Homogeneización de Tejidos Vegetales y Técnicas de Extracción de

Compuestos Biológicos

Luis Valledor
Dpto. BOS. Área de Fisiología Vegetal
Despacho 341
valledorluis@uniovi.es

Homogeneización y extracción.

Principio básico: “Queremos extraer de un tejido o conjunto de células una o

varias moléculas para su posterior análisis”. Por lo tanto el proceso de
extracción deberá permitirnos obtener la mayor cantidad de moléculas, con la
mayor pureza posible, a la vez que preservamos su integridad estructural y, si
es requerida, funcional.

1. ¿Con qué tipo de tejidos vamos a trabajar? ¿Qué tipo de molécula vamos a querer
purificar? ¿Dónde se localiza?
2. ¿En que tipos de soluciones es soluble esta molécula?¿Cuán estable es? ¿Existen en la
célula vegetal otros compuestos que puedan interferir?
¿Necesito mantener su actividad biológica?

¿Cuáles son las alternativas de homogeneización disponibles?

¿Qué es el fraccionamiento celular?
¿Qué es una solución de extracción? ¿Qué compuestos lleva? ¿Cómo funciona?
Esquema general:

1. Tipos de biomóleculas
2. Particularidades de los tejidos vegetales
3. Métodos de homogeneización más habituales en Biología Vegetal:
1. Pulverización en mortero
2. Molienda
3. Politrón
4. Ultrasonidos
4. Fraccionamiento celular
5. Composición de una solución de extracción:
1. Solventes
2. Tampones
3. Detergentes
4. Sales caotrópicas y otros agentes desnaturalizantes
5. Enzimas e inhibidores
6. Antioxidantes y otros compuestos
7. Composiciones de soluciones de extracción habituales
6. Ejemplos de extracciones clásicas:
1. Extracción de ADN
2. Extracción de proteínas
3. Extracción de metabolitos
7. Extracción en fase sólida
8. Extracción múltiple

¿Qué tipo de biomoléculas podemos querer purificar?

Metabolitos
-Primarios* (i.e. almidón, celulosa, aminoácidos, ácidos orgánicos,…)
-Secundarios (i.e. alcaloides, terpenoides, esteroles, fenoles, …)
*tanto ácidos nucleicos como proteínas son metabolitos primarios, pero históricamente se estudian por separado

Ácidos nucleicos
-DNA (genómico, plastídico, mitocondrial)
-RNA (mensajero, ribosómico, reguladores)
Proteínas
-Totales
-Específicas de un orgánulo (i.e. de pared, nucleares, cloroplásticas)
-Recuperar una actividad enzimática específica, complejos de proteínas, …

Otras moléculas
-Determinar composición fundamental (C,N,O,S,P, etc.)
-Determinar valores fisiológicos (pH intracelular, potenciales, Red-Ox,…)
-Y muchos más…
Cada biomolécula es químicamente diferente. ¿Qué implica esto?
Particularidades de los tejidos vegetales

En general las extracciones vegetales pueden considerarse

difíciles debido a: Azucar
• La dureza de sus tejidos Homogeneización
• La presencia de pigmentos, oxidantes
• La presencia de azúcares Soluciones y
• Gran cantidad de enzimas líticas protocolo de
en el peroxisoma y pequeñas vacuolas extracción
liberadas durante la extracción

Resinas
Presencia de compuestos fenólicos y
otros pigmentos muy difíciles de
La pared celular puede llegar a ser muy dura eliminar.

Breve repaso a las técnicas más empleadas en biología vegetal

HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
Pulverización de muestras en mortero

Las muestras se trituran en un baño de Nitrógeno líquido (-196 C). La baja

temperatura cristaliza las muestras, lo que permite su pulverización.

La baja temperatura bloquea cualquier actividad enzimática, evitando la degradación

de las muestras si bien pueden desnaturalizarse (levemente) algunas proteínas.

