aplicador esteril , picar el centro
de una colonia bien aislada y transferir el inoculo a un portaobjetos limpios
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forma burbujas o no inmediatamente después que se
añade el reactivo
d) Descartar la lamina en un recipiente con desinfectante
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lamina no debe invertirse cuando se use asa

de platino , ya que puede resultar falso positivo . E ¡l alambre de
nichhrone no interfiere en el resultado de la prueba
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18 – 24 horas , cultivos mas
viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción
falsa negativa
3. El H2O2 es extremadamente acústico , por lo que se debe evitar que
toque la piel , en caso que ocurra inundar el área afectada con alcohol
70% para neutralizar a acción . NO DEBE USARSE AGUA
INTERPRETACIÓN
Prueba cualitativa: la aparición rápida y prolongada de burbujas , de gas o
efervescente son indicativas de catalasa positiva . Algunas bacterias poseen
enzimas diferentes a la catalasa positiva
CUESTIONARIO
45
ESQUEMATICE TODAS LAS OBSERVACIONES SIMPLES DIFERENCIALES

Y OTROS QUE HA OBSERVADO
PRACTICA Nº 7
OBSERVACION E IDENTIFICACION DE HONGOS MOHOSOS Y
LEVADURIFORMES
OBJETIVOS
46
 Observar la micro y macro morfología de los hongos (mohos y levaduras ,

órganos de reproducción )
GENERALIDADES
Los hongos son microorganismos eucariotas y se presentan en la naturaleza en forma
de mohos, levaduras, artrosporas y hongos mucilaginosos; se desarrollan en medio de
cultivo que tienen azucares a diferentes concentraciones. Su identificación se basa en
criterios morfológicos y fisiológicos. Los mohos tienen crecimiento aéreo y tiene los
siguientes órganos de fructificación son por Blastospora, Clamidospora, Pseudohifas.
Materiales
Agar sabouraud
Cepas de: Candida spp. Penicilium spp. Arpergillus spp.
Observaciones a realizar:
1. Observar el aspecto macro y micro morfológico de las columnas de la especie
de hongos contaminados, diferenciando sus órganos de reproducción.
CUESTIONARIO
1. Dibuje las diferentes formas de hongos
47
B. OBSERVACIONDE LEVADURAS.
INTRODUCCIÓN.
Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de reproducirse asexualmente por
gemación o fisión. Algunas especies pueden formar micelio, y la mayoría de ellas
fermentan uno o varios azucares. Su identificación se basa en criterios morfológicos y
fisiológicos. En esta práctica nos centraremos en la identificación de levaduras siguiendo
pruebas morfológicas lo que nos permitirá aproximarnos al género al que pertenecen
48
teniendo en cuenta que la identificación definitiva se hace en base a pruebas

bioquímicas.
OBJETIVOS.
1. Observar colonias de diferentes especies de levaduras.
2. Poner de manifiesto las principales características microscópicas de las
levaduras, tales como presencia de Micelio, Blastosporas Y Clamidosporas.
Material necesario.
1. Cultivos puros en agar sabouraud de:
Candida albicans
Candida pseudotropicalis.
Saccharomyces cerevisiae
Procedimiento:
1. Observar el aspecto de las colonias de las especies de levaduras.
2. Inocular las placas de agar Sabouraud. A partir de los cultivos puros se inoculan
las dos levaduras en una misma placa de Sabouraud.
3. Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio y con el asa de siembra
previamente flameada transferir una pequeña cantidad de cultivo en medio
solido a la gota. Remover hasta formar una suspensión homogénea. Colocar un
cubreobjetos.
4. Observación microscópica de los cultivos. Se empleará el objetivo de 10X y 40
X.
49
PRACTICA N° 8
OBSERVACION DE PARASITOS Y VIRUS
A. OBSERVACION DE PARASITOS
OBJETIVOS
50
 Observar la macro y micro morfológica de las diferentes fases de los parásitos.
Generalidades.
Los parásitos son microorganismos que las podemos observar en sus diferentes fases
como son protozoarios y las fases de larva quiste y parasito propiamente dicho.
Materiales
Material Biológico
Huevos, quistes y parásitos.
1. Observar el aspecto de las diferentes fases de los huevos, quiste y parásitos.
CUESTIONARIO.
2. Dibuje las observaciones, colocando sus partes.
51
B. OBSERVACIÓN DE VIRUS
OBJETIVOS
 Observar las diferentes formas de observación de los virus.

 Dibujar las observaciones.
Generalidades:
52
Los virus son parásitos intracelulares obligados, por lo tanto no se puede observar a
simple vista, pero si las reacciones producidas, y las reacciones se puede observar un
vitro en microcasets.
Complete........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
.........................................................................................................................................................
................
Materiales:
Muestras de suero humano libre de hemolisis.
Micro cubetas para observación de HIV y HBsAg.
-Dibuje las diferentes reacciones de micro Elisa.
-Investigue y describa
las formas de observar a
los virus.
.......................................
..................................
-Esquematice la
replicación viral del
virus inmunodeficiencia
humana.
Investigue y describa las formas de observar a los virus.

............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
53
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
........................................
Esquematice la replicación viral del virus inmunodeficiencia humana.
PRACTICA Nº9
CONTROL DE MICROORGANISMOS POR AGENTES FISICOS, QUIMICOS Y

QUIMIOTERAPEUTICOS
OBJETIVOS
1. Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar la susceptibilidad
a los antibióticos, con el objetivo de estudiar que son los antibióticos y como se
54
realiza la valoración de la actividad antimicrobiana de un compuesto químico

(antibiótico) mediante la técnica de Kirby-Bauer
Generalidades.
Los agentes quimioterapéuticos son sustancias química utilizadas para el tratamiento

de enfermedades infecciosas (quimioterapia) o para la prevención de enfermedades
(Quimioprofilaxis).
Estas sustancias se obtienen de los microorganismos o de las plantas y pueden ser
sintetizados en un laboratorio de bioquímica. En general, las sustancias químicas que
existen naturalmente se distinguen de los compuestos sintéticos con el nombre de
antibióticos, Para que una sustancia química uso como agente quimioterapéutico, debe
tener toxicidad selectiva, es decir, que debe inhibir o matar un organismo infeccioso
pero causar poco o ningún daño a las células del hospedador y permanecer ahí por un
tiempo determinado mientras cumple su acción. Los antibióticos son sustancias o
metabolismos secundarios secretados por algunos microorganismos durante el final de
la etapa decrecimiento de estos microorganismos. Estas sustancias tienen amplio poder
bactericida ya que sirven como medio de selección natural y por ende de competencia
de estos microorganismos contra otros. El principal antibiótico usado es la Penicilina y
sus derivados. El modo de acción de los antibióticos depende de su origen, así por
ejemplo tenemos:
 Penicilina y sus derivados B-lactámicos: Producidos por hongos Penicillium

notarum y Penicillium chrysogenum, o en laboratorio (semisintéticas) y su modo
de acción es inhibir la formación de la pared celular bacteriana, impidiendo la
incorporación del ácido N-acetil murámico en bacterias que están en crecimiento
activo, las bacterias mueren por lisis celular, se pierde el flujo citoplasmático y
las membranas quedan vacías. Son fuertemente bactericidas.
 Cefaosporinas: Producidas por hongos marinos como el Cephalosporium
acremonium. Su característica antibacteriana es similar a las anteriores ya que
inhibe la síntesis de pared celular de bactericidas.
 Estreptomicia: Producida por una bacteria del suelo, el Streptomyces griseus y
su pared antimicrobiana está en su combinación y distorsión de las subunidades
de los ribosomas, interfiriendo así con la síntesis de proteína
 Tetraciclinas: Producidas por especies de Streptomyces y actúan bloqueando la
unión del sitio específico sobre el ribosoma durante el alargamiento de la cadena
peptídica. Esta inhibe la síntesis de proteínas.
Existen otras muchas variedades de antibióticos y agentes quimioterapéuticos
sintéticos, semisintéticos que tiene amplio espectro de acción y son útiles para combatir
enfermedades por bacterias, hongos y virus.
Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad

antibacteriana, antibiótica y quimioterapéutica
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:

Métodos de dilución
Métodos de Difusión en Agar
DILUCIÓN EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo la
concentración inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe
el crecimiento “in vitro” bacteriano. Consiste en la preparación de una serie de diluciones
del antibiótico estudiado en caldo o en medio agar al cual se inocula luego una
55
suspensión del germen.