Paso estándar en la extracción de biomoléculas con fines ómicos.

Breve repaso a las técnicas más empleadas en biología vegetal

HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
Molienda con partículas

Rotura basada en el impacto con bolas metálicas o de vidrio. Este sistema se puede emplear para
pulverizar muestras, previamente congeladas en N2 líquido o para extraer compuestos en una
solución de extracción.

La agitación produce un calentamiento de las muestras. Generalmente hay que enfriarlas cada 8-10
segundos de molienda.

Muy útil para romper tejidos vegetales duros (madera, raíz, algunos tipos de yemas) o células
vegetales con pared gruesa.

Breve repaso a las técnicas más empleadas en biología vegetal

HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
Politrones – Sistemas rotor-estator
El sistema consiste en un rotor que gira a alta velocidad dentro de un
cilindro fijo perforado (estator). Estas perforaciones permiten el flujo de
muestra a través del homogeneizador.

Puede controlarse la velocidad de giro del rotor empleandose

velocidades altas para la total ruptura celular y velocidades mas bajas
para preservar orgánulos.

Muy útil en tejidos vegetales no muy duros.

Breve repaso a las técnicas más empleadas en biología vegetal

HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
Prensa de French
El sistema consiste en una célula de presión formada por un
cilindro y un émbolo de acero, una prensa hidráulica, y un
pequeño orificio acoplado a una llave o válvula.

Las células explotan debido a los cambios de

presión que se producen al abrir la llave.

Se utiliza en cultivos de microalgas,

protoplastos, o células. No es útil para tejidos.

Breve repaso a las técnicas más empleadas en biología vegetal

HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA, SOLUBILIZACIÓN, LIMPIEZA

Baños y sondas de ultrasonidos
Aplicación de ultrasonidos a suspensiones celulares, de orgánulos, o
incluso de fracciones (i.e. tilacoides).

Se puede aplicar a volúmenes variables de muestra (5µL-1L), en función

del empleo de un baño o de una sonda.

Genera mucho calor, las muestras deben refrigerarse frecuentemente.

Ejemplos de otros usos:

Solubilización y limpieza de proteínas.
Fraccionamiento inespecífico de ácidos nucleicos.

Tipos de sondas
Efecto de la sonicación
Breve repaso a las técnicas más empleadas en biología vegetal

¿Qué método de homogeneización emplearías para…?

Cultivo de microalgas Hojas de Arabidopsis Madera

Fraccionamiento celular

Por fraccionamiento celular se entienden una serie de técnicas basadas en la

ruptura de las células y la separación sus orgánulos unos de otros.

Este fraccionamiento puede ser total (recuperamos todos los orgánulos en

distintas fracciones) o parcial (recuperamos solo aquellos que nos interese
analizar). En función del tipo de recuperación deseada se emplearán unos u otros
métodos. 1000 g
(1000 veces la
fuerza de gravedad)
10 min!
Centrifugación diferencial Sobrenadante transferido
al siguiente tubo!

20,000 g
Tejido Homogeneización Homogeneizado 20 min!

80,000 g
60 min!
Pellet rico en
Núcleos y restos
celulares!
150,000 g
3 hr!

Pellet rico en
mitocondrias y
cloroplastos

Pellet rico en
Centrifugación microsomas,
vacuolas,
diferencial peroxisomas!

Pellet rico en
ribosomas!

Fraccionamiento celular
Si queremos recuperar un solo tipo de orgánulos la estrategia es más sencilla.
Ejemplo de extracción de núcleos:

1º Se homogeneizan las células

a intensidad baja. Solo queremos romper
membrana celular y pared.

3º El empleo de un gradiente
de densidad nos permitirá
separar nuestros núcleos de
los contaminantes que aun
queden en la muestra

Núcleos

2º Una vez homogeneizado,

añadimos detergente, a una
concentración que va a romper
cloroplastos y mitocondrias, pero
no núcleos.
Tras varios lavados obtendremos
una fracción nuclear más o menos
limpia.
Fraccionamiento celular: Gradiente de densidad
Esta estrategia se basa en la creación de un gradiente empleando un densificante
(sacarosa, ficoll, percoll,…) el cual se define superponiendo capas a concentración
decreciente. Por ejemplo un gradiente de sacarosa puede consistir en una capa al 70%, otra
al 30% y otra al 10% (esto varía en función del orgánulo o molécula a purificar).

La muestra se coloca en la parte superior del gradiente, y se centrifuga a elevadas rpm. Las
particulas atravesarán el gradiente hasta que alcanzan un punto en que su densidad se
corresponde con la capa que los rodea (o esta es menor que la siguiente capa). La fraccion
podrá ser purificada y analizada.

Percoll

Percoll

Fraccionamiento celular

¿Cómo puede afectar el protocolo de homogeneización al fraccionamiento celular?

¿Cómo puede afectar el tampón de homogeneización al fraccionamiento celular?

Distintas etapas de la purificación nuclear. Los núcleos están marcados con DAPI (color azul)
Solución de extracción

La solución de extracción ha de permitir una correcta solubilización de la partícula

problema, a la vez que la preserva de cualquier tipo de alteración que pudiese
ocurrir durante el proceso extractivo (i.e. oxidaciones, digestiones, rupturas,…).
Principales componentes de las soluciones de extracción:
1. Solvente (agua, metanol, cloroformo, diclorometano, acetonitrilo…)
2. Tampón (cada molécula requerirá un rango de pH específico para ser estable)
3. Detergentes (necesarios para la correcta solubilización de proteínas y membranas)
4. Antioxidantes (DTT, Beta-mercaptoetanol,…)
5. Quelantes (EDTA, EGTA,… capturan iones metálicos bivalentes. Protegen ácidos nucleicos al
inactivar las nucleasas mediante la captura de su cofactor.)
7. Sal (NaCl, KCl, necesaria para la precipitación de ácidos nucleicos)
6. Sal caotrópica (sales de guanidina, urea, tiourea. Desorganizan la red tridimensional del
agua que rodea a las macromoléculas, afectando las interacciones no covalentes
y ayudando a solubilizar proteínas y ác. nucleicos. Permite los puentes salinos)
7. PVP o PVPP (requerido para secuestrar y eliminar polifenoles y otros pigmentos)
8. Inhibidores específicos (inhibidores de nucleasas, fosfatasas, proteasas, etc.)
Obviamente los componentes de la solución de extracción
deberán ajustarse a la situación experimental específica.

Solventes

El solvente universal para la mayor parte de las extracciones es el agua. No

obstante en determinadas situaciones se deberán emplear otro tipo de solventes:

Solventes orgánicos no-polares:

Cloroformo <- desnaturalizante, extracción de metabolitos secundarios
Hexano <- extracción de lípidos

Solventes orgánicos polares próticos

Acetona <-extracción de met. Secundarios, precipitación de proteínas
Acetato de etilo <- extracción de metabolitos secundarios
Acetonitrilo <- solubilización de proteínas, metabolitos secundarios
DMSO <-solubilización

Solventes orgánicos polares no-próticos (extracciones de metabolitos,

proteínas, y ácidos nucleicos)
Etanol
Metanol
Propanol
Isopropanol
Tampones

El mantenimiento del pH durante el proceso de la extracción puede ser crítico, por lo que el
empleo de tampones es recomendable. La elección de tampón dependerá del rango de pH
que queramos mantener, así como de su compatibilidad con nuestro protocolo de
extracción.

Detergentes

Los detergentes son moléculas anfipáticas. Sus grupos polares forman puentes de
hidrógeno con el agua, y sus partes apolares interacciones hidrofóbicas. En consecuencia
ayudan a solubilizar (membranas, proteínas,…). Además, al reducir la tensión superficial del
agua actúan como surfactantes.