DIFUCION EN AGAR (Según Kirby-Bauer y col.) Es un método simple de rutina en
Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o quimioterápicos más adecuado
en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la muestra en
estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel
filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24 horas, se
observan las zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad de
antibiótico presente en el disco difiere para los distintos fármacos.
MATERIALES
Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya
Tubos con caldo nutritivo
Tubos con Agar semisólido
Tubos con cultivo bacteriano
Asas de siembra
Torundas estériles
Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi-disck)
Pinzas
Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los
diferentes antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos
debe ser de 20 mm.
4. Incubar a 37°C durante 24 horas.
LECTUR
a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano
alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco.
b) Compartir con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenida y determinar si
el microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes
antimicrobianos utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero
puede responder a dosis altas del antibiótico.
La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración de su
capacidad de difusión en el Agar.
I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES
1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y
someter al calor hasta su completa dilución. Luego tomar el pH con el papel indicador.
Si el medio es acido agregar gota a gota la solución de NaOH; si el medio es alcalino
agregar gota a gota solución de HCI hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar a
56
la autoclave a 121°C por 15 Minutos. Controlar la esterilidad incubando a 37°C por r24
horas. Luego dejar en refrigeración hasta su utilización.
2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 10 ml de agua destilada tibia,
luego agregar los demás ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de
NaOH o HCl. Luego envasar y esterilizar a 121°C por 15 Minutos y controlar la esterilizad
por incubación a 37°C por 24 horas. Dejar luego en refrigeración hasta su utilización.
II. MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego
dejar enfriar hasta una temperatura de 45°C y adicionar 5ml de sangre citratada o
desfibrinada. Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado
y distribuir en Placas Petri estériles; dejar luego solidificar y realizar el control de
esterilidad. Mantenerlo en refrigeración hasta su utilización. El color normal del medio
debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura
de 80°C hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estériles y
realizar control de esterilidad y dejarlo después en refrigeración.
III. MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml de agua destilada, someter
al calor hasta su completa disolución. Repartir luego en Placas estériles. No necesita
auto clavar.
Medios de cultivo selectivos. Este es un medio nutritivo al que se le añaden productos
que actúan como agentes inhibitorios, de tal manera que solo permiten el crecimiento
de cierto grupo de microorganismos. Se usan para aislar organismos particulares e
inhibir el crecimiento de los no deseados.
Agar de MacConkey el cual contiene una mezcla de sales biliares que inhiben a los
microorganismos Gram positivos, además de la lactosa y como indicador rojo de fenol
para distinguir las bacterias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen.
Agar EMB (Eosina azul de metileno) mediante el azul de metileno y la eosina inhibe los
organismos Gram positivos. Al mismo tiempo, al igual que el Agar MacConkey, permite
diferenciar bacterias que fermentan la lactosa y/o a la sacarosa de las que no lo hacen.
El Agar de sal y manitol, por su alto contenido de NaCl (7,5%) inhibe a las bacterias que
no lo toleran, al mismo tiempo con el indicador rojo de fenol sirve para detectar la
fermentación del manitol. Se utiliza para el aislamiento y diferenciación del genero
Staphylococcus.
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azucares); disolver el medio en 100 ml de agua
destilada, hervir hasta su completa disolución. Distribuir en tubos de 13x100mm y
esterilizar en autoclave a 121°C por 15 Minutos. Luego de autoclave colocar los tubos
en plano inlinado. El medio final tendrá un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendrá
un color verde.
57
3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa
disolución y autoclavar. Después adicionar 5ml de Solución de Urea al 40%esterilizara
por filtración.
4. Para el Cldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos
de 13x10mm y autoclavar a 121°C por 15 Min.
5. Agar Lisina Hierro; disolver en agua destilada por calor hasta su completa disolución
y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121°C por 15 minutos, y dejar
enfriar los tubos en plano inclinado.
RESULTADOS
Dibuje todas las observaciones, describa su diagnóstico presuntivo, no cambie de

colores y describa un análisis crítico de los resultados observados.
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………
58
PRACTICA Nº1 PRACTICA Nº2
EXAMEN I:
ASISTENCIA:
PROMEDIO FINAL:
ASISTENCIA:
ASISTENCIA DE PRÁCTICAS
EXAMENES: 4 evaluaciones practicas
1. 1ro. Practicas 1,2,3,4,5

2. 2do practicas 6,7,8,9,10
59
Recomendaciones:
 Los informes a prácticas son válidas siempre que el alumno haya asistido a
las practicas
 Las prácticas son evaluadas en forma permanente y de forma sumatoria
según la escala del formato de evaluación
 Los informes deberán ser entregados al ingresar a las evaluaciones
prácticas, no hay justificación alguna que se pueda excepcionar salvo
enfermedad o sepelio, previa documentación.
BIBLIOGRAFIA
 Diaz, C. Gamazo I. López-Goñi. Manual práctico de microbiología. 2ª edición.
MASSON. Barcelona (España). 1999.215 pg.
 Brook Th. 1999. Biología de los Microorganismos. 8ª. Mac Graw Hill.
 Ortega G. V., Galvis C. G. Manual de Microbiología. UIS. 1985.
 Escobar M. R. Fundamentos de Microbiología. Ed. CEJA. 1998. Bogota.235
 Rotger Anglada.- (1998) Microbiología Sanitaria. Edit. Síntesis. España.
 UNIVALLE. 2002 Merk. Alemania 1994 Manual de Medios de cultivo
 ISO/IEC 17025 (ES) Norma internacional
 Norma internacional NORMA INTERNACIONAL ISO 6999-1:1999 Microbiología
de alimentos y forraje animal método horizontal para la numeración de
Staphylococos coagualasa positiva (staphylococos aureus y otras especies)
parte 1 Usando la técnica del medio Agar Baird Parker
 Mendo Rubio M. (1995). Medios de cultivo en Microbiología. Cuarta Edición
Ediciones laborales Avda Petituars 1377 Lima Perú
 Gonzales a. (2014) Microbiología genera, Edit Titicaca, UNA-PUNO
60

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Microbiología General.