Clasificación:
Detergentes Iónicos (aniónicos, catiónicos). SDS, detergente aniónico, desnaturalizante
CTAB, detergente cationico.
SDS

Detergentes No iónicos (Triton X100, NP40), ambos son no-desnaturalizantes

Triton X100

Detergentes zwitteriónicos (i.e. CHAPS, CHAPSO), también son no desnaturalizantes

CHAPS

Sales biliares (i.e. Ác. Desoxicólico): aislamiento de membranas,

proteínas de membranas, etc.

Ac. Desoxicólico
Sales caotrópicas y otros agentes desnaturalizantes

La desnaturalización es un proceso por el cual las proteínas y ácidos nucleicos pierden su

estructura funcional (cuaternaria, terciaria). Implica la ruptura de enlaces covalentes
(puentes disulfuro), enlaces no covalentes dipolo-dipolo, y fuerzas de Van der Waals.

Las sales caotrópicas son compuestos que desorganizan la red tridimensional del agua, a
través de los puentes de hidrógeno, afectando a su interacción con otras macromoléculas.
También afectan a otras uniones intramoleculares no covalentes.

Compuestos caotrópicos Urea

• Urea
GuanHCl
• Sales de guanidinio (Cloruro, Tiocianato)

Compuestos reductores (DTT, 2-mercaptoetanol)

Detergentes (SDS)

Algunos ácidos, compuestos alcalinos o solventes orgánicos también

pueden ejercer de agentes desnaturalizantes.

Enzimas e inhibidores

La adición de determinados tipos de enzimas a la solución de extracción podrá mejorar el

rendimiento final de la misma.
Proteasas (Proteinasa K, tripsina)
Digestión de pared (celulasa, macerozima)
Ácidos nucleicos (RNasa, DNasa)

Del mismo modo podremos emplear inhibidores específicos cuando deseemos proteger
una biomolécula específica. Empleando inhibidores de RNasas, de Proteasas, de fosfatasas,
etc.

Uno de los inhibidores mas empleados en la extracción de ácidos nucleicos es el EDTA. Este
compuesto es un quelante, es decir, va a unirse a cationes metálicos bivalentes. Estos
cationes son cofactores de las nucleasas. Al retirar del medio a los cofactores, la actividad
de las nucleasas se reduce.
Antioxidantes y otros compuestos

Los antioxidantes van a prevenir la oxidación de las muestras debido a su alta capacidad reductora.
Esto es especialmente importante en muestras vegetales, puesto que algunos pigmentos tienen
tendencia a unirse de forma covalente a ácidos nucleicos y proteínas.

Los antioxidantes más comúnmente empleados son el 2-mercaptoetanol y el Ditiotreitol (DTT).

Concentraciones altas desnaturalizarán las

proteínas, pero a baja concentración
preservarán la oxidación de residuos sulfidrilo.

A la solución de extracción se le podrán añadir sales (>3M NaCl reduce la solubilización de

azúcares). El cloruro de litio se emplea para precipitar el RNA o en gradientes de densidad.
Otros compuestos pueden ser necesarios para la estabilidad de moléculas particulares o para
mantener la actividad enzimática (i.e. Espermidina como estabilizante del ARN).

Soluciones de extracción clásicas

Tampón de extracción de ADN

2% (p/v) CTAB, 3 M NaCl, 50 mM EDTA pH 8.0, 100mM Tris-HCl pH 8.0,
2% (p/v) PVP 40000, 8 mM ascorbic acid, 5mM DIECA.

Tampón de extracción de RNA

2% (p/v) CTAB, 2M NaCl, 25 mM EDTA pH 8.0, 100mM Tris-HCl pH 8.0,
2% (p/v) PVP 40000, 0.5 g/L espermidina.

Tampón de extracción de proteínas

100 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% SDS (p/v), 10% Glycerol (v/v), (2mM PMSF), 10 mM
DTT, 1.2% (v/v) Plant protease inhibitor cocktail (Sigma P9599).

Tampón de extracción de metabolitos

Cloroformo:metanol:agua (2.5:1:0.5 v/v)

Tampón de extracción de proteínas, actividades enzimáticas

250 mM HEPES pH 7.4, 25 mM CHAPS, 1 mM PEG 8000, 1 mM PMSF and 8%
(p/v) PVP 40000
Extracción dedicada, ejemplo de extracción de ADN

El objetivo de una extracción dedicada es la purificación de una molécula. Es decir,

obtener una fracción lo mas enriquecida posible. En caso de no obtener unos
mínimos, esta fracción podrá ser purificada mediante otras técnicas
(cromatográficas, electroforéticas, etc.)

Ruptura de ¡Bien!
Adición de
las células. En este momento
solución de tendremos DNA en
(Nitrógeno
extracción solución
líquido)

La solución de extracción contiene: Pero también

-Tampón – Estabiliza pH tendremos pigmentos,
-Detergente – Rompe membranas
-DTT – Antioxidante, evita fenolización proteínas, azúcares
-RNasa A – Elimina el RNA restos celulares
-EDTA – Quelante
-NaCl – Altas concentraciones de sal evitan parcialmt.
la solubilización de azúcares

Extracción dedicada, ejemplo de extracción de ADN

¿Qué alternativas tenemos para la purificación de nuestro ADN?

1. “Capturar” nuestro ADN de la solución.

2. Ir eliminando poco a poco otras moléculas hasta conservar
solamente el ADN.

¡Bien!
Adición de Lavado con En este momento
solución de fenol:clorofor tendremos DNA en
extracción omo:IAA solución, mucho más
limpio

Pero también
El empleo de fenol:cloroformo:IAA consigue que tendremos azúcares,
el ADN se mantenga en la fase acuosa, mientras que
sales y químicos de la
en la fase orgánica lavaremos los pigmentos, y las
proteínas que serán disueltas por el fenol o solución de extracción
desnaturalizadas por el cloroformo en ambos casos
son retiradas de la fase acuosa.
Extracción dedicada, ejemplo de extracción de ADN

¿Qué alternativas tenemos para la purificación de nuestro ADN?

1. “Capturar” nuestro ADN de la solución.

2. Ir eliminando poco a poco otras moléculas hasta conservar
solamente el ADN.
¡Bien!
DNA precipitado, sin sales
Fase acuosa Precipitación
Lavado pellet
conteniendo del ADN con
etanol 70º
ADN isopropanol

El empleo de isopropanol altera reduce la constante

dieléctrica de la solución. Este hecho junto a la
presencia de sales, causa la precipitación del ADN

Posibles residuos de azúcares

Extracción en fase sólida: Adsorción a sílice.

Las columnas de sílice permiten una rápida y eficiente purificación de ácidos nucleicos.
La solución de homogeneización ha de ser rica en sales, e incluir una sal caotrópica.
Esta sal, desestabiliza la capa de agua que recubre las macromoléculas, y permite que
los iones sodio interaccionen a la vez con el sílice y con el ácido nucleico, formando un
puente salino.

(etanol)

(agua)
Estrategia para la extracción combinada de biomoléculas
Cell homogenization
in extraction buffer

Supernatant Pellet
Polar/Non Polar Metabolites (DNA/RNA/Proteins)

Pellet Solubilization
Phase Separation

DNA Binding
Polar Metabolites Non-Polar Metabolites Total DNA
(silica column 1)

Large RNA Binding

Long RNA
(silica column 2)
Total RNA Binding
Total RNA
(silica column 2)
Small RNA Binding
Small RNA
(silica column 3)

Phenol extraction

Protein Precipitation

Total Proteins

Análisis de biomoléculas

Espectrofotometría
Electroforesis
Cromatografía
Espectrometría de masas