- Facultad de ciencias biológicas –UNA Puno

BIOSEGURAD E IDENTIFICACION DE MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN

5. Esquematice las señales de bioseguridad.

B.- IDENTIFICACION DE MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN

 Que el alumno conozca las áreas de un laboratorio de microbiología los equipos,

Material de laboratorio de Microbiología: 1, placas de Petri con medio de cultivo sólido;2,

1. DESCRIBA QUE FUNCION TIENE TODOS LOS COMPONENTES DEL

2. DESCRIBA LAS RECOMENDACIONES PARA UNA ADECUADA

3.- DIBUJE TODOS LOS EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS, MEDIOS DE

2. Conocer el efecto de las condiciones de la asepsia en el control de la

C) Calor Directo.-Se utiliza en asas bacteriológicas y aguas de inolocuación. La

ESTERILIZACION CON CALOR SECO

c) TECNICA DE ESTERILIZACION CON CALOR DIRECTO

Se utiliza para asas bacteriológicas y agujas de Inoculación.

CUESTIONARIO.- RESPONDA BREVEMENTE

1.- En que se fundamenta la esterilización al

2.-Investigue que se esteriliza con las radiaciones ionizantes?

3.-Que componentes tiene el hipoclorito de

4.-Dibuje un autoclave colocando sus partes y funciones:

Esquematice colorantes observados y utilizados

C.- COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN O CIEMSA

 Frotis de sangre con Leishman

Describa el fundamento de la coloración Gram a comparación Zihel Neelsen:

B.- MORFOLOGIA BACTERIANA

M ATERIAL, EQUlPO, REACTIVOS Y CEPAS M ICROBIANAS POR EQUIPO

LA SIEMBRA.- es la operación que consiste en colocar los gérmenes en un

¿Qué significa realizar una buena siembra bacteriana?

A.- CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO

Fase de latencia: es el tiempo que tarda una bacteria determinada en adaptarse al

Medida de crecimiento bacteriano: Los métodos más utilizados son dos: la

A que se denomina microorganismos viables a diferencia de microorganismos en

B. MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS.

SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulosa, plegada.

SEDIMENTO: DEPOSITO DE CELULAS EN EL FONDO DEL TUBO QUE SE

CRECIMIENTO EN CALDO NUTRITIVO

CRECIMIENTO EN MEDIO SEMISOLIDO

A.- CULTIVO PURO O AXENICO y METABOLISMO BACTERIANO

Entre las pruebas bioquímicas más comunes tenemos:

Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: al fermentar algunos

Acción sobre los carbohidratos

fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO 2 e H+) se manifiesta por

a) Reacciones de oxidación-fermentación de azucares:

Agar de hierro y lisina (LIA).- la utilización de este medio de cultivo se

de bromocresol, el cual en acides vira al color amarillo y el alcalinidad del color

Medio MIO (movilidad, indol y ornitina).-

Pruebas bioquímicas para la identificación de enzimas: el objetivo de estas pruebas

obligadas no contienen tales sistemas. El ensayo de citocromo oxidasa permite

interpretación de la prueba es positiva si el reactivo cambia de color amarillo a

OTRAS PRUEBAS BIOQUIMICAS USUALES:

 UTILIZACION DEL CITRATO: el principio de prueba de utilización del citrato es

Cepa control citrato positivo y negativo.

Pruebas de motilidad: esta prueba se realiza en medios semisólidos o con bajas

La catalasa convierte el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno de acuerdo a la

Cepas control: S. aureus, Streptococcus o enterococcus

Si hay un indicador de H S en el medio : el sulfato ferroso , citrato férrico , sulfato

Otras pruebas bioquímicas usuales :

La catalasa convierte el peróxido de hidrogen en agua y oxigeno de acuerdo

1. El orden de la prueba en lamina no debe invertirse cuando se use asa

ESQUEMATICE TODAS LAS OBSERVACIONES SIMPLES DIFERENCIALES

 Observar la micro y macro morfología de los hongos (mohos y levaduras ,

teniendo en cuenta que la identificación definitiva se hace en base a pruebas

 Observar la macro y micro morfológica de las diferentes fases de los parásitos